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Biochemistry

फास्फोरिलेशन साइट निर्धारण के लिए ओलिगोपेप्टाइड प्रतियोगिता परख

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55708
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, 2College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

Summary

पेप्टाइड प्रतियोगिता एशेज का व्यापक रूप से आणविक और इम्यूनोलॉजिकल प्रयोगों में उपयोग किया जाता है। यह पत्र एक इन विट्रो ऑलिगोपेप्टाइड प्रतिस्पर्धा कीजिंग परख और संबंधित सत्यापन प्रक्रियाओं के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करता है, जो विशिष्ट फास्फोरेट्रेशन साइटों को खोजने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Abstract

विशिष्ट साइटों पर प्रोटीन फॉस्फोरेलेशन, अन्य अणुओं के साथ इसकी रचना और संपर्क निर्धारित करता है। इस प्रकार, प्रोटीन फास्फोराइलेशन सेल के जैविक कार्यों और विशेषताओं को प्रभावित करता है। वर्तमान में, फास्फोराइलेशन साइटों की खोज के लिए सबसे सामान्य तरीका तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / एमएस) विश्लेषण, एक तेज़ और संवेदनशील तरीके से है हालांकि, फ्रैगमेंटेशन चरण के दौरान अपेक्षाकृत लैबल फॉस्फेट मोएटिज़ अक्सर फॉस्फोपेप्टाइड से जारी होते हैं, जो प्रायः झूठे नकारात्मक संकेत देते हैं। ऐसे मामलों में, साइट-निर्देशित म्यूटेंट का उपयोग करते हुए इन विट्रो किनेज परख में पारंपरिक रूप से अधिक सटीक होगा, लेकिन यह विधि श्रमसाध्य और समय-उपभोक्ता है। इसलिए, पेप्टाइड प्रतियोगिता का उपयोग कर एक वैकल्पिक तरीका लाभप्रद हो सकता है। 5 'एडेनोसिन मोनोफोस्फेट-सक्रिय प्रोटीन कीनेज (एएमपीके) की आम सहमति मान्यता वाले प्रारूप 1 की स्थापना की गई है और इसे स्थैतिक स्कैनिंग पेप्टाइड लाइब्रेरी गधे का उपयोग करके मान्य किया गया है।ए 2 इस प्रकार, एक उपन्यास सब्सट्रेट के लिए एएमपीके फास्फोराइलाशन साइट पेप्टाइड प्रतियोगिता एशेज द्वारा अनुमानित और पुष्टि की जा सकती है। इस रिपोर्ट में, हम एएमपीके-मध्यस्थता वाले परमाणु कारक इरिथोड 2-संबंधी कारक 2 (एनआरएफ 2) फास्फोराइलेशन के उदाहरण के लिए इन विट्रो ऑलिगोपेप्टाइड-प्रतिस्पर्धी किनेज परख के विस्तृत चरणों और प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। फॉस्फोरायलेशन साइट को प्रमाणित करने के लिए, हमने एक साइट-विशिष्ट उत्परिवर्ती का उपयोग करते हुए इन विट्रो किनेज परख में अनुक्रमित किया। कुल मिलाकर, पेप्टाइड प्रतियोगिता परख कई संभावित फॉस्फोराइलेशन साइटों को स्क्रीन करने और फॉस्फोरायलेशन साइट म्यूटेंट द्वारा मान्यता के लिए साइटों की पहचान करने के लिए एक विधि प्रदान करता है।

Introduction

किसी विशिष्ट अवशेष पर प्रोटीन फॉस्फोरेलेशन, सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, सिग्नलिंग नेटवर्क की समझ के लिए विशिष्ट फास्फोरेटेशन साइटों की पहचान की आवश्यकता होती है इसके अलावा, फास्फोराइलेशन साइट प्रोटीन फ़ंक्शन पर प्रभाव को निर्धारित करती है क्योंकि प्रोटीन के भीतर अलग-अलग डोमेन विभिन्न संरचनाओं और कार्यों के पास होते हैं। परमाणु कारक एरीथोड 2-संबंधी कारक 2 (एनआरएफ 2) की गतिविधि, एक महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट प्रतिलेखन कारक, द्वि-दिशात्मक रूप से विभिन्न साइटों पर फॉस्फोरेलेशन के माध्यम से विनियमित होती है। हमारे अध्ययन ने किनास पर ध्यान केंद्रित किया है जो एनआरएफ 2 के फास्फोरायलेशन को उत्प्रेरित करता है। ऑक्सीडेटिव चुनौती के खिलाफ एनआरएफ 2 की तनाव प्रतिक्रिया तेजी से होती है, मुख्य रूप से सीरिन 40 में फास्फोरियम के माध्यम से होती है और प्रोटीन कीनेस सी (पीकेसी) -डी द्वारा मध्यस्थता होती है, जो एनआरएफ 2 3 , 4 को सक्रिय करती है। इसके विपरीत, फ़िन ने टायरोसिन 5 पर एनआरएफ 2 के निरोधात्मक फास्फोरायलेशन का उत्प्रेरित किया हैगतिविधि के तंग नियंत्रण के लिए 68

