Summary
ここで、我々は、効率的な加水分解およびNi-シッフ塩基複合体から単離されたアミノ酸のその後のFmoc保護を提示します。酸不安定性側鎖保護基の保持が必要な場合、ここに提示加水分解条件は、使用するのに適しています。この技術は、非天然アミノ酸の種々の基材に適応することができます。
Abstract
非天然アミノ酸は、一般に自然界に見られない側鎖官能基を含むアミノ酸は、ますます合成ペプチド配列に見出されます。いくつかの非天然アミノ酸の合成は、多くの場合、ニッケルカチオンによって安定化シッフ塩基からなる前駆体の使用を含みます。非天然側鎖がこのシッフ塩基複合体に見出されるアミノ酸骨格上にインストールすることができます。得られた非天然アミノ酸は、その後、典型的には、強酸性溶液中で還流を採用することにより、シッフ塩基の加水分解を用いて、この複合体から単離することができます。これらの高度に酸性の条件は、マイクロ波アシスト固相ペプチド合成に使用される非天然アミノ酸のために必要な酸に不安定な側鎖保護基を除去することができます。本研究では、効率的な加水分解およびNi-シッフ塩基複合体から単離されたアミノ酸のその後のFmoc保護を提示します。この作品で提示加水分解条件は、酸に不安定なSの保持に適していますIDE鎖保護基および非天然アミノ酸の種々の基材に適応することができます。
Introduction
天然に見出される20個の天然アミノ酸のものとは異なる非天然アミノ酸(UAAの)軸受側鎖は、アプリケーションの広い範囲で有用性が見出されています。これらUAA年代の合成は、しかしながら、側鎖の構造及びアミノ酸骨格の立体化学に依存して困難であり得ます。ニッケルシッフ塩基錯体の文脈におけるグリシンのCH結合活性化はα、βジアミノ酸1,2または複素環式側鎖にフッ素化UAAのベアリングを含むアミノ酸誘導体の多様を生成するために使用されてきました。 3
非天然側鎖を添加した後、官能UAAのは、典型的には、塩酸4中で還流することによりシッフ塩基複合体から除去され、続いてイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離されます。一般的に、効率的なながら、このプロトコルは、生成します固相ペプチド合成(SPPS)における使用には適さないかもしれMINO酸。 SPPSの性質は、酸不安定性側鎖保護基の存在を必要とし、典型的なニッケルシッフ塩基分解条件の強酸性の性質は、無傷のこれらの保護基でUAAの単離を防止することができます。我々の知る限り、唯一の代替的な分解方法が報告されている:高温でエチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびヒドラジンの使用を、5つの条件自体は、フタルイミドのようないくつかの側鎖保護基には適さない場合があります。
図1のNi 2+、PBP、及びグリシン(Glyで)からのNi-PBP-Glyでの合成。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
本明細書において、我々は、Ni-シッフ塩基錯体、ニッケルPBP-Glyを( 図1)の加水分解のための方法を報告しています。 Ni 2+、グリシン、及びピリジン-2-カルボン酸(2-ベンゾイル-フェニル) -アミド(PBP)、6に由来するこの複合体は、UAAの様々な合成のために有用なプラットフォームであることが実証され、容易にされていますかアクセス可能な二段階の合成経路を使用して。この複合体7つの合成は、文献、先例高収率です。 6以下に説明する本発明者らの結果はUAAの軸受酸不安定性側鎖保護基と共に使用するのに適切な中性pH条件に弱酸性でEDTAを用いた加水分解条件の適用可能性を実証します。加水分解後、得られた水溶液は、Fmoc保護アミノ酸( 図2)を産出するために標準的なFmoc保護条件に直ちに単離し、供することができます。
図2:加水分解およびNi-PBP-Glyをから分離アミノ酸ののFmoc保護。反応条件:I。 EDTA(12当量)を、pHが4.5、 II。 pH7の酢酸エチル洗浄、調整、 III。 Fmoc-OSuを(1当量)、 炭酸水素ナトリウム(2当量)を加えました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ニッケル - シッフ塩基錯体の加水分解1。
