Summary
Qui, presentiamo un'idrolisi efficiente e successiva protezione Fmoc di un amminoacido isolato da un complesso Ni-Schiff-base. condizioni di idrolisi qui presentati sono adatti per l'uso quando è richiesta la ritenzione di gruppi protettivi acido-labile catena laterale. Questa tecnica può essere adattabile ad una varietà di substrati amminoacidi innaturali.
Abstract
aminoacidi non naturali, aminoacidi contenenti funzionalità in catena laterale non comunemente visto in natura, sono sempre trovati in sequenze peptidiche sintetiche. Sintesi di alcuni aminoacidi non naturali spesso include l'uso di un precursore costituito da una base di Schiff-stabilizzato da un catione nichel. Unnatural catene laterali possono essere installati su un backbone aminoacido che si trova in questo complesso Schiff-base. L'amminoacido non naturale risultante può essere isolato da questo complesso mediante idrolisi della Schiff-base, tipicamente impiegando riflusso in soluzione fortemente acida. Queste condizioni fortemente acide possono rimuovere l'acido-labile catena laterale gruppi protettori necessario per gli amminoacidi non naturali da utilizzare nella sintesi peptidica in fase solida di micro-onde. In questo lavoro, presentiamo un'idrolisi efficiente e successiva protezione Fmoc di un amminoacido isolato da un complesso di base Ni-Schiff. condizioni di idrolisi presentati in questo lavoro sono adatti per la conservazione di s acido-labileide-catena gruppi protettori e può essere adattabili ad una varietà di substrati amminoacidi innaturali.
Introduction
amminoacidi non naturali catene laterali cuscinetto (di SAU) che variano da quelli dei venti naturali amminoacidi presenti in natura hanno trovato utilità in un'ampia gamma di applicazioni. Sintesi di questi SAU, tuttavia, può essere difficile a seconda della struttura delle catene laterali e la stereochimica della spina dorsale aminoacido. Attivazione del legame CH di glicina nel contesto di un complesso Schiff-base di nichel è stato utilizzato per produrre una varietà di derivati di amminoacidi compreso α, acidi p-diammino 1 e il cuscinetto di SAU fluorurato 2 o eterociclici catene laterali. 3
Dopo aggiunta di innaturali catene laterali, funzionalizzati SAU sono tipicamente rimossi dal complesso Schiff-base riflusso in acido cloridrico 4 e vengono successivamente isolato con cromatografia a scambio ionico. Mentre in genere efficace, questo protocollo genera unacidi mino che possono essere adatti per l'uso nella sintesi peptidica in fase solida (SPSS). La natura del SPPS richiede la presenza di gruppi acido-labile catena laterale protezione e la natura fortemente acida di condizioni tipiche Ni-Schiff-base decomposizione impedisce isolamento di SAU con questi gruppi protettivi intatte. A nostra conoscenza, solo un metodo di decomposizione alternativa 'stato segnalato: impiego di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e idrazina a temperature elevate, 5 condizioni che si può non essere adatto per qualche catena laterale gruppi protettivi come phthalimides.
Figura 1: Sintesi di Ni-PBP-Gly da Ni 2+, PBP e glicina (Gly). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Qui, riportiamo un metodo per idrolisi di un complesso Ni-Schiff-base, Ni-PBP-Gly (Figura 1). Questo complesso, derivato da Ni 2+, glicina, e piridina-2-carbossilico (2-benzoil-fenil) -ammide (PBP), 6 ha dimostrato di essere una piattaforma utile per la sintesi di una varietà di SAU ed è facilmente accessibili mediante la via sintetica a due fasi. 7 Sintesi di questo complesso è letteratura precedented resa elevata. 6 I nostri risultati descritti qui di seguito dimostrano l'applicabilità delle condizioni di idrolisi utilizzando EDTA a leggermente acida a condizioni di pH neutro adeguati per l'utilizzo con cuscinetto acido-labile catena laterale di SAU gruppi protettivi. A seguito di idrolisi, la soluzione acquosa risultante può essere isolato e sottoposto immediatamente alle condizioni di protezione Fmoc standard per permettere un aminoacido Fmoc-protetto (Figura 2).