फास्फोरिलेशन साइटों को खोजने के लिए सबसे आम तरीका तरल क्रोमैटोग्राफी / जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / एमएस) विश्लेषण है। रैपिड और अत्यधिक संवेदनशील फास्फोराइलेशन साइट मैपिंग डेटा इस तरह से उत्पन्न किया जा सकता है; हालांकि, इसमें कई तकनीकी सीमाएं हैं, जो अक्सर झूठे नकारात्मक संकेत उत्पन्न करती हैं। एलसी / एमएस विश्लेषण में अक्सर गरीब अनुक्रम कवरेज होता है Phosphorylation साइटों की पहचान करने के लिए, प्रोटीन की अधिकतम अमीनो एसिड कवरेज की जानकारी आवश्यक है 6 पाचन चरण के दौरान कई प्रोटीज़ के साथ ब्याज की प्रोटीलाइज़िस अनुक्रम कवरेज को सुधारने में मदद से हो सकता है। फॉस्फोरायलेशन अवशेषों की पहचान के लिए एक और बाधा फॉस्फोरिक एसिड की सहज हानि है जिसे अक्सर सेरीन और थ्रेऑनिन-फास्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स 6 , 7 के लिए देखा जाता है । लैबिल फॉस्फेट मोएटियां अक्सर होती हैंविखंडन प्रक्रिया के दौरान फॉस्फोपेप्टाइड से जारी 7 दूसरा विकल्प जब फास्फोरिलेशन साइटों के लिए खोज पेप्टाइड माइक्रोएरे विधि का उपयोग कर रहा है। ब्याज की एक प्रोटीन से प्राप्त पेप्टाइड टुकड़े वाले माइक्रोएरे चिप का उपयोग करके किनेज लक्ष्य साइटों के लिए स्क्रीन संभव है। हालांकि, माइक्रोएरे चिप के उत्पादन और पता लगाने के लिए उपकरण की आवश्यकता के कारण, पेप्टाइड माइक्रोएरे विधि को समय लेने और महंगी माना जाता है।

इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, एक इन विट्रो ऑलिगोपेप्टाइड-प्रतिस्पर्धी किनेज परख का उपयोग एक ज्ञात मान्यता प्रमेय के साथ एक प्रोटीन किनेज के लिए किया जा सकता है। अगर एक किनेज की आम सहमति मान्यता वाले प्रारूप की स्थापना की जाती है, तो एक उम्मीदवार सब्सट्रेट की ब्योरात्मक फास्फोरेटेशन साइटें भविष्यवाणी की जा सकती हैं, और साइट की प्रामाणिकता मान्य की जा सकती है। इस प्रक्रिया के लिए सबसे ठोस तरीका एक उत्परिवर्ती प्रोटीन में फास्फोरायलेशन का उन्मूलन दिखा रहा है जिसमें भविष्यवाणीडी अवशेषों को गैर-फॉस्फोरेलेटलेट अमीनो एसिड ( यानी, सेरीन या थ्रेऑनिन से अलैनिन, फेरोलाइलिनिन के लिए टाइरोसिन) के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। हालांकि, उत्परिवर्ती प्रोटीन का उत्पादन और अलगाव समय-उपभोक्ता है। अनुसंधान के प्रारंभिक चरण में एक विकल्प के रूप में प्रतिस्पर्धी पेप्टाइड कीनेस परख सरल और सुविधाजनक है। यहां, हम इन विट्रो पेप्टाइड प्रतियोगिता परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और फॉस्फोराइलेशन साइट के सत्यापन के लिए।

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Protocol

1. सुरक्षा

सावधानी: एएमपीके की गतिविधि का आकलन करने के लिए यह प्रोटोकॉल [γ- 32 P] -ATP का उपयोग करता है फास्फोरस -32 एक रेडियोधर्मी आइसोटोप है, जो बड़े पैमाने पर बीटा विकिरण उत्सर्जित है। चूंकि बीटा कण का आकार बहुत छोटा है, इसलिए यह आसानी से कपड़े और त्वचा को घुसना कर सकता है। बीटा विकिरण के लिए दोनों बाहरी और आंतरिक जोखिम मानव स्वास्थ्य के लिए हानिकारक हो सकता है, जिसमें त्वचा के जलने और ऊतक क्षति हो सकती है।

  1. ऐसे सभी कदम उठाएं जिनको उचित संरक्षण, जैसे ऐक्रेलिक परिरक्षण के उपयोग के [γ- 32 P] -ATP के उपयोग की आवश्यकता होती है।
  2. सुनिश्चित करें कि सभी कर्मियों को इलेक्ट्रॉनिक प्रक्रियाओं के दौरान हानिकारक विकिरण के जोखिम की निगरानी करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक व्यक्तिगत डोजिमीटर (ईपीडी) से लैस हैं।
  3. उचित प्रशिक्षण और नियामक अनुमोदन के बाद ही ओपन सोर्स विकिरण को संभाल लें।
    नोट: यहां, सोल राष्ट्रीय यूनिवर्स में ओपन सोर्स विकिरण प्रयोग पर प्रशिक्षण पूरा करने के बाद सभी प्रयोग किए गए थेकोरियाई सरकार की मंजूरी और अनुमोदन (nssc.go.kr/nssc/en)
  4. स्थानीय नियमों के अनुसार रेडियोधर्मी कचरे का निपटान
    नोट: यहां, सोल नेशनल यूनिवर्सिटी के पर्यावरण संरक्षण एवं सुरक्षा संस्थान के निर्देशों का पालन किया गया। संयुक्त राज्य अमेरिका और यूरोपीय देशों में अनुवर्ती नियामकों की एक सूची है: संयुक्त राज्य अमेरिका, संयुक्त राज्य अमेरिका परमाणु नियामक आयोग (http://www.nrc.gov/); यूनाइटेड किंगडम, स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यकारी (एचएसई) (http://www.hse.gov.uk); फ्रांस, ऑटोरिटे डे साउरेेट न्यूक्लेयर (https://www.asn.fr/); और जर्मनी, पर्यावरण, प्रकृति संरक्षण, भवन और परमाणु सुरक्षा (बीएमयू) (http://www.bmu.de) के लिए संघीय मंत्रालय।