- 室温で250 mLの丸底フラスコに撹拌しながらN、N-ジメチルホルムアミド(DMF)40mLにニッケルPBP-シッフ塩基錯体の1モルを溶解します。
- 0.2 M水性EDTA溶液、pH4.5中の60ミリリットルを加えます。
- 磁気撹拌棒を使用し、プレートを攪拌、一晩組み合わせたソリューションをかき混ぜます。シッフ塩基錯体が加水分解されるように、色が白に深紅からシフトします。
- 任意赤色着色の欠如によって示されるように反応が完了した後、250mLの分液漏斗に反応を転送します。
- 、50 mLのジクロロメタンを追加し、分液漏斗をキャップし、混合します。廃棄物のビーカーに有機洗浄液を排出します。 PBPと残留ニッケルPBP-シッフ塩基錯体を除去するために、このプロセスを3回繰り返します。 250mLの丸底フラスコに残った水層を集めます。
加水分解アミノ酸の2のFmoc保護
- 溶液に168 mgの重炭酸ナトリウム(2.00ミリモル、2当量)を添加し、磁気攪拌棒を用いて撹拌し、プレートを攪拌します。
- 10mLのバイアル中のジオキサンの最小量(約4または5 mL)中に337ミリグラムのFmoc Nヒドロキシスクシンイミドエステル(1.00ミリモル、1当量)を溶解。水溶液に、このソリューションを移し、一晩撹拌。
- 反応物を一晩撹拌させた後、1 M塩酸でpH 2に、得られた溶液を酸性化します。定期的にpH試験ストリップを用いてpHをチェックしてください。
- 250mLの分液漏斗に反応を転送し、50mLの酢酸エチルを加えます。分液漏斗をキャップよく混合し、250 mLの三角フラスコに有機層を集めます。有機抽出物を組み合わせ、このプロセスをさらに2回繰り返します。マグネシウムsulfatの約3グラムと一緒にした有機抽出物を乾燥電子。
- 粗製Fmoc-保護アミノ酸を得、ロータリーエバポレーターを使用して、合わせた有機抽出物を濃縮します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
私たちは、Ni-PBP-Glyを複合体からのニッケル2+の除去は厳しいpH条件を必要とせずにシッフ塩基の効率的な水加水分解される可能性がありという仮説を立てました。 EDTAは、安価でよく研究キレート剤であるように、10は、我々は、Ni-PBP-Glyでの溶液にEDTAの添加は、それによって複合体の加水分解を促進すること、のNi 2+イオンのキレート化を容易にするであろうという仮説を立てました。
単独のEDTAが効果的に複合体の加水分解を促進することができると私たちの理論をテストするために、我々は、pHが4.5水溶液、EDTA二ナトリウム塩溶液の未調整のpHをEDTAの当量を増やすに室温でDMF中のNi-PBP-Glyをのソリューションを受けます。加水分解反応の進行は、溶液の色を観察することによりモニターすることができます。 PBPは、単離されている間、溶液中の未反応のNi-PBP-Glyでは、深い赤色を表示しますこの複合体から白です。我々は、白( 表1)に赤色からの溶液の色の変化を監視することにより加水分解反応の進行を追跡しました。 8当量より少ないが関与する反応は、白に赤から着色のいくつかの遷移を示したが、反応は、それぞれの場合に不完全でした。色の変化は、EDTAなしの条件については明らかではなかったです。
加水分解に対するpHの影響も同様に評価しました。室温で一晩のpHを変化させEDTAの12当量を用いて加水分解条件に対するNi-PBP-Glyを複合体の服従は、複合体の成功した加水分解が4.5から7.5の範囲のpH条件下で発生示しました。これは、EDTA加水分解の柔軟性を示しています。 pHは、より多くの酸感受性側鎖保護基を説明するために増加させることができます。
調子 | EDTA溶液のpH | 一晩完了 | |
1 | 0 | 4.5 | なし |
2 | 2 | 4.5 | 部分的 |
3 | 4 | 4.5 | 部分的 |
