Summary
Hier presenteren we een efficiënte hydrolyse en daaropvolgende Fmoc bescherming van een aminozuur geïsoleerd uit een Ni-Schiff-base complex. Hydrolyseomstandigheden die hier geschikt zijn voor gebruik retentie zuur-labiele zijketen beschermende groepen vereist. Deze techniek kan worden aangepast aan een verscheidenheid van niet-natuurlijke aminozuur substraten.
Abstract
Onnatuurlijke aminozuren, aminozuren met zijketen functionaliteiten niet vaak gezien in de natuur, in toenemende mate in synthetische peptidesequenties. Synthese van enkele niet-natuurlijke aminozuren omvat vaak het gebruik van een precursor bestaande uit een Schiff-base gestabiliseerd door een nikkel kation. Onnatuurlijke zijketens kunnen op aminozuurskelet in deze Schiff-base complex geïnstalleerd. De resulterende onnatuurlijke aminozuur kan daarna worden geïsoleerd uit dit complex via hydrolyse van de Schiffse-base, typisch door gebruik te refluxen in sterk zure oplossing. Deze sterk zure omstandigheden kunnen zuur-labiele zijketen beschermende groepen verwijderen noodzakelijk voor de onnatuurlijke aminozuren voor gebruik in microgolven vaste-fase peptidesynthese. In dit werk presenteren we een efficiënte hydrolyse en daaropvolgende Fmoc bescherming van een aminozuur geïsoleerd uit een Ni-Schiffse base complex. Hydrolyseomstandigheden die in dit werk zijn geschikt voor het bewaren van zuurlabiele side-keten beschermende groepen en kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van niet-natuurlijke aminozuur substraten.
Introduction
Onnatuurlijke aminozuren (UAA's) dragende zijketens die afwijken van de twintig natuurlijk voorkomende aminozuren die in de natuur zijn bruikbaar in een breed scala van toepassingen. Synthese van deze UAA is echter moeilijk zijn afhankelijk van de structuur van de zijketens en de stereochemie van de aminozuur backbone. CH bindingsactivering van glycine in het kader van een nikkel Schiff-base complex werd gebruikt om een verscheidenheid van aminozuurderivaten zoals α, β-diaminozuren 1 en UAA's lager gefluoreerd 2 of heterocyclische zijketens produceren. 3
Na toevoeging van niet-natuurlijke zijketens, gefunctionaliseerde OCG worden meestal van de Schiff-base complex met terugvloeiing in zoutzuur 4 verwijderd en vervolgens geïsoleerd met behulp van ionenwisselingschromatografie. Terwijl over het algemeen efficiënt Dit protocol genereertmino zuren die geschikt zijn voor gebruik in vaste-fase peptidesynthese (SPPS) zijn. De aard van SPPS vereist de aanwezigheid van een zuur-labiele zijketen-beschermende groepen en de sterk zure karakter typische Ni-Schiff-base ontledingsomstandigheden voorkomt isolatie landbouwgrond met deze beschermende groepen intact. Voor zover wij weten heeft slechts één alternatief decompositiemethode gemeld: gebruik van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en hydrazine bij verhoogde temperaturen, 5 omstandigheden die zelf niet geschikt voor sommige zijketen beschermende groepen zoals ftaalimiden zijn.
Figuur 1: Bereiding van Ni-PBP-Gly van Ni2 +, PBP en glycine (Gly). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Hierin beschrijven we een werkwijze voor hydrolyse van een Ni-Schiff-base complex, Ni-PBP-Gly (Figuur 1). Dit complex afgeleid van Ni 2+, glycine en pyridine-2-carbonzuur- (2-benzoyl-fenyl) -amide (PBP), 6 is aangetoond dat een nuttig platform voor de synthese van diverse UAA's en makkelijk toegankelijk met behulp van een twee-staps syntheseroute. 7 Synthese van het complex-literatuur precedent in hoge opbrengst. 6 Onze resultaten hieronder tonen de toepasbaarheid van hydrolyseomstandigheden gebruik EDTA bij mild zure tot neutrale pH omstandigheden die geschikt zijn voor gebruik met de UAA dragende zuur-labiele zijketen-beschermende groepen. Na hydrolyse, kan de verkregen oplossing worden geïsoleerd en onmiddellijk onderworpen aan standaardomstandigheden Fmoc bescherming van een Fmoc-beschermd aminozuur werd verkregen (figuur 2).