2. विट्रो प्रतिस्पर्धी किनास परख में

  1. प्रतियोगी पेप्टाइड्स का निर्माण
    1. एएमपीके द्वारा सर्वसम्मति से फॉस्फोरिलेटेड मित्सुम निर्धारित करें।
      नोट: एएमपीके आम सहमति तत्व को पहचानता है,# 934; - [X, β] -XX-सेर / Thr-XXX-Φ। आम सहमति अनुक्रम में, Φ हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिड ( यानी, वेलिन [वी], लेउसीन [एल], मेथियोनिन [एम] और आइसोल्यूसिइन [आई]) का प्रतिनिधित्व करता है और बीओ ने मूल एमिनो एसिड ( यानी, लाइसिन [के], एर्जिनिन [ आर], और हिस्टीडाइन [एच] 1
    2. उपरोक्त आम सहमति आकृति के अनुसार लक्ष्य अनुक्रमों से सेरीन या थ्रेऑनिन अवशेषों का चयन करें। मानव एनआरएफ 2 (# 1, 148-157 जिसमें सर्प 153; # 2, 330-33 9 जिसमें सर्प 335; और # 3, 553-562 जिसमें सर्मान 558 शामिल हैं) 8 का प्रयोग करें ।
    3. व्यावहारिक रूप से 10-अवशिष्ट पेप्टाइड्स को संश्लेषित करते हैं, जो कथित साइटों की नकल करते हैं। संश्लेषित उत्पाद को प्रत्येक पेप्टाइड के 98% से अधिक शुद्धता के साथ एक लैओफिलाइज्ड पाउडर के रूप में प्राप्त करें।
    4. 71.667 ग्रा / एल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक किनेस बफर का उपयोग करके पेप्टाइड्स को भंग करें। यदि पेप्टाइड एक किनेज बफर में घुलनशील नहीं है, तो इसे 20% डीएमएसओ में भंग कर दें। यदि यह अघुलनशील रहता है, तो एक पेप्टाइड डाल कर नकल की नकल कर रहा हैआनुवंशिक साइट को विलेयता बढ़ाने के लिए बढ़ाया जा सकता है
  1. विट्रो प्रतिस्पर्धी एएमपीके किनास परख में
    1. 5 × किनेज बफर तैयार करें: 100 मिमी एचईपीईएस, पीएच 7.4; 25 मिमी एमजीएल 2 ; 5 मिमी ईजीटीए; 5 मिमी डीटीटी; 125 मिमी β-ग्लिसरॉफॉस्फेट (सीरन / थ्रेओनिन फॉस्फेटस अवरोधक); 5 एमएम ना 3 वीओ 4 (टाइरोसेन फॉस्फेटस अवरोधक); 0.5% (वी / वी) प्रोटेस अवरोधक कॉकटेल सेट III, 1 एमएम शीत एटीपी; और 500 माइक्रोन एएमपी
      नोट: एएमपी एएमपीके गतिविधि का परीक्षण करने के लिए किनेज बफर का एक अनिवार्य घटक है। बफर का उपयोग सीरिन / थ्रेऑनिन केनसेस और टाइरोसिन कीइनासेस दोनों की गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है।
    2. बर्फ पर निम्न पुनः संयोजक प्रोटीन और सिंथेटिक पेप्टाइड्स को पिघलना: एएमपीके; Nrf2; और ओलिगोपेप्टाइड # 1, # 2, और # 3
    3. बर्फ पर प्रतिक्रिया बफर तैयार करें: 0.15 μg एएमपीके, 0.4 μg एनआरएफ 2 (~ 4 pmol), 0.43 मिलीग्राम ओलिगोपेप्टाइड (~ 300 एनएमएल), और 6 μL 5 × किनेज बफर। एबाँझ डिस्टिल्ड वॉटर (डीडब्ल्यू) के साथ अंतिम मात्रा में 30 μL को खराब करें।
      नोट: प्रतिक्रिया बफर तैयार करने के बाद [γ- 32 P] -ATP के अलावा kinase autophosphorylation के कारण रेडियोधर्मी संकेत को कम कर सकते हैं।
  2. रिएक्टेंट्स चलाना
    नोट: नीचे की सभी प्रक्रियाओं को ऐक्रेलिक ढाल, रैक, या ब्लॉक, साथ ही उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ सुरक्षा के तहत किया जाना चाहिए।
    1. प्रयोग शुरू करने से पहले हीटिंग ब्लॉक्स को 30 डिग्री सेल्सियस सेट करें।
