Summary
Здесь мы представляем эффективный гидролиз и последующую защиту Fmoc аминокислоты, выделенной из никель-Шифф-щелочного комплекса. Гидролиз условие, представленное здесь, является подходящим для использования, когда требуется сохранение кислотно-лабильной боковой цепь защитных групп. Эта техника может быть адаптированы к различным неестественных аминокислотных субстратов.
Abstract
Неприродные аминокислоты, аминокислоты, содержащие боковую цепь функциональных возможностей обычно не видела в природе, все чаще можно встретить в синтетических пептидных последовательностях. Синтез некоторых неприродных аминокислот часто включает в себя использование предшественника, состоящий из Schiff-основания, стабилизированного катионом никеля. Неприродные боковые цепи могут быть установлены на основной цепи аминокислоты, найденного в этом Шифф-основного комплекса. В результате неестественно аминокислота, то может быть выделена из этого сложного с помощью гидролиза Schiff-основания, как правило, с использованием рефлюкса в сильно кислом растворе. Эти высоко кислотные условия могут удалить кислотно-лабильную боковую цепь защитных групп, необходимые для неестественных аминокислот, которые будут использоваться в СВЧ-помощи твердофазного синтеза пептидов. В этой работе мы представляем эффективный гидролиз и последующую защиту Fmoc аминокислоты, выделенную из базового комплекса Ni-Шифф. Гидролиз условие, представленное в этой работе, является подходящим для сохранения кислотно-лабильных сида цепью защитные группы и могут быть адаптированы к различным неестественных аминокислотных субстратов.
Introduction
Неприродные аминокислоты (UAA) в боковых подшипниках цепь, которые варьируются от тех, из двадцати встречающихся в природе аминокислот, найденных в природе, которые нашли применение в широком диапазоне применений. Синтез этих UAA, однако, может быть трудным в зависимости от структуры боковых цепей и стереохимий аминокислотного остова. СНА активация связи глицина в контексте Шифф-основной комплекс никеля используется для получения различных производных аминокислот , включающими а, р-диаминых кислот 1 и подшипника UAA в фторированном 2 или гетероциклических боковых цепях. 3
После добавления неестественных боковых цепей, функционализированные УАА - х , как правило , удаляются из Шиффа-щелочной комплекса нагревания с обратным холодильником в соляной кислоте 4 и затем выдел ют с помощью ионообменной хроматографии. Хотя в целом эффективным, этот протокол генерируетМина кислота, которые могут быть пригодны для использования в твердофазном синтезе пептидов (SPPS). Природа SPPS требует присутствий кислотно-лабильной боковой цепь защитных групп и сильно кислого характера типичных условий Ni-Шиффового основание разложения предотвращает выделение UAA с этими защитными группами интактных. Насколько нам известно, было сообщено только один метод разложения альтернативы: использование этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и гидразином при повышенных температурах, 5 условий , которые сами по себе не могут быть пригодны для некоторых боковых цепей защитных групп , таких как фталимидов.
Рисунок 1: Синтез Ni-PBP-Gly из Ni 2+, PBP и глицин (Gly). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В данном случае мы приводим способ гидролиза Ni-Шифф-щелочного комплекса с Ni-ПБП-Гли (рисунок 1). Этот комплекс, полученный из Ni 2+, глицин и пиридин-2-карбоновой кислоты (2-бензоил-фенил) -амид (РВР), 6 было продемонстрировано , чтобы быть полезной платформой для синтеза различных UAA и является легко доступен с использованием двухступенчатого пути синтеза. 7 Синтез этого комплекса литература-прецедентов с высоким выходом. 6 Наши результаты описаны ниже демонстрируют применимость условий гидролиза с использованием ЭДТА в умеренно кислых до нейтральных условиях рН , подходящих для использования с UAA в несущей кислотно-лабильной боковой цепи защитных групп. После гидролиза, полученный водный раствор может быть выделен и немедленно подвергает стандартные условия Fmoc - защиты с получением Fmoc-защищенной аминокислоты (рисунок 2).
