Summary
Burada, etkili bir hidroliz ve bir Ni-Schiff-baz kompleksi izole edilen bir amino asidin daha sonra Fmoc koruma sunmaktadır. asit-labil yan zincir koruma gruplarının tutma gerekli olduğunda burada sunulan Hidroliz koşulları kullanılmak üzere uygundur. Bu teknik, doğal olmayan amino asit çeşitli substratlar için adapte edilebilir.
Abstract
Doğal olmayan amino asitler, doğada yaygın şekilde görülmeyen yan zincir işlevsellikleri ihtiva eden bir amino asit, giderek sentetik peptid dizileri bulunur. Bazı doğal olmayan amino asitlerin sentezi genellikle nikel katyon ile stabilize edilmiş bir Schiff-baz içeren bir ön-madde kullanımını içerir. Doğal olmayan yan zincirler, bu Schiff-baz kompleksi içinde bulunan bir amino asit omurgası üzerinde monte edilebilir. Elde edilen doğal olmayan amino asit, daha sonra, tipik olarak kuvvetli asitli çözelti içinde geri akış kullanılarak, Schiff-baz bu kompleks ile hidrolizi ile izole edilebilir. doğal olmayan amino asitler mikrodalga destekli bir katı-faz peptid sentezi kullanılmak için bu yüksek derecede asidik koşullar asit kararsız yan zincir koruma grupları, gerekli kaldırabilir. Bu çalışmada, etkin bir hidroliz ve bir Ni-Schiff baz kompleksine izole edilen bir amino asidin daha sonra Fmoc koruma sunmaktadır. Bu çalışmada sunulan Hidroliz koşulları asit-labil s tutma için uygun olanide-zincir koruma gruplarını ve doğal olmayan amino asit çeşitli substratlar için adapte edilebilir.
Introduction
Doğada bulunan yirmi doğal olarak meydana gelen amino asitler aşağıdaki farklı doğal olmayan amino asitler (UAA) 'ın yatak yan zincirleri geniş bir uygulama aralığı içinde faydalı oldukları bulunmuştur. Bu, UAA 's sentezi, ancak, yan zincirlerin yapı ve amino asit omurgasına stereokimyasına bağlı olarak zor olabilir. Bir nikel Schiff baz kompleksine bağlamında glisin CH bond aktivasyon a, β-diamino asitler 1 ve 2 ya da heterosiklik yan zincirler fluorinatlı UAA en yatak içeren amino asit türevlerinin çeşitli üretmek için kullanılmıştır. 3
Doğal olmayan yan zincirler eklenmesinden sonra, UAA en tipik haliyle hidroklorik asit 4 geri akış ile Schiff baz kompleksine çıkarılır ve daha sonra iyon değişimi kromatografisi kullanılarak izole edilir işlevselleştirilmiş. genellikle verimli olsa da, bu protokol bir üretirKatı faz peptit sentezi ile (SPPS) içinde kullanım için uygun olabilir amino asitlik. SPPS doğası bozulmamış bu koruyucu gruplarla UAA en izolasyonunu önler asit-labil yan zincir koruma gruplarının varlığını ve tipik Ni-Schiff bazı ayrışma koşulları güçlü asidik doğası gerektirir. Bildiğimiz kadarıyla, tek alternatif ayrıştırma yöntemi bildirilmiştir: etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve hidrazin kullanılması, yüksek sıcaklıklarda, kendilerini bazı yan zincir gibi ftalimitler gibi koruma grupları için uygun olmayabilir 5 koşullar, bu.
Şekil 1: Ni2 +, PBP ve Glisin (Giy) Ni PBP-Gly sentezi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Burada, Ni-PBP-Gly (Şekil 1), bir Ni-Schiff baz kompleksine hidrolizi için bir yöntem sunulmaktadır. Ni2 +, glisin ve piridin-2-karboksilik asit (2-benzoil-fenil) -amid (PBP), 6 türetilmiş Bu kompleks, UAA en çeşitli sentezi için yararlı bir platform olduğu gösterilmiştir ve kolay bir edilmiştir erişilebilen iki aşamalı bir sentetik yol kullanılarak. Bu kompleksin 7 sentezi literatürde-konmuşturlar yüksek verimde olan. 6 Sonuçlarımız, aşağıda tarif edilen UAA en taşıyan asit kararsız yan zincir koruma grupları ile kullanım için uygun olan nötr pH koşulları hafif asidik EDTA kullanılarak hidroliz şartları uygulanabilirliğini göstermektedir. Hidrolizi takiben, elde edilen sulu çözelti, izole edilebilir ve Fmoc-korumalı amino asit elde standart Fmoc koruma koşullarında (Şekil 2) hemen tabi tutuldu.