    2. बर्फ पर प्रतिक्रिया ट्यूबों के 1 μL [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) जोड़ें प्रतिक्रिया बफर को कई बार pipetting और नीचे दबाएं।
      नोट: 32 पी की रेडियोधर्मिता लगभग 14 दिन 9 की छोटी आधा जीवन है आधे जीवन पर विचार करके मात्रा समायोजित करें ( जैसे, [γ- 32 P] -ATP के उत्पादन से एक महीने के बाद, 4 μL [γ- 32 P] जोड़ें-एटीपी 1 μCi बनाने के लिए)
    3. 15-30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक में नमूना सेते इस चरण के दौरान, 7.5% सोडियम डाइडेस्किल सल्फेट-पॉलीएक्लीमाइड जेल वैद्युतकणसंच (एसडीएस पृष्ठ) जैल तैयार करें। लक्ष्य प्रोटीन के आकार के अनुसार जेल का प्रतिशत समायोजित करें।
    4. 3 μL 10 × एसडीएस नमूना बफर (10% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 20% (डब्लू / वी) एसडीएस, 15.42% (डब्ल्यू / वी) डायथोथरेइटॉल, 90% (वी / वी) 0.5 से जोड़कर कीनीज प्रतिक्रिया को रोकें एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8), और 0.02% (वाय / वी) ब्रोमोफिनॉल नीला)। प्रतिक्रिया बफर को कई बार pipetting और नीचे दबाएं।
    5. नमूनों को 7.5% एसडीएस-पेज जेल में 70 वी के लिए 20 मिनट में चलाएं और लगातार 140 वी के लिए 1 घंटे में चलाएं।
      नोट: जेल के अंत में ब्रोमोफिनॉल नीली रेखा में अत्यधिक उच्च रेडियोधर्मी संकेत होते हैं पृष्ठभूमि संकेतों को कम करने के अगले चरण पर जाने से पहले जेल को नीली रेखा से नीचे हटाने की सिफारिश की जाती है।
    6. एसडीएस पृष्ठ के बाद, धीरे से ढलाईकार से जेल निकाल दें एक ग्लास टी में जेल रखेंअगले चरण के लिए यू।
    7. फिक्सेशन बफर के साथ 20 मिनट (50% मेथनॉल और 10% हिमनदों एसिटिक एसिड) के साथ जेल को ठीक करें।
    8. धीरे से जेल को फिल्टर पेपर पर ले जाएं और इसे पारदर्शी आवरण के साथ कवर करें। ध्यान दें कि जेल इस चरण में आसानी से फाड़ा जा सकता है। 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम जेल ड्रायर के साथ जेल सूखी
  3. दृश्य
    1. जेल को या तो एक फॉस्फोर स्क्रीन या एक एक्स-रे फिल्म रातोंरात (आमतौर पर लगभग 16 घंटे) के लिए प्रकट करें।
      नोट: अति-उज्ज्वल प्रकाश के संपर्क के बाद एक फॉस्फोर स्क्रीन का पुन: उपयोग किया जा सकता है। जब एक एक्स-रे फिल्म का उपयोग किया जाता है, तो दो दिनों में जेल का पर्दाफाश करें एक्स-रे फिल्मों में फॉस्फोर स्क्रीन की तुलना में कम संवेदनशीलताएं हैं।
    2. फॉस्फोर इमेजर के साथ फॉस्फोर स्क्रीन स्कैन करें छवि को उच्च-रिज़ॉल्यूशन TIFF या बिटमैप फ़ाइल के रूप में निर्यात करें
    3. विज़ुअलाइज़ेशन के बाद, जेल को एक ग्लास या प्लास्टिक कंटेनर को कॉमेसी ब्रिलियंट नीले (सीबीबी) धुंधला के लिए ले जाएं
    4. डीडब्ल्यू के साथ जेल धो लें डीडब्ल्यू छोड़ दें और दाग डालना1 घंटे के लिए धुंधला अभिकर्मक के साथ ई जेल
    5. अभिकर्मक को त्याग दें और 1 घंटे या रात भर के लिए डीडब्ल्यू के साथ जेल को नष्ट करें। एक कार्यालय स्कैनर के साथ स्कैन करने के लिए पारदर्शी प्लास्टिक की फिल्मों (या समतुल्य) के बीच जेल रखें।