Рисунок 2: Гидролиз и Fmoc-защита аминокислоты , выделенная из Ni-PBP-Gly. Условия реакции: я. ЭДТА (12 экв), рН 4,5; II. Этилацетат стирки и регулирование до рН 7; III. Fmoc-OSu (1 экв), NaHCO 3 (2 экв). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Гидролиз Ni-Шифф-Base Complex
- Растворите 1 ммоль Ni-ПБП-Шифф-щелочного комплекса в 40 мл N, N - диметилформамид (ДМФ) при перемешивании в 250 мл круглодонную колбу при комнатной температуре.
- Добавить 60 мл 0,2 М водного раствора ЭДТА, рН 4,5.
- С помощью магнитной мешалки и перемешать пластину, перемешать комбинированное решение в течение ночи. По мере того как Шифф-базовый комплекс подвергают гидролизу, цвет будет смещаться от темно-красного до белого.
- После завершения реакции, как указано в отсутствии какого-либо красной окраски, передать реакцию в делительную воронку 250 мл.
- Добавить 50 мл дихлорметана, колпачок делительную воронку, и перемешать. Слить органический мыть в стакан отходов. Повторите эту процедуру три раза, чтобы удалить PBP и любой остаточный никель-ПБП-Шифф-базовый комплекс. Собрать оставшийся водный слой в круглодонную колбу объемом 250 мл.
2. Защита Fmoc гидролизного Аминокислотный
- Добавить 168 мг бикарбоната натрия (2,00 ммоль, 2 экв) к раствору и перемешивают с помощью магнитной мешалки и перемешать пластину.
- Растворяют 337 мг Fmoc - N -hydroxysuccinimide эфир (1,00 ммоль, 1 экв) в минимальном количестве диоксана (примерно 4 или 5 мл) в 10 Мл Виал. Передача этого раствора к водному раствору и перемешивают в течение ночи.
- После выдерживания реакционной смеси перемешиваться в течение ночи, подкисляют полученный раствор до рНа 2 с помощью 1 М соляной кислоты. Проверка рН периодически с использованием тестовых полосок рН.
- Передача реакции в делительную воронку 250 мл и добавляют 50 мл этилацетата. Закрывают делительную воронку, хорошо перемешать, и собирают органический слой в колбу Эрленмейера на 250 мл. Повторите эту процедуру еще два раза, сочетающий в себе органические экстракты. Сушат объединенные органические экстракты с примерно 3 г sulfat магнияе.
- Концентрируют объединенные органические экстракты с использованием роторного испарителя с получением неочищенного Fmoc-защищенной аминокислоты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы предположили , что удаление Ni 2+ из комплекса Ni-ПБП-Gly может позволить эффективный водный гидролиз Шиффа базы без необходимости в суровых условиях рН. Как ЭДТА является недорогим и хорошо изученным хелатирующим агентом, 10 мы предположили , что добавление ЭДТА к раствору Ni-PBP-Gly будет способствовать комплексообразования ионов Ni 2+, способствуя тем самым гидролиз комплекса.
Для того, чтобы проверить нашу теорию, что только ЭДТА может эффективно содействовать гидролиз комплекса, мы подвергли раствор Ni-PBP-Гли в ДМФ при комнатной температуре с увеличением эквивалентов EDTA рН 4,5 водного раствора, Нескорректированный рН водного раствора ЭДТА раствором динатриевой соли , Ход реакции гидролиза можно контролировать с помощью наблюдающего цвета раствора; непрореагировавший Ni-ПБП-К в растворе отображает глубокий красный цвет в то время как изолированный ПБПот этого комплекса является белым. Мы проследили ход реакции гидролиза путем мониторинга изменения цвета раствора от красного до белого (таблица 1). Реакции с участием менее восьми эквивалентов показали некоторый переход окраски от красного до белого, но реакция была неполной в каждом конкретном случае. Никаких изменений цвета не было видно на условиях без ЭДТА.