4 | 6 | 4.5 | 部分的 |
5 | 8 | 4.5 | いっぱい |
6 | 10 | 4.5 | いっぱい |
7 | 12 | 4.5 | いっぱい |
8 | 12 | 5.0 | いっぱい |
9 | 12 | 5.5 | いっぱい |
10 | 12 | 6.0 | いっぱい |
11 | 12 | 6.5 | いっぱい |
12 | 12 | 7.0 | いっぱい |
13 | 12 | 7.5 | いっぱい |
14 | 12 | 8.0 | 部分的 |
表1:ニッケルPBP-Glyを加水分解条件。
図7に示すように、その加水分解は、最も効率的な条件を使用して完了した検証するために、我々は、結合、ジクロロメタンで3回反応を抽出し、有機層を乾燥し、核磁気共鳴分光法(NMR)を使用して得られた残留物を分析しました。 NMRスペクトルは、試料中のNi-PBP-Glyでの証拠を示しませんでした。スペクトルで見つかった唯一の共振は、複合体の完全な加水分解を示唆し、PBPの文献報告と一致しました。
私たちは、アミノ酸との最適な加水分解条件の可能性が含まれている検討しました側鎖保護基の範囲をする。試料のFmoc-L-グルタミン酸5- tert-ブチルエステル(BU TのFmoc-Gluの()-OH)のFmoc-O - tert-ブチル -L-スレオニンのFmoc(BU TのFmoc-Thrの()-OH)、 - O - tert-ブチル -L-チロシン(BU TのFmoc-Tyrの()-OH)、及びN(IN)-Boc- Nα-Fmoc-L-トリプトファン(のFmoc-Trpを(BOC)-OH)を溶解させましたDMFおよびpH4.5のEDTAの12当量を用いて室温で加水分解に付します。一晩撹拌した後、溶液をジクロロメタンで抽出し、NMRによって分析しました。代表的なNMRはのFmoc-Gluの(TBU)-OH( 図3)のために含まれています。各場合において、スペクトルデータは、側鎖保護基の完全な保持を示しました。 11、12、13
図3:加水分解条件に付す後保護基、酸に不安定な側鎖ベアリングのFmoc-モノマーの代表的なNMR。
酸不安定性側鎖保護基は、青色のボックスで強調表示されています。この化合物のプロトンシグナルのための丸みを帯びた積分値を括弧内に含まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
加水分解し、有機抽出の後、残った水層は、残留EDTAおよびNi 2+イオンと一緒に遊離アミノ酸を含有します。これらの物質の存在は、遊離アミノ酸のその後のFmoc保護を妨害しないことを確実にするために、我々は、加水分解・エントリ7 Wと同様の濃度でEDTAおよびNi 2+イオンを含有する水溶液中でグリシンを溶解することによって試験反応を行いましたeはその後、標準的な水性のFmoc保護にこのソリューションを行いました。 図8は、反応の完了及び後処理の後、我々は、Fmoc保護グリシンの収率25%を得た反応を決定しました。この%の収率は、反応の希釈濃度を考慮すると驚くべきことではないとNi 2+イオンとEDTAの存在は、標準的なFmoc保護反応を妨害しないことを示唆しています。
私たちの方法論(加水分解、遊離アミノ酸の分離、およびFmoc保護)の各コンポーネントが実行可能であることを裏付ける証拠により、我々は、Ni-PBP-Glyをを使用して、概念実証実験を行いました。我々は、合理的な収率でFmoc保護アミノ酸を得、標準的なプロトコル8を用いて上述の加水分解条件およびその後のFmoc保護の生存率を評価しました。室温で40mLのDMF中のNi-PBP-Glyを(404ミリグラム、0.971ミリモル、1当量)の撹拌溶液にeratureは、pH 4.5(65ミリリットル、13ミリモル、13当量)に、0.2M EDTA溶液を添加しました。反応物を一晩撹拌し、次いで、ジクロロメタンで4回洗浄しました。次いで、水層を固体炭酸水素ナトリウムを用いてpHを7に調整しました。水層にジオキサン中の最小量に溶解し、炭酸水素ナトリウム(163ミリグラム、1.93ミリモル、2当量)およびFmoc-OSuを(327ミリグラム、0.971ミリモル、1当量)を加えました。