3. साइट-विशिष्ट उत्परिवर्ती का उपयोग करते हुए विट्रो किनेसे परख में

  1. पीजीईएक्स-एनआरएफ 2 के साइट-डायरेक्ट म्यूटगेनेसियस
    1. मुगीय प्राइमर डिजाइन
      नोट: उत्परिवर्तजन के सफल परिणाम के लिए उचित उत्परिवर्ती प्राइमरों को डिजाइन करना महत्वपूर्ण है। Mutagenic प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए निम्नलिखित कुछ विचार हैं प्राइमर के मध्य में वांछित उत्परिवर्तन के साथ 25 से 45 कुर्सियां ​​बनाकर प्राइमर बनाएं। प्राइमर में 40-60% जीसी सामग्री होनी चाहिए और एक या एक से अधिक जी या सी कुर्सियां ​​समाप्त होनी चाहिए। सुनिश्चित करें कि प्राइमर का टी मीटर , सूत्र के अनुसार 78 डिग्री सेल्सियस या उससे अधिक के बराबर है [टी एम = 81.5 + 0.41 (% जीसी) - (675 / बेस की लंबाई) -% बेमेल]।
      नोट: इस को शुद्ध करेंप्राइमर क्योंकि इसकी शुद्धता उत्परिवर्तन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। Mutagenic प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए कई वेबसाइटें हैं
      1. "साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन के लिए प्राइमरों को डिजाइनिंग" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp) के लिए प्राइमर डिजाइन कार्यक्रम खोलें
      2. मानव एनआरएफ 2 डीएनए अनुक्रम (एक्सेस नंबर एनएम_006164.4) चिपकाएं और "अनुवादित अनुवाद करें" बटन का चयन करें।
      3. अनुवादित अमीनो एसिड अनुक्रम से सेरीन 558 अवशेषों को एलानिन में बदलना चुनें। उत्परिवर्तक प्राइमर का प्रयोग करना, एडीसी से जीसीसी तक सेरीन के लिए कोडन को अलैनिन के लिए स्थानापन्न करना।
      4. प्राइमर लंबाई, टी एम , और जीसी सामग्री पर विचार करें।
        नोट: उत्परिवर्तक प्राइमर को आखिरकार 5'-सीटीएक्टगाआआआकाटेक जीसीसी एसीटीटीटीटक्टकागैग -3 'के रूप में बनाया गया है।
    2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करते हुए उत्परिवर्ती Strand संश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया
      1. बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: 10 × प्रतिक्रिया बफर, 50 एनजी कापीजीईएक्स-जीएसटी-एनआरएफ 2, 125 एनजी ऑफ़ फॉरवर्ड प्राइमर, 125 एनजी रिवर्स प्राइमर, 1 एनएलटीपी डीएनटीपी मिश्रण (10 एमएम प्रत्येक), 2.5 यू पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ और बाँझ डीडब्ल्यू 50 आईएल तक है।
      2. निम्न साइक्लिंग कार्यक्रम के साथ पीजीईएक्स-जीएसटी-एनआरएफ 2-उत्परिवर्ती भूग्रस्त संश्लेषण के लिए पीसीआर चलाएं: 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र; 30 चक्रों के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 18 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 90 डिग्री पर 68 डिग्री सेल्सियस पर; और 1 चक्र में 5 डिग्री के लिए 68 डिग्री सेल्सियस
        नोट: प्लाज्मिड लंबाई के आधार पर, साइक्लिंग मापदंडों को बदला जा सकता है।
      3. अगले चरण के लिए रिएक्टेंट को शांत करने के लिए इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। वैकल्पिक रूप से, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
    3. डीपीएन मैं पाचन और एक उत्परिवर्ती प्लाज्मिड का चयन
      1. ठंडा करने के बाद प्रत्येक रिएक्टेंट के लिए 1 μL डीपीएन I प्रतिबंध एंजाइम (10 यू / μ एल) जोड़ें। 1 मिनट के लिए पिपेटिंग और अपकेंद्रित्र द्वारा अच्छी तरह से और हल्का मिक्स करें
      2. 37 डिग्री सेल्सियस से 2 घंटे के लिए पैतृक पीजीईएक्स-जीएसटी-फंसे डीएनए
      3. धीरे से बर्फ पर DH5 α सुपर कॉम्प्टेंट कोशिकाओं को पिघलना
      4. 150 μL पूर्व-ठंडा DH5 α सुपर कॉम्प्टेंट कोशिकाओं के लिए 50 μL रिएक्टर को जोड़ें और कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते रहें।
      5. ट्यूबों को हीटिंग ब्लॉक में 42 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित करें और उन्हें 90 एस के लिए छोड़ दें। उन्हें 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें
      6. ट्रांसफॉर्मेड DH5 α कोशिकाओं को पूर्व गर्म लैज़ोजेनी शोरबा (एलबी) जोड़ें और 180 आरपीएम पर मिलाते हुए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते।
      7. एलबी-एम्पीसिलीन आगर प्लेट्स पर परिवर्तित कोशिकाओं को फैलाने और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
        नोट: प्लाज्मिड GEX-GST-Nrf2 के एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर के बाद एम्पीसिलीन का उपयोग किया जाता है। उत्परिवर्तित प्लाज्मिड के प्रतिरोध मार्कर के आधार पर उचित एंटीबायोटिक का प्रयोग करें।
      8. प्लेट से एक ही कॉलोनी को चुनें, उसे 5 एमएल एलबी-एम्पीसिलीन से स्थानांतरित करें, और रात भर इसे 37 आरएफपी पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।Mutagenic अनुक्रम के सत्यापन के लिए, कम से कम तीन कालोनियों का मूल्यांकन करें।
      9. डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के लिए एक डीएनए मिनिप्रेप किट का प्रयोग करके डीएनए निकालें; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें
      10. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक स्वचालित डीएनए अनुक्रम विश्लेषक का उपयोग कर mutagenic डीएनए दृश्यों की पुष्टि करें। उत्परिवर्ती अनुक्रमों के सत्यापन के लिए डीएनए निर्माण के कम से कम 200 एनजी का उपयोग करें।
  2. पुनः संयोजक जीएसटी- एनआरएफ 2 प्रोटीन की शुद्धि
    1. Escherichia कोलाई में मुगीजनिक ​​जीएसटी-एनआरएफ 2 फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति
      1. बीएल 21 कोशिकाओं में उत्परिवर्तक पीजीईएक्स-जीएसटी-एनआरएफ 2 प्लाज्मिड को बदलना। एक एकल कॉलोनी को 25 मिलीलीटर एलबी ब्रोस्ट में एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त और एक 37 डिग्री सेल्सियस पर चक्कर पर रातोंरात रखना।
      2. 1: 100 कमजोर पड़ने अनुपात में 100 मिलीग्राम / एमएल युक्त एम्बीसीलिन युक्त 100 मिलीलीटर एलबी ब्रोथ में सुसंस्कृत कोशिकाओं को टीका डालना।
      3. एक घूर्णन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैंया जब तक 600 एनएम पर absorbance 0.4-0.8 (लगभग 4 घंटे) के आसपास पहुंचता है।
      4. 1 एमएम आईपीटीजी की अंतिम एकाग्रता तैयार करने के लिए 100 एमएल की सुसंस्कृत कोशिकाओं में 100 एमएल का 1 एम आईपीटीजी जोड़ें।
      5. प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 6 घंटे या रात भर के लिए एक रोटेटर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
      6. कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 5,000 xg में अपकेंद्रित्र और 1 मिलीलीटर जीवाणु यौगिक बफर (25 मिमी एचईपीईएस, 5 एमएम EDTA, 2 एमएम डीटीटी, 0.1% CHAPS, 1 माइक्रोग्राम / एमएल पेर्स्टैटिन, 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल लियूप्टीन युक्त सेल छर्रों को पुन: और 1 मिमी पीएमएसएफ) बर्फ पर
      7. अधिकतम विद्युत उत्पादन के 50% में 2 मिनट के लिए 2-अंतराल के साथ एक अल्ट्रासोनिक होमोजीनजर का उपयोग करके सेल छर्रों को ल्यूस करें।
      8. कोशिकाओं को 12,000 × छ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
    2. पुनः संयोजक जीएसटी- एनआरएफ 2 प्रोटीन की शुद्धि
      1. 200 μL 50% (वी / वी) ग्लूटाथिऑन-एगरोज मोती तैयार करें और 1 एमएल पीबीएस (पीएएच 7.3; 140 एमएम NaCl, 2.7 एमएम केएलएल, 10 एमएम ना 2 ) के साथ धो लें। 4 , और 1.8 एमएम केएच 2 पीओ 4 )। 1 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंटीफ्यूगेशन द्वारा मोती लीजिए वाशिंग चरण को तीन बार दोहराएं
      2. सेल lysate को 50% (v / v) ग्लूटाथिऑन-agarose मोती के तैयार 200 μL में जोड़ें और 2 घंटे के लिए अंत-ओवर-एंड रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर लें।
      3. 1 मिनट के लिए 500 ग्राम में सेंटीफ्यूगेशन द्वारा जीएसटी-एनआरएफ 2 प्रोटीन के साथ मिलकर ग्लूटाथियोन-एगरोज मोती लीजिए। 31 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को निकालें
      4. 1 एमएल ऑफ पीबीएस (पीएएच 7.3) के साथ मोती धो लें, जैसा चरण 1 में है।
      5. जीएसटी-एनआरएफ 2 के साथ संयुक्त ग्लूटाथियोन-एगरोज मोती को 500 माइक्रोन का एल्यूशन बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल और 10 एमएम कम ग्लूटाथियोन, पीएच 8.0) जोड़ें। 30 मिनट के लिए अंत-ओवर-एंड रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं
      6. 1 मिनट के लिए 500 xg पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
      7. दोपहर में 300 μL अलौकिक बफर को मोती और दोहराएं 3.2.2.5-3.2.2.6 दोहराएं।
    3. शुद्ध जीएसटी- एनआरएफ 2 प्रोटीन की पुष्टि
      1. प्रोटीन मात्रा के 0.5 μg मानक प्रोटीन बीएसए के साथ दृश्य के लिए नमूने के 5 μL तैयार करें।
      2. नमूनों को 7.5% एसडीएस-पेज जेल में 70 वी के लिए 20 मिनट में चलाएं और फिर 140 मिनट के लिए 60 मिनट में चलाएं।
      3. 2 घंटे और डिस्टिन (30 एमएल मिथेनॉल के लिए 0.1% सीबीबी स्टेनिंग समाधान (0.1 जीबी सीबीबी आर 250, 40 एमएल का 99% मेथनॉल, 10 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड, और 50 एमएल ऑफ डिस्टिलेटेड एच 2 ओ) के साथ जेल, 10 एमएल ग्लैशीय एसिटिक एसिड, और 60 एमएल ऑफ डिस्टिल्ड एच 2 ओ) जब तक बैंड स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देता।
      4. फिल्टर पेपर पर नियत जेल रखें और एक पारदर्शी आवरण के साथ कवर करें। 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम जेल ड्रायर के साथ जेल सूखी
      5. इन विट्रो एएमपीके किनेज परख के लिए डेंसिटोमेट्री के साथ उत्परिवर्ती जीएसटी-एनआरएफ 2 प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
  3. साइट-विशिष्ट उत्परिवर्ती के साथ विट्रो एएमपीके गतिविधि परख में
    नहींई: इन विट्रो एएमपीके कीइनेस परख 2.2-2.4 के चरणों के अनुसार किया जाता है, 0.4 माइक्रोग्राम शुद्ध वाइल्डटीपी जीएसटी-एनआरएफ 2 या जीएसटी-एनआरएफ 2-एस 558 ए उत्परिवर्ती पेप्टाइड इनहिबिटर्स के बिना। चरण 1 में वर्णित सभी विकिरण सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।
    1. बर्फ पर एक प्रतिक्रिया बफर 0.15 माइक्रोग्राम एएमपीके के साथ, 0.4 माइग्रेटर उत्परिवर्ती या जंगली जीएसटी-एनआरएफ 2, और 6 μL 5 किनेज बफर के साथ तैयार करें। बाँझ डीडब्ल्यू के साथ 30 μL भरें।
    2. बर्फ पर प्रतिक्रिया ट्यूबों के 1 μL [γ- 32 P] -ATP (1 माइक्रोग्राम / μL) जोड़ें कई बार और अपकेंद्रित्र pipetting द्वारा प्रतिक्रिया बफर मिक्स
    3. नमक को 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट तक हीटिंग ब्लॉक में सेते हैं
    4. 3 μL 10 × एसडीएस नमूना बफर जोड़कर कीनेज प्रतिक्रिया को रोकें
    5. एक 7.5% एसडीएस-पेज जेल में 70 वी के लिए 20 मिनट और फिर 140 घंटे के लिए 1 घंटे में चलाएं।
    6. 20 मिनट के लिए फिक्सेशन बफर के साथ जेल को ठीक करें, इसे फिल्टर पेपर पर ले जाएं, और जेल को ट्रांसपायर के साथ कवर करेंएंट आवरण
    7. 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम जेल ड्रायर के साथ जेल सूखी और फिर इसे एक फास्फोर स्क्रीन या एक्स-रे फिल्म के लिए रात भर का पर्दाफाश करें।
    8. फॉस्फोर इमेजर के साथ फॉस्फोर स्क्रीन को स्कैन करें और चरण 2.4 के अनुसार विज़ुअलाइज़ेशन के बाद सीबीबी स्लेइंग के लिए एक गिलास ट्यूब पर जेल को स्थानांतरित करें।