Şekil 2: Hidroliz ve Ni-PBP-Gly İzole bir şekilde bir Amino Asit Fmoc-koruma. Reaksiyon koşulları: i. EDTA (12 eşdeğer), pH 4.5; ii. pH 7'ye etil asetat yıkama ve ayarlanması; iii. Fmoc-OSu (1 eşdeğer), NaHCO 3 (2 eşdeğ) eklenir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ni-Schiff-baz Complex 1. Hidroliz
- Oda sıcaklığında 250 mL'lik tabanı yuvarlak bir şişeye karıştırılarak N, N-dimetilformamid (DMF), 40 mL Ni-PBP-Schiff-baz kompleksi 1 mmol eritin.
- 0.2 M sulu EDTA çözeltisi, pH 4.5, 60 mL ekleyin.
- Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanılarak ve plaka karıştırın, bir gece boyunca bir araya çözelti karıştırılır. Schiff-baz kompleksi hidrolize gibi, renk beyaz bir koyu kırmızı yönelecektir.
- herhangi bir kırmızı boyama yokluğu ile gösterildiği gibi reaksiyonun tamamlanmasından sonra, bir 250 ml ayırıcı bir huniye reaksiyon aktarın.
- 50 ml diklorometan ilave ayırıcı huni kapağı ve karıştırın. Bir atık behere organik yıkama boşaltın. PBP ve kalan Ni PBP-Schiff-baz kompleksi kaldırmak için bu işlem üç kez tekrarlayın. 250 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede kalan sulu tabakayı toplayın.
Hidrolize olan Amino Asit 2. Fmoc koruma
- çözeltiye 168 mg sodyum bikarbonat (2.00 mmol, 2 eşdeğer) ilave edin ve bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak karıştırıldı ve plaka karıştırın.
- 10 mL'lik bir şişe içinde dioksan çok az miktarda (yaklaşık 4 ya da 5 mL) içinde 337 mg Fmoc N-hidroksisüksinimit ester (1.00 mmol, 1 eşdeğer) içinde çözülür. Sulu çözeltiye Bu çözeltisini ve gece boyunca karıştırın.
- Reaksiyon, gece boyunca karışmaya bırakıldıktan sonra, 1 M hidroklorik asit ile pH 2'ye elde edilen çözeltiyi asitleştirmek. pH periyodik olarak pH test şeritleri kullanarak kontrol edin.
- 250 mL'lik bir ayırma hunisine aktarın ve reaksiyon 50 mL etil asetat ilave edin. , Ayrıcı bir huni kapağı iyice karıştırın ve 250 ml bir erlenmeyer şişesi içinde, organik faz toplanır. Organik özler birleştirerek, bu işlem iki kez daha tekrarlayın. Magnezyum Sülfat, kabaca 3 g Birleştirilen organik özler kurutulure.
- Ham Fmoc-korumalı amino asit elde etmek için bir dönen buharlaştıncı kullanarak Birleştirilen organik özler konsantre edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sert pH koşullarında gerek kalmadan Schiff-baz etkin bir sulu hidroliz izin verebilir Ni PBP-Gly kompleksinden Ni + 2 'nin bu kaldırılmasını hipotezini kurduk. EDTA, ucuz ve iyi incelenmiş şelatlayıcı madde olduğu için, 10 biz Ni PBP-Gly bir çözeltiye EDTA ilavesi ve böylece kompleksin hidrolizi teşvik Ni + 2 iyonlarının çelasyonunu kolaylaştırmak varsaydık.
tek başına EDTA etkili bir şekilde kompleks hidrolizi teşvik olabilir teorimizi test etmek için, pH 4.5, sulu çözelti, sulu EDTA disodyum tuzu çözeltisinin düzeltilmemiş pH EDTA eşdeğer artan oda sıcaklığında DMF içinde Ni-PBP-Gly bir çözelti tabi . Hidroliz reaksiyonunun ilerlemesi çözeltisi gözlemleyerek renk ile izlenebilir; PBP izole ederken reaksiyona girmeyen Ni-PBP-Giy çözeltide bir koyu kırmızı renk görüntülerBu kompleksinden beyazdır. Biz beyaz (Tablo 1) kırmızıdan solüsyonunun renk değişiminin izleyerek hidroliz reaksiyonun ilerlemesini takip etti. en az sekiz eşdeğer içeren reaksiyonlar, beyaz kırmızıdan renklendirme bazı geçiş göstermiştir fakat reaksiyonu, her bir durumda, eksik. Hiçbir renk değişimi EDTA olmadan koşulları için belirgindi.