Figuur 2: Hydrolyse en Fmoc-bescherming van een aminozuur Geïsoleerd van Ni-PBP-Gly. Reactie Voorwaarden: i. EDTA (12 equiv), pH 4,5; ii. Ethylacetaat wassen en instelling op pH 7; iii. Fmoc-OSu (1 equiv), NaHCO3 (2 equiv). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrolyse van Ni-Schiff Base-Complex
- Los 1 mmol Ni-PBP-Schiff-base complex in 40 ml N, N-dimethylformamide (DMF) onder roeren in een 250 ml rondbodemkolf bij kamertemperatuur.
- Voeg 60 ml 0,2 M waterige EDTA, pH 4,5.
- Gebruikmaking van een magnetische roerstaaf en roerplaat, roer de gecombineerde oplossing overnacht. Omdat de Schiff-base complex wordt gehydrolyseerd, zal de kleur verschuiven van een diep rood naar wit.
- Na voltooiing van de reactie zoals aangegeven door de afwezigheid van enige rode kleur, breng de reactie in een 250 ml scheitrechter.
- Voeg 50 ml dichloormethaan, de dop scheitrechter en meng. Giet de organische wassen in een verspilling beker. Herhaal dit proces drie keer PBP en elk restant Ni-PBP-Schiff-base complex te verwijderen. Verzamel de overblijvende waterige laag in een 250 ml rondbodemkolf.
2. Fmoc bescherming van gehydrolyseerde aminozuur
- Voeg 168 mg natriumbicarbonaat (2,00 mmol, 2 eq) aan de oplossing en geroerd met een magnetische roerstaaf en roerplaat.
- Oplossen 337 mg Fmoc N-hydroxysuccinimide-ester (1,00 mmol, 1 eq) in een minimale hoeveelheid dioxaan (ongeveer 4 of 5 ml) in een 10 mL flesje. Breng deze oplossing aan de waterige oplossing en roer 's nachts.
- Nadat men het reactiemengsel overnacht geroerd, zuur de verkregen oplossing tot pH 2 met 1 M zoutzuur. Controleer pH regelmatig met pH teststroken.
- Breng de reactie in een 250 ml scheitrechter en voeg 50 ml ethylacetaat. Cap de scheitrechter, meng, en verzamel de organische laag in een 250 ml erlenmeyer. Herhaal dit proces nog twee keer, het combineren van de organische extracten. Droog de gecombineerde organische extracten met ongeveer 3 g magnesium sulfate.
- Concentreer de gecombineerde organische extracten met een rotatieverdamper om het ruwe Fmoc-beschermde aminozuur werd verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze hypothese was dat verwijdering van de Ni2 + uit de Ni-PBP-Gly complex kan een efficiënte hydrolyse van de Schiffse-base mogelijk te maken zonder de noodzaak van strenge pH-omstandigheden. EDTA is een goedkope en goed onderzochte cheleringsmiddel, 10 veronderstelden we dat toevoeging van EDTA tot een oplossing van Ni-PBP-Gly chelatie Ni2 + -ionen vergemakkelijkt, waardoor hydrolyse van het complex te bevorderen.
Om onze theorie dat EDTA alleen doeltreffend kan bevorderen hydrolyse van het complex te testen, onderwierpen wij een oplossing van Ni-PBP-Gly in DMF bij kamertemperatuur toenemende equivalenten EDTA pH 4,5 oplossing in water, het niet-aangepaste pH van waterige EDTA-dinatrium zoutoplossing . Voortgang van de hydrolyse reactie kan worden gevolgd door het observeren van de kleur van de oplossing; niet-omgezette Ni-PBP-Gly in oplossing toont een dieprode kleur, terwijl PBP geïsoleerdvan dit complex is wit. We volgden de voortgang van de hydrolyse reactie door monitoring van de kleurverandering van de oplossing van rood naar wit (tabel 1). Reacties die minder dan acht equivalenten toonde enkele overgang van kleuren van rood naar wit, maar de reactie onvolledig was in elk geval. Geen kleurverandering was duidelijk voor de voorwaarden zonder EDTA.