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Representative Results

चित्रा 1 और चित्रा 2 पहले रिपोर्ट किए गए पेपर 8 में दोहराए गए प्रयोगों के परिणामों को प्रदर्शित करता है। तीन अलग-अलग 10 अवशिष्ट ऑलिगोपेप्टाइड, पोतदार एएमपीके लक्ष्य साइटों (# 1, 148-157 जिसमें सर्प 153; # 2, 330-33 9 जिसमें सर्त 335 और # 3, 553-562 जिसमें सर 558 शामिल हैं) का नकल किया गया था विट्रो किनेसे परख एएमपीके द्वारा एनआरएफ 2 के फास्फोरायलेशन को ऑलिगोपैप्टाइड # 3 ( चित्रा 1 ) की उपस्थिति में बहुत कम किया गया था। इसके बाद, पेप्टाइडमिमेटिक प्रयोग के परिणाम को मान्य करने के लिए एक साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन परख किया गया। एनआरएफ 2 ( चित्रा 1 ) के एएमपीके-मध्यस्थता वाले फास्फोरायलेशन पर ऑलिगोपैप्टाइड # 3 के निरोधात्मक प्रभाव को देखते हुए हमने एक S558A-Nrf2 उत्परिवर्ती उत्पन्न किया। फास्फोरायलेशन के स्तर की जंगली एनआरएफ 2 और एस के बीच तुलना की गई थी558 एट विट्रो एएमपीके किनेज परख का उपयोग कर उत्परिवर्ती। Nrf2 (558 में Ser → Ala) के एक एमिनो एसिड प्रतिस्थापन ने एएमपीके को एनएफएफ 2 फॉस्फोरेटिंग से रोका, यह दर्शाता है कि एएमपीके सीर558 में सीधे एनएफएफ 2 ( चित्रा 2 ) में फॉस्फोरेट करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: इन विट्रो प्रतियोगी एएमपीके किनेज परख में इन विट्रो किनेज एल्स में संकेतित ऑलिगोपेप्टाइड (# 1, 148-157 जिसमें सर्प 153; # 2, 330-33 9 जिसमें सर्त 335; और # 3, 553-562 जिसमें सर्मान 558 शामिल हैं) की उपस्थिति में किया गया था।

चित्र 2
चित्रा 2: एक साइट-विशिष्ट उत्परिवर्ती प्रोटीन का उपयोग करके इन विट्रो एएमपीके किनेज परख में। इन विट्रो किनेज एल्स में वाइल्ड की उपस्थिति में किया गया थाYpe जीएसटी-एनआरएफ 2 या उसके एस558 ए उत्परिवर्ती