hidroliz pH'nın etkisi benzer şekilde değerlendirildi. gece boyunca oda sıcaklığında pH değişen EDTA 12 eşdeğer hidroliz koşullarına Ni PBP-Gly kompleksinin olunması kompleksinin başarılı bir şekilde hidrolizi, 4.5 ile 7.5 arasında değişen pH koşulları altında meydana gelir göstermiştir. Bu EDTA hidroliz esnekliğini göstermektedir; pH değeri daha fazla aside duyarlı yan zincir koruyucu gruplar için hesap arttırılabilir.
| Şart | EDTA solüsyonu pH değeri | Gece Tamamlama | |
| 1 | 0 | 4.5 | Yok |
| 2 | 2 | 4.5 | Kısmi |
| 3 | 4 | 4.5 | Kısmi |
| 4 | 6 | 4.5 | Kısmi |
| 5 | 8 | 4.5 | Tam |
| 6 | 10 | 4.5 | Tam |
| 7 | 12 | 4.5 | Tam |
| 8 | 12 | 5.0 | Tam |
| 9 | 12 | 5.5 | Tam |
| 10 | 12 | 6 | Tam |
| 11 | 12 | 6.5 | Tam |
| 12 | 12 | 7 | Tam |
| 13 | 12 | 7.5 | Tam |
| 14 | 12 | 8 | Kısmi |
Tablo 1: Ni-PBP-Gly hidroliz koşullar.
Hidroliz en etkili koşul, 7 kullanılarak tamamlandığını doğrulamak için, reaksiyon, diklorometan ile üç kez özü çıkarıldı, birleştirildi ve organik tabakalar kurutuldu ve nükleer manyetik rezonans spektroskopi (NMR) kullanarak elde edilen kalıntı analiz edilmiştir. NMR spektrumu örnek Ni-PBP-Gly hiçbir kanıt göstermiştir spektrumda bulunan tek rezonanslar kompleksinin tam hidrolizi düşündüren, PBP literatürün eşleşti.
Bu amino asitler ile uygun hidroliz şartları fizibilite içeren incelenmiştirYan zincir koruma grupları, bir dizi ing. Numuneleri, Fmoc-L-glutamik asit 5-ters-butil ester (tBu, Fmoc-Glu () -OH), Fmoc-O - tert-bütil-L-treonin, Fmoc (tBu Fmoc-Thr () -OH), - O - tert-butil-L-tirosin (tBu Fmoc-Tyr () -OH), ve N (in) Boc- N α-Fmoc-L-triptofan (Fmoc-Trp (Boc) -OH) çözündürüldü DMF içinde ve pH 4.5 EDTA 12 eşdeğer kullanılarak oda sıcaklığında hidrolize tabi tutulmuştur. gece boyunca karışmaya bırakıldıktan sonra, çözelti diklorometan ile ekstre edilmiştir ve NMR ile analiz edildi. Temsili NMR, Fmoc-Glu (tBu) -OH (Şekil 3) yer almaktadır. Her bir durumda, spektral verileri yan zincir koruma gruplarının tam tutma gösterdi. 11, 12, 13
Şekil 3: Hidroliz koşullarına tabi tutularak sonra bir asit koruyucu gruptur kararsız yan zincir taşıyan bir Fmoc-monomer Örnek NMR.
asit-labil bir yan zincir koruma grubu, bir mavi kutu ile vurgulanır. Bileşiğin proton sinyalleri için yuvarlak bütünleşme değerleri parantez içinde verilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Hidroliz ve organik ekstre etmeden sonra, geriye kalan sulu tabaka boyunca kalıntı EDTA ve Ni2 + iyonları ile serbest amino asit içerir. Bu maddelerin mevcudiyeti, serbest amino asit, daha sonra Fmoc koruma müdahale olmaz sağlamak için, hidroliz giriş 7. Beyaz benzer konsantrasyonları ile EDTA ve Ni2 + iyonları içeren sulu çözeltiler içinde glisin eritilerek test reaksiyonu yerineE daha sonra, standart bir sulu Fmoc koruması için bu çözüm tabi tutuldu. 8 Reaksiyon tamamlandıktan ve çalışmanın ardından, Fmoc-korumalı glisin,% 25 verim elde edilmiştir reaksiyon belirlenmiştir. Bu yüzde verimi reaksiyonun seyreltik konsantrasyonu dikkate alındığında şaşırtıcı değildir ve Ni + 2 iyonları ve EDTA varlığı standart Fmoc koruma reaksiyonuna müdahale olmadığını göstermektedir.