Figura 2: Idrolisi e Fmoc-protezione di un amminoacido Isolato da Ni-PBP-Gly. Condizioni di reazione: i. EDTA (12 equiv), pH 4,5; ii. Etile acetato e lavata aggiustamento a pH 7; iii. Fmoc-OSu (1 equiv), NaHCO 3 (2 equiv). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. L'idrolisi del Complesso Ni-Schiff-Base
- Sciogliere 1 mmoli del complesso Ni-PBP-Schiff-base in 40 ml di N, N-dimetilformammide (DMF) sotto agitazione in un pallone da 250 ml a fondo tondo a temperatura ambiente.
- Aggiungere 60 ml di soluzione 0,2 M EDTA acquosa, a pH 4,5.
- Utilizzando una barra di agitazione magnetica e mescolare piastra, agitare la soluzione combinata notte. Come il complesso Schiff-base viene idrolizzato, il colore si sposterà da un rosso intenso al bianco.
- Dopo il completamento della reazione, come indicato dall'assenza di qualsiasi colorazione rossa, trasferire la reazione in un imbuto separatore da 250 ml.
- Aggiungere 50 mL di diclorometano, tappare l'imbuto separatore, e mescolare. Drenare il lavaggio organico in un becher rifiuti. Ripetere questo processo tre volte per rimuovere PBP e ogni complesso Ni-PBP-Schiff-base residua. Raccogliere lo strato acquoso residuo in un pallone a fondo rotondo da 250 mL.
2. Fmoc Protezione dei idrolizzato Amino Acid
- Aggiungere 168 mg di bicarbonato di sodio (2,00 mmol, 2 equiv) alla soluzione e mescolare con una barra di agitazione magnetica e mescolare piastra.
- Sciogliere 337 mg di Fmoc N -hydroxysuccinimide estere (1,00 mmoli, 1 equivalente) in una quantità minima di diossano (circa 4 o 5 mL) in una fiala 10 mL. Trasferire questa soluzione alla soluzione acquosa e agitazione per una notte.
- Dopo aver lasciato la reazione di agitazione per una notte, acidificare la soluzione risultante a pH 2 con acido cloridrico 1M. Controllare periodicamente pH utilizzando strisce reattive pH.
- Trasferire la reazione in un imbuto separatore da 250 ml e si aggiungono 50 mL di acetato di etile. Chiudere l'imbuto separatore, mescolare bene, e raccogliere lo strato organico in un pallone Erlenmeyer da 250 mL. Ripetere questa operazione altre due volte, combinando gli estratti organici. Essiccare gli estratti organici combinati con circa 3 g di magnesio sulfate.
- Concentrare gli estratti organici combinati utilizzando un evaporatore rotante per permettersi l'aminoacido Fmoc-protetto greggio.
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Representative Results
Abbiamo ipotizzato che la rimozione del Ni 2+ dal complesso Ni-PBP-Gly potrebbe consentire un'idrolisi acquosa efficiente del Schiff-base senza la necessità di condizioni di pH dure. Come EDTA è un agente chelante poco costoso e ben studiato, 10 ipotizziamo che l'aggiunta di EDTA ad una soluzione di Ni-PBP-Gly faciliterebbe chelazione di ioni Ni 2+, promuovendo così idrolisi del complesso.
Per testare la teoria che l'EDTA da solo potrebbe promuovere efficacemente idrolisi del complesso, abbiamo sottoposto una soluzione di Ni-PBP-Gly in DMF a temperatura ambiente per aumentare equivalenti di EDTA a pH 4.5 soluzione acquosa, il pH non aggiustato di EDTA soluzione acquosa di sale disodico . Progredire della reazione di idrolisi può essere monitorato dalla osservando il colore della soluzione; non reagito Ni-PBP-Gly in soluzione mostra un colore rosso intenso mentre PBP isolatoda questo complesso è bianco. Abbiamo rintracciato il progredire della reazione di idrolisi controllando il cambiamento di colore della soluzione da rosso a bianco (Tabella 1). Reazioni che coinvolgono meno di otto equivalenti mostrato qualche transizione di colorazione dal rosso al bianco, ma la reazione era incompleta, in ciascun caso. Nessun cambiamento di colore è stato evidente per condizioni senza EDTA.