Влияние рН на гидролиза оценивали аналогичным образом. Покорение комплекса Ni-ПБП-Gly в условиях гидролиза с использованием 12 эквивалентов EDTA в течение ночи с различной рН при комнатной температуре показали успешное гидролиз комплекса происходит в условиях рН в пределах от 4,5 до 7,5. Это демонстрирует гибкость гидролиза EDTA; рН может быть увеличен с учетом более чувствительной к кислоте боковых цепей защитных групп.
| Состояние | рН раствора ЭДТА | Ночь Завершение | |
| 1 | 0 | 4.5 | Никто |
| 2 | 2 | 4.5 | частичный |
| 3 | 4 | 4.5 | частичный |
| 4 | 6 | 4.5 | частичный |
| 5 | 8 | 4.5 | Полный |
| 6 | 10 | 4.5 | Полный |
| 7 | 12 | 4.5 | Полный |
| 8 | 12 | 5.0 | Полный |
| 9 | 12 | 5,5 | Полный |
| 10 | 12 | 6,0 | Полный |
| 11 | 12 | 6,5 | Полный |
| 12 | 12 | 7,0 | Полный |
| 13 | 12 | 7,5 | Полный |
| 14 | 12 | 8,0 | частичный |
Таблица 1: Ni-PBP-Gly Гидролиз условия.
Для того, чтобы убедиться в том, что гидролиз был завершен с использованием наиболее эффективного условие, 7, извлеченный реакционной три раза дихлорметаном, объединяют и сушат органические слои и анализировали получаемый в результате остаток с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР-спектр показал никаких признаков Ni-PBP-К в образце; единственные резонансы найдены в спектре соответствуют отчетам литературы PBP, предлагая полный гидролиз комплекса.
Мы исследовали осуществимость наших оптимальных условиях гидролиза с аминокислотами, содержатING ряд боковых цепей защитных групп. Образцы Fmoc-L-глутаминовая кислота 5 - трет - бутиловый эфир (Fmoc-Glu (т Bu) -ОН), Fmoc - O - трет - бутил-L-треонин (Fmoc-Thr (т Bu) -ОН), Fmoc- - O - трет - бутил-L-тирозина (Fmoc-Tyr (т Bu) -ОН) и Н (в) -Boc- N α -Fmoc-L-триптофан (Fmoc-Trp (Boc) -OH) растворяли в ДМФ и подвергают гидролизу при комнатной температуре с использованием 12 эквивалентов ЭДТА при рН 4,5. После того, как оставляли перемешиваться в течение ночи, растворы экстрагируют дихлорметаном и анализировали с помощью ЯМР. Представитель ЯМР включен для Fmoc-Glu (TBU) -ОН (рисунок 3). В каждом случае, спектральные данные показали полное удержание боковой цепи защитных групп. 11, 12, 13
Кислотно-лабильной боковой цепь защитной группа выделяются с синей коробкой. Закругленные значения интегрирования для сигналов протонов этого соединения включены в скобках. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
После гидролиза и органической экстракции, оставшийся водный слой содержит свободную аминокислоту вместе с остаточным ЭДТОМ и ионами Ni 2+. Для того, чтобы гарантировать , что присутствие этих веществ не будет мешать последующой Fmoc защиты свободной аминокислоты, мы провели реакцию тестового путем растворения глицина в водных растворах , содержащих ионы ЭДТА и Ni 2+ с концентрацией , похожей на вход гидролиза 7. Wе затем подвергают этот раствор в стандартной водной защиты Fmoc. 8 После завершения реакции и обработки, мы определили реакцию , обеспечиваемой выход Fmoc-защищенный глицина на 25%. Этот процент выхода не удивительно , принимая во внимание концентрацию разбавленного реакции и предполагает , что присутствие ионов Ni 2+ и ЭДТА не мешают стандартной реакции защиты Fmoc.