反応物を一晩撹拌し、次いで1M塩酸で酸性化し、酢酸エチルで3回抽出しました。有機抽出物を合わせ、食塩水で6回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、未反応のFmoc-OSuを及びFmoc-Glyを-OH(160mgの、0.540ミリモル、収率54%)の混合物を真空下で乾燥させました。スペクトルデータは、のFmoc-Glyを-OHのために以前に発表されたスペクトルと一致しました。 9この最後の実験では、Ni-PBP-Glyを複合体から自由にグリシンを単離し、そののFmoc-protのを楽しみにそれを運ぶために実現可能であることを示し、ectedフォーム。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上述のプロトコルは、穏やかなpH条件と2つの重要な工程を経て、この単離されたアミノ酸のその後のFmoc保護の下でのNi-シッフ塩基複合体からのアミノ酸骨格の単離を容易にするその能力において有用です。最初のステップは、複合体からのアミノ酸の放出を容易にするためにEDTAを含有するDMF /水の溶液を攪拌することを含みます。残留錯体または有機副生成物を容易に抽出して除去することができます。このプロトコルの第2段階は、第一工程で抽出することによって分離した後、水層に見出されるアミノ酸のFmoc保護を含みます。我々はいくつかのpH感受性側鎖保護基のために必要であるかもしれない重要な柔軟性を可能にする、4.5から7.5のpH範囲で、この手順を変更する能力を実証しています。
この技術の一つの潜在的な制限は、単離されたアミノ酸のFmoc保護の低い反応濃度です。電子を促進するとして、fficient加水分解が基板にEDTAの相対数当量が必要であり、反応条件は、かなりの量の水性EDTA溶液(1ミリモル規模反応の60 ml)を必要とします。試薬の比較的低い(〜0.015 M)濃度でのFmoc保護結果に溶剤のこのボリュームを使用します。希釈反応条件にもかかわらず、有望な55%の収率で生成物を得、これらの条件を用いて、プルーフ・オブ・コンセプト反応が、増加した立体的なバルクから生じるグリシンに減少nucleophilicty相対有するアミノ酸を利用する場合、この濃度を高くする必要があるかもしれません。
要約すると、我々は通常、UAAのの合成に用いられるニッケル - シッフ塩基錯体の加水分解を促進するためにEDTAの有用性を実証しています。これらの加水分解条件は、酸不安定性側鎖保護基の保持を考慮して、これらの加水分解に対する典型的な強酸性条件を必要としません。今後の実験では、Tを適用するに焦点を当てるべきです非天然アミノ酸の種々の基材への彼の一般的な戦略。この終わりに向かって作業が進行中です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
スリッパリーロック大学が提供する資金。私たちは、彼らの洞察力のためにT・ボロン III(スリッパリーロック大学)とC・ハニー(ペンシルバニア大学)に感謝したいと思います。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
DMF | Fisher | D119-4 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
Dioxane | Fisher | D111-500 | |
Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
Chromatography Column | |||
pH Test Strips | |||
Rotary Evaporator | |||
250 mL Separatory Funnel | |||
250 mL Round Bottom Flask | |||
Stir Bar | |||
Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).