L'effetto del pH sulla idrolisi era ugualmente valutata. Assoggettamento della complesso Ni-PBP-Gly a condizioni di idrolisi con 12 equivalenti di EDTA notte con pH variabile a temperatura ambiente mostrava successo idrolisi del complesso avviene in condizioni di pH che vanno da 4,5 a 7,5. Questo dimostra la flessibilità di EDTA idrolisi; pH può essere aumentato per tenere conto di altri gruppi protettivi acido-sensibili in catena laterale.
| Condizione | pH di EDTA Soluzione | Completamento Pernottamento | |
| 1 | 0 | 4.5 | Nessuna |
| 2 | 2 | 4.5 | Parziale |
| 3 | 4 | 4.5 | Parziale |
| 4 | 6 | 4.5 | Parziale |
| 5 | 8 | 4.5 | Pieno |
| 6 | 10 | 4.5 | Pieno |
| 7 | 12 | 4.5 | Pieno |
| 8 | 12 | 5.0 | Pieno |
| 9 | 12 | 5.5 | Pieno |
| 10 | 12 | 6.0 | Pieno |
| 11 | 12 | 6.5 | Pieno |
| 12 | 12 | 7.0 | Pieno |
| 13 | 12 | 7.5 | Pieno |
| 14 | 12 | 8.0 | Parziale |
Tabella 1: Ni-PBP-Gly idrolisi condizioni.
Per verificare che l'idrolisi è stata completata con la condizione più efficiente, 7, abbiamo estratto la reazione tre volte con diclorometano, combinati ed essiccati gli strati organici e analizzato il residuo risultante mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Lo spettro NMR ha mostrato alcuna evidenza di Ni-PBP-Gly nel campione; gli unici risonanze presenti nello spettro abbinati dati di letteratura di PBP, suggerendo completa idrolisi del complesso.
Abbiamo esaminato la fattibilità delle nostre condizioni di idrolisi ottimali con aminoacidi contienezione una serie di gruppi protettori delle catene laterali. Campioni di Fmoc-L-glutammico acido 5- tert-butil estere (Fmoc-Glu (t Bu) -OH), Fmoc- O - terz-butil-L-treonina (Fmoc-Thr (t Bu) -OH), Fmoc - O - terz-butil-L-tirosina (Fmoc-Tyr (Bu t) -OH), e N (in) -Boc- N α -Fmoc-L-triptofano (Fmoc-Trp (Boc) -OH) vengono sciolti in DMF e sottoposto ad idrolisi a temperatura ambiente usando 12 equivalenti di EDTA a pH 4,5. Dopo essere stato lasciato agitazione per una notte, le soluzioni sono state estratte con diclorometano e analizzati mediante NMR. Un rappresentante NMR è incluso per Fmoc-Glu (tBu) -OH (Figura 3). In ogni caso, i dati spettrali mostrato conservazione dei gruppi protettori delle catene laterali. 11, 12, 13
Figura 3: Rappresentante NMR di un Fmoc-monomero Bearing un acido-labile Side-protezione della catena di Gruppo dopo assoggettamento all'idrolisi Condizioni.
Il gruppo di protezione della catena laterale di acido-labile è evidenziata con un riquadro blu. valori di integrazione arrotondati per i segnali di protoni di questo composto sono incluse tra parentesi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Dopo idrolisi ed estrazione organico, lo strato acquoso residuo contiene l'amminoacido libero insieme con EDTA residuo e gli ioni Ni 2+. Per garantire che la presenza di tali sostanze non interferirebbe con conseguente protezione Fmoc del amminoacido libero, è stata eseguita una reazione di prova sciogliendo glicina in una soluzione acquosa contenente ioni EDTA e Ni 2+ con concentrazioni simili a voce idrolisi 7. We poi sottoposto questa soluzione in un protezione acquosa standard di Fmoc. 8 Dopo completamento della reazione e work-up, abbiamo determinato la reazione offerta una resa del 25% di glicina Fmoc-protetto. Questa resa percentuale non è sorprendente considerando la concentrazione diluita della reazione e suggerisce che la presenza di ioni e 2+ EDTA Ni non interferiscono con la reazione di protezione Fmoc standard.