metodolojimizde (hidroliz, serbest amino asit ayrılması, ve Fmoc koruma) her bir bileşenin mümkün olduğu destekleyen kanıtlar ile, Ni-PBP-Gly kullanarak bir kanıt-kavram deney gerçekleştirilmiştir. Yukarıda ve makul bir verimle bir Fmoc korumalı amino asit elde etmek için standart bir protokol 8 kullanılarak takip eden Fmoc koruma tarif edilen hidroliz koşullarında canlılığı değerlendirildi. Oda sıcaklığında 40 ml DMF içindeki bir Ni-PBP-Gly içinde karıştırılan bir çözeltisine (404 mg, 0.971 mmol, 1 denk)kısa süreli olarak, pH 4.5 (65 mL, 13 mmol, 13 eşdeğer), 0.2 M EDTA çözeltisi ilave edildi. Reaksiyon, gece boyunca karışmaya bırakıldı ve daha sonra etil asetat ile dört kez yıkanmıştır. Sulu tabaka daha sonra katı sodyum bikarbonat kullanılarak pH 7'ye ayarlandı. dioksan, minimum miktarda içinde çözülmüş, sulu tabaka ilave edildi, sodyum bikarbonat (163 mg, 1.93 mmol, 2 eşdeğer) ve Fmoc-OSu (0.971 mmol 327 mg, 1 eşdeğer) ilave edilmiştir. Reaksiyon, etil asetat ile bir gece boyunca ve daha sonra 1 M hidroklorik asit ile asitleştirildi ve üç kez ekstre karışmaya bırakıldı. Organik ekstraktlar birleştirildi, tuzlu su ile altı kez yıkandı, magnezyum sülfat ile kurutuldu, konsantre edildi, ve reaksiyona girmemiş Fmoc-OSu ve Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0.540 mmol,% 54 verim) bir karışımını vermek üzere vakum altında kurutulmuştur. Spektral veriler, daha önce spektrumunu yayınlanan karşılaştırılırlar Fmoc-Gly-OH vermiştir. 9 Bu son deney, Ni-PBP-Gly kompleks serbest glisin izole edilmesi ve bunun yerine Fmoc-prot ileriye taşımak mümkün olduğunu göstermektedirandırılmaktadır formu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tarif edilen protokol iki kritik adımları hafif pH koşulları ve bu izole edilmiş amino asidin daha sonra Fmoc koruma altında bir Ni-Schiff baz kompleksine bir amino asit omurgasına izole edilmesini kolaylaştırmak için yeteneği yararlıdır. İlk adım kompleksinden amino asidin salınmasını kolaylaştırmak için EDTA ihtiva eden bir DMF / su çözeltisi karıştırılarak içermektedir. Kalıntı, karmaşık ya da organik yan ürünler kolaylıkla ekstre ile temizlenebilir. Bu protokol, ikinci aşama, ilk aşamada özütleme ile izole edildikten sonra, sulu tabaka içinde bulunan amino asidin bir a-Fmoc koruması içerir. Bazı pH'a duyarlı yan zincir koruyucu gruplar için gerekli olabilir önemli bir esneklik sağlayan, 4.5-7.5 arası bir pH aralığında, bu prosedür değiştirme yeteneğini göstermiştir.
Bu tekniğin potansiyel bir sınırlama izole amino asidin, Fmoc koruma düşük reaksiyon konsantrasyonudur. kolaylaştırılması e defficient hidroliz, reaksiyon koşulları (1 mmol ölçekli reaksiyonu için 60 mL) önemli bir miktarı, sulu EDTA çözeltisi gerektiren substrat EDTA nisbetle birkaç eşdeğer gerektirir. reaktifleri nispeten düşük (~ 0.015 M) bir konsantrasyonda bir Fmoc koruma sonuçları çözücünün bu hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Prova-konsept Reaksiyon, seyrek reaksiyon koşullarına rağmen gelecek vaat eden bir% 55 verimle ürün elde edilmiştir, bu koşullar kullanılarak da, artan sterik kitle kaynaklanan glisin düşük nucleophilicty göreli amino asitleri kullanarak bu konsantrasyonunu arttırmak gerekli olabilir.
Özetle, tipik olarak, UAA en sentezi için kullanılan bir Ni-Schiff baz kompleksine hidrolizini teşvik etmek için EDTA yararını göstermiştir. Bu Hidroliz koşulları asit-labil yan zincir koruma gruplarının tutma sağlayan, bu hidrolize tipik kuvvetli asidik koşul gerektirmez. Gelecek deneyler t uygulayarak odaklanmalıdırDoğal olmayan amino asit çeşitli substratlar için kendi genel bir strateji. Bu sonuna doğru Çalışma devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Kaygan Kaya Üniversitesi tarafından sağlanan Fonlama. Biz onların anlayışlar için T. Boron III (Kaygan Kaya Üniversitesi) ve C. Haney (Pennsylvania Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