Het effect van de pH op de hydrolyse werd op dezelfde manier beoordeeld. Onderwerping van de Ni-PBP-Gly complex hydrolyseomstandigheden via 12 equivalenten EDTA nacht onder variërende pH bij kamertemperatuur liet succesvolle hydrolyse van het complex optreedt onder pH-omstandigheden variërend 4,5-7,5. Dit demonstreert de flexibiliteit van EDTA hydrolyse; pH kan worden toegenomen tot meer zuurgevoelige zijketen beschermende groepen.
| Staat | pH van EDTA Solution | overnight Voltooiing | |
| 1 | 0 | 4.5 | Geen |
| 2 | 2 | 4.5 | partieel |
| 3 | 4 | 4.5 | partieel |
| 4 | 6 | 4.5 | partieel |
| 5 | 8 | 4.5 | vol |
| 6 | 10 | 4.5 | vol |
| 7 | 12 | 4.5 | vol |
| 8 | 12 | 5.0 | vol |
| 9 | 12 | 5.5 | vol |
| 10 | 12 | 6.0 | vol |
| 11 | 12 | 6.5 | vol |
| 12 | 12 | 7.0 | vol |
| 13 | 12 | 7.5 | vol |
| 14 | 12 | 8.0 | partieel |
Tabel 1: Ni-PBP-Gly hydrolysecondities.
Controleren of de hydrolyse was voltooid met de meest efficiënte aandoening, 7, geëxtraheerd we het reactiemengsel driemaal met dichloormethaan, gecombineerd en de organische lagen gedroogd en geanalyseerd het verkregen residu met behulp van nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR). Het NMR-spectrum vertoonde geen bewijs van Ni-PBP-Gly in het monster; de enige resonanties in het spectrum paste literatuurrapporten van PBP suggereert volledige hydrolyse van het complex.
We hebben gekeken naar de haalbaarheid van onze optimale hydrolyse-omstandigheden met aminozuren bevattening diverse zijketen beschermende groepen. Monsters van Fmoc-L-glutaminezuur 5-tert-butylester (Fmoc-Glu (tBu) -OH), Fmoc-O - tert-butyl-L-treonine (Fmoc-Thr (tBu) -OH), Fmoc - O - tert-butyl-L-tyrosine (Fmoc-Tyr (tBu) -OH) en N (in) N-CBZ-α -Fmoc-L-tryptofaan (Fmoc-Trp (Boc) -OH) werd opgelost in DMF en onderworpen aan hydrolyse bij kamertemperatuur met behulp van 12 equivalenten EDTA bij pH 4,5. Nadat men een nacht roeren, werd de oplossing geëxtraheerd met dichloormethaan en met NMR geanalyseerd. Een representatief NMR is opgenomen voor Fmoc-Glu (tBu) -OH (figuur 3). Telkens spectrale gegevens toonden volledige retentie van zijketen beschermende groepen. 11, 12, 13
Figure 3: Representatieve NMR van een Fmoc-monomeer dat een zuur-labiele zijketen-beschermende groep na onderwerping aan hydrolyseomstandigheden.
Het zuur-labiele zijketen-beschermende groep is gemarkeerd met een blauwe doos. Afgeronde integratiewaarden de protonsignalen van deze verbinding zijn opgenomen tussen haakjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Na hydrolyse en organische extractie, de overblijvende waterige laag de vrije aminozuren naast resterende EDTA en Ni2 + -ionen. Opdat de aanwezigheid van deze stoffen niet zouden interfereren met daaropvolgende Fmoc bescherming van het vrije aminozuur, voerden we een testreactie glycine door oplossen in een waterige oplossing die EDTA en Ni2 + -ionen bij concentraties gelijk aan hydrolyse ingang 7 We vervolgens onderworpen vloeistof over in een waterige standaard Fmoc bescherming. 8 Na voltooiing van de reactie en opwerking bepaalden wij de reactie gaf een 25% opbrengst van Fmoc-beschermde glycine. Dit percentage opbrengst is niet verrassend gezien de verdunde concentratie van de reactie en suggereert dat de aanwezigheid van Ni2 + -ionen en EDTA niet interfereren met standaard Fmoc beschermingsreactie.