Con elementi che comprovino che ogni singolo componente della nostra metodologia (idrolisi, l'isolamento di aminoacidi liberi, e la protezione Fmoc) è fattibile, abbiamo effettuato un esperimento proof-of-concept utilizzando Ni-PBP-Gly. Abbiamo valutato la vitalità delle condizioni di idrolisi descritte sopra e successiva protezione Fmoc utilizzando un protocollo standard 8 per permettere un aminoacido Fmoc-protetto in resa ragionevole. Ad una soluzione agitata di Ni-PBP-Gly (404 mg, 0.971 mmoli, 1 equivalente) in 40 mL di DMF a temperatura ambienteerature inserito soluzione 0,2 M EDTA a pH 4,5 (65 mL, 13 mmol, 13 equivalenti). La reazione è stata lasciata sotto agitazione per una notte e quindi lavata quattro volte con diclorometano. Lo strato acquoso è stato quindi regolato a pH 7 con bicarbonato di sodio solido. Per bicarbonato lo strato acquoso è stato aggiunto sodio (163 mg, 1,93 mmol, 2 equiv) e Fmoc-OSu (327 mg, 0.971 mmoli, 1 equivalente) disciolto in una quantità minima di diossano. La reazione è stata lasciata sotto agitazione per una notte e poi acidificata con 1 M acido cloridrico ed estratto tre volte con acetato di etile. Gli estratti organici sono stati combinati, lavati sei volte con salamoia, concentrato, essiccato con solfato di magnesio, ed essiccato sotto vuoto per fornire un impasto di non reagito Fmoc-OSu e Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% di resa). Dati spettrali abbinato precedentemente pubblicati spettri per Fmoc-Gly-OH. 9 Questo esperimento finale indica che è possibile isolare glicina libera dal Ni-PBP-Gly complessa e portarlo avanti al suo Fmoc-protforma ette.
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Discussion
Il protocollo descritto sopra è utile nella sua capacità di facilitare l'isolamento di una dorsale amminoacido da un complesso Ni-Schiff-base in condizioni di pH blande e successiva protezione Fmoc di questo aminoacido isolato attraverso due passaggi critici. Il primo passo consiste nel mescolare una soluzione in DMF / acqua contenente EDTA per facilitare il distacco del aminoacido dal complesso. Residui sottoprodotti organici complessi o possono essere facilmente rimossi con estrazione. Il secondo passo di questo protocollo prevede una protezione Fmoc dell'amminoacido trovato nello strato acquoso dopo l'isolamento per estrazione nel primo passaggio. Abbiamo dimostrato la capacità di modificare questa procedura in un range di pH 4.5-7.5, consentendo una notevole flessibilità che può essere necessario per alcuni gruppi protettivi sensibile al pH in catena laterale.
Un potenziale limite di questa tecnica è la bassa concentrazione reazione della protezione Fmoc dell'amminoacido isolato. Come facilitare eidrolisi fficient richiede diversi equivalenti di EDTA rispetto al substrato, le condizioni di reazione richiedono una quantità significativa soluzione acquosa di EDTA (60 mL per una reazione di 1 mmol scala). Usando questo volume di solvente in un risultato di protezione Fmoc in una relativamente bassa (~ 0,015 M) concentrazione dei reagenti. Mentre una reazione proof-of-concept usando queste condizioni prodotto concessi in una promettente resa 55% nonostante le condizioni di reazione diluita, può essere necessario aumentare questa concentrazione quando si utilizzano amminoacidi con ridotta nucleophilicty rispetto alla glicina derivante da maggiore sterico.
In sintesi, abbiamo dimostrato l'utilità di EDTA per favorire l'idrolisi di un complesso di base Ni-Schiff in genere utilizzato per la sintesi di SAU di. Queste condizioni di idrolisi non richiedono la condizione fortemente acidi tipico di queste idrolisi, consentendo la ritenzione di gruppi acido-labile catena laterale protezione. Esperimenti futuri dovrebbero concentrarsi su come applicare tla sua strategia generale per una varietà di substrati di aminoacidi non naturali. Il lavoro a tal fine è in corso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il finanziamento fornito da Slippery Rock University. Vorremmo ringraziare T. Boron III (Slippery Rock University) e C. Haney (University of Pennsylvania) per le loro intuizioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
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