С доказательствами, подтверждающими, что каждый отдельный компонент нашей методологии (гидролиз, выделение свободной аминокислоты, и Fmoc) защиты осуществим, мы провели эксперимент доказательства правильности концепции с использованием Ni-PBP-К. Мы оценивали жизнеспособность в условиях гидролиза , описанных выше , и последующее Fmoc - защиту с использованием стандартного протокола 8 с получением Fmoc-защищенной аминокислоты в разумной доходности. К перемешиваемому раствору Ni-PBP-Gly (404 мг, 0,971 ммоль, 1 экв) в 40 мл ДМФ при комнатной температуреerature добавляли 0,2 М раствор ЭДТА при рН 4,5 (65 мл, 13 ммоль, 13 экв). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение ночи и затем промывают четыре раза дихлорметаном. Водный слой доводили до рН 7 с помощью твердого бикарбоната натрия. К водному слою добавляют бикарбонат натрия (163 мг, 1,93 ммоль, 2 экв) и Fmoc-OSu (327 мг, 0,971 ммоль, 1 экв), растворенного в минимальном количестве диоксана. Реакционная смесь оставляли перемешиваться в течение ночи и затем подкисляют с помощью 1 М соляной кислоты и экстрагируют три раза этилацетата. Органические экстракты объединяли, промывали шесть раз солевым раствором, концентрируют, сушат над сульфатом магния и высушивали под вакуумом с получением смеси непрореагировавшего Fmoc-OSu и Fmoc-Gly-OH (160 мг, 0,540 ммоль, выход 54%). Спектральные данные -ий ранее опубликованные спектры для Fmoc-Gly-OH. 9 Этот последний эксперимент указывает на то, что это возможно , чтобы изолировать свободный глицин от никель-ПБП-Гли комплекс и нести его вперед к его Fmoc-Protected форма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный выше, является полезным в его способности, чтобы облегчить выделение магистрали аминокислоты из никель-Шифф-щелочного комплекса в мягких условиях рН и последующей защиты Fmoc этой изолированной аминокислоты через две критические шаги. Первый этап включает перемешивание ДМФА / воду раствора, содержащий ЭДТ, чтобы облегчить высвобождение аминокислоты из комплекса. Остаточные сложные или органические побочные продукты могут быть легко удалены с извлечением. Второй шаг этого протокола включает в себя защиту Fmoc аминокислоты, найденной в водном слое после выделения путем экстракции на первой стадии. Мы продемонстрировали способность модифицировать эту процедуру в диапазоне рН 4.5-7.5, что позволяет значительную гибкость, которые могут быть необходимы для некоторых защитных групп рН-чувствительных боковой цепи.
Одним из потенциальных ограничений этого метода является низкой концентрацией реакции защиты Fmoc изолированной аминокислоты. Как облегчающего еfficient гидролиз требует несколько эквивалентов EDTA относительно субстрата, условие реакции требует значительного количество водного раствора ЭДТА (60 мл для реакции на 1 ммоль масштаба). Используя этот объем растворителя в Fmoc защиты приводит к относительно низкой (~ 0,015 М) концентрации реагентов. В то время как реакция доказательства правильности концепции, используя эти условия, предоставляемых продукт в перспективном с выходом 55%, несмотря на условиях реакции разбавленной, может быть необходимо увеличить эту концентрацию при использовании аминокислоты с пониженной nucleophilicty по отношению к глицину в результате повышенного стерического объема.
Таким образом, мы показали полезность ЭДТА, чтобы способствовать гидролизу базового комплекса Ni-Шифф, как правило, используется для синтеза УАА-х. Эти условия гидролиза не требуют сильно кислых услови х, типичных для этих гидролизатов, что позволяет удержанию кислотно-лабильной боковой цепи защитных групп. Дальнейшие эксперименты должны быть направлены на применение тего общая стратегия различных неестественных аминокислотных субстратов. Работа в этом направлении продолжается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование предусмотрено Скользкий Рок университета. Мы хотели бы поблагодарить Т. бора III (Скользкий Рок университет) и C Хани (Университет Пенсильвании) за их идеи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