Met bewijs dat elke individuele component van onze methodiek (hydrolyse isolatie van vrij aminozuur en Fmoc bescherming) haalbaar, voerden wij een proof-of-concept experiment met behulp van Ni-PBP-Gly. Wij hebben de levensvatbaarheid van de bovenstaande en volgende Fmoc bescherming met behulp van een standaard protocol 8 een Fmoc-beschermd aminozuur redelijk een opbrengst beschreven hydrolysecondities. Aan een geroerde oplossing van Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 eq) in 40 ml DMF bij kamertemperatuurerature werd 0,2 M EDTA oplossing bij pH 4,5 (65 ml, 13 mmol, 13 equiv). Het reactiemengsel werd overnacht geroerd en vervolgens viermaal gewassen met dichloormethaan. De waterlaag werd vervolgens ingesteld op pH 7 met behulp van vast natriumbicarbonaat. Aan de waterige laag werd natriumwaterstofcarbonaat (163 mg, 1,93 mmol, 2 equiv) en Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) opgelost in een minimale hoeveelheid dioxaan. Het reactiemengsel werd gedurende een nacht en daarna aangezuurd met 1 M zoutzuur en driemaal geëxtraheerd met ethylacetaat roeren. De organische extracten werden gecombineerd, zesmaal gewassen met zoutoplossing, geconcentreerd, gedroogd met magnesiumsulfaat en onder vacuüm gedroogd om een mengsel van ongereageerde Fmoc-OSu en Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% opbrengst) werd verkregen. Spectrale gegevens gematched eerder gepubliceerd spectra voor Fmoc-Gly-OH. 9 Deze laatste experiment geeft aan dat het mogelijk is om vrij glycine isoleren van de Ni-PBP-Gly complex en dragen uit naar de Fmoc-protecteerd vorm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven protocol is bruikbaar in zijn vermogen om de isolatie van een aminozuur skelet van een Ni-Schiff-base-complex onder milde pH-omstandigheden en daaropvolgende Fmoc bescherming van deze geïsoleerde aminozuur via twee kritische stappen te vergemakkelijken. De eerste stap omvat het roeren van een DMF / wateroplossing die EDTA om afgifte van het aminozuur uit het complex te vergemakkelijken. Residuele complex of organische bijproducten kunnen gemakkelijk worden verwijderd met afzuiging. De tweede stap van dit protocol omvat een Fmoc bescherming van het aminozuur in de waterige laag na isolatie door extractie in de eerste stap. We hebben aangetoond dat het vermogen om deze procedure in een pH-traject van 4,5-7,5 te wijzigen, waardoor aanzienlijke flexibiliteit die nodig kunnen zijn voor sommige pH-gevoelige zijketen beschermende groepen.
Een mogelijke beperking van deze techniek is de lage reactie concentratie van de Fmoc bescherming van de geïsoleerde aminozuren. Het vergemakkelijken van efficient hydrolyse vereist verscheidene equivalenten EDTA opzichte van substraat, de reactieomstandigheden vereisen een aanzienlijke hoeveelheid waterige EDTA-oplossing (60 ml van een 1 mmol schaal reactie). Met deze hoeveelheid oplosmiddel in een Fmoc bescherming resultaten in een relatief laag (~ 0,015 M) concentratie van de reagentia. Terwijl een proof-of-concept reactie onder toepassing van deze omstandigheden leverde product op een veelbelovende 55% opbrengst ondanks de verdunde reactiecondities, kan het noodzakelijk zijn om deze concentratie te verhogen bij gebruik van aminozuren met beperkte nucleophilicty opzichte van glycine als gevolg van verhoogde sterische omvang.
Samengevat hebben we het nut van EDTA aangetoond hydrolyse van een Ni-Schiff-base complex doorgaans gebruikt voor de synthese van OCG's te bevorderen. Deze hydrolyseomstandigheden niet de sterk zure omstandigheden die typisch zijn voor deze hydrolyse nodig, waardoor retentie zuur-labiele zijketen-beschermende groepen. Toekomstige experimenten moet zich richten op het toepassen van tZijn algemene strategie om een verscheidenheid van niet-natuurlijke aminozuur substraten. Werken in deze richting loopt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering die door Slippery Rock University. We danken T. Boron III (Slippery Rock University) en C. Haney (Universiteit van Pennsylvania) voor hun inzichten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