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Discussion

एएमपीके द्वारा मध्यस्थता की भविष्यवाणी की गई फॉस्फोराइटलाइशन साइटों की प्रामाणिकता का आकलन करने का एक सरल और सुविधाजनक तरीका है, यहां हम इन विट्रो किनेज परख का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग प्रतिस्पर्धी पेप्टाइड्स का उपयोग करने के लिए एक विशिष्ट फास्फोराइलेशन साइट का पता लगाने और साइट-विशिष्ट उत्परिवर्ती । इन विट्रो प्रतियोगी एएमपीके गतिविधि परख से प्राप्त प्रतिनिधि डेटा साइट-निर्देशित उत्परिवर्ती प्रोटीन का उपयोग करके एक परख के परिणाम से मेल खाती है, यह इंगित करता है कि पेप्टाइड प्रतियोगिता परख एक फॉस्फोराइलेशन साइट का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इस पद्धति का उपयोग पीकेसीडी द्वारा फास्फोराइलेट किए गए विशिष्ट साइट की पहचान के अध्ययन में भी किया गया था, जो कि serphine 403 में एनएफएफ 2 को फास्फोरियम करता है। चूंकि पेप्टाइड्स प्रतिस्पर्धात्मक रूप से प्रोटीन से जुड़ी हुई हैं, इस सिद्धांत को बाइटिंग आकृति 10 , 11 की पहचान करने के लिए इन विट्रो जीएसटी पुल-डाउन परख के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पेप्टाइडममेमटिक विधि अन्य ट्रांसमिशन के बाद के संशोधनों की पहचान के लिए भी लागू हो सकते हैं, जैसे लाइसिन अवशेषों में एसिटिलेशन।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, कुछ हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स को भंग करना मुश्किल हो सकता है। यदि एक पेप्टाइड एक किनेज बफर में अघुलनशील है, तो इसे 20% डीएमएसओ में भंग करने में सहायक हो सकता है। अत्यधिक हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स को भंग करने के लिए, इसे 100% डीएमएसओ में भंग करने का पहला प्रयास करें और फिर एक कन्ज़े बफर के साथ समाधान कम करें। पेप्टाइड्स को भंग करने में भी मदद की जा सकती है। यदि यह अघुलनशील रहता है, तो खूनी साइट की नकल करने वाले पेप्टाइड को विलेयता बढ़ाने के लिए बढ़ाया जाना चाहिए।

इस पत्र में पेश प्रोटोकॉल में " इन विट्रो सिस्टम" का वर्णन किया गया है जिसमें एक शुद्ध किनेज और सब्सट्रेट का जवाब दिया गया है। इन विट्रो प्रणाली में, प्रतिस्पर्धी पेप्टाइड्स की एकाग्रता में छोटे अंतर परिणामों को प्रभावित नहीं करेंगे, जब तक कि एकाग्रता सब्सट्रेट प्रोटीन से कम न हो। आरइन विट्रो प्रयोग से प्राप्त एस्ल्ट में कृत्रिम निकटता और रिएक्टेंट्स की उच्च एकाग्रता द्वारा उत्पादित एक कलात्मक घटना होने की अंतर्निहित संभावना शामिल है। इस संभावना को समाप्त करने के लिए, डेटा की व्याख्या सेल-आधारित प्रयोगों के परिणामों के साथ होनी चाहिए। पेप्टाइड्स का उपयोग करते हुए झूठी सकारात्मक परिणामों को प्राप्त करने की एक और संभावना सब्सट्रेट संरचना और / या किनेस मान्यता में बदलाव के कारण हो सकती है। इस संभावना को बाहर करने के लिए, उत्परिवर्ती प्रोटीन के साथ पुष्टि के प्रयोग करना जरूरी है।

दूसरी तरफ, इस प्रणाली से झूठे नकारात्मक डेटा का भी उत्पादन किया जा सकता है। सेलुलर संदर्भ में कई किनेज़ प्रोटीन परिसरों के रूप में कार्य करते हैं और पूर्ण कार्यक्षमता के लिए सह-कारकों की आवश्यकता होती है। एएमपीके एएमपीकेना, एएमपीकेबी और एएमपीकेआईटी सब यूनिट से बना एक प्रतिनिधि प्रोटीन किनेज परिसर है, और एएमपी की एएमपी के बंधन को एएमपीकेआईजी सबिनिट के लिए आवश्यक है जो किनेज के सक्रियण के लिए आवश्यक है। दरअसल, एएमपीकेएएमपी मुक्त किनेस बफर में (एनएफएफ 2) फास्फोरेट नहीं किया था (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इस प्रकार, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एएमपी को इन विट्रो परख में सफल होने के लिए किनेज प्रतिक्रिया बफर में भंग किया जाना चाहिए।

फॉस्फोराइटेशन साइटों की पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग, सबसे लोकप्रिय विधि में, कई तकनीकी सीमाएं हैं, जो विखंडन प्रक्रिया 7 के दौरान अक्सर फॉस्फोरिक एसिड के सहज नुकसान से झूठी नकारात्मक संकेत उत्पन्न करती हैं। एक पेप्टाइड माइक्रोएरे विधि फास्फोरेटेशन साइटों के लिए खोज करने के लिए दूसरा विकल्प हो सकता है। हालांकि, इस पद्धति को समय-उपभोक्ता और महंगी माना जाता है। बॉलिवेटिव फोस्फोराइलेशन साइटों को स्क्रीनिंग करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, प्रतियोगी पेप्टाइड विधि एक बॉलिवुड फॉस्फोरायलेशन साइट की प्रकृति में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए सुविधाजनक और सस्ती तरीका हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम कोरियाई सरकार (एमएसआईपी) द्वारा वित्त पोषित राष्ट्रीय अनुदान के राष्ट्रीय अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित था (सं। 2015 आर 1 ए 2 ए 1 ​​ए 10052663 और सं। 2014 एम 1 ए 3 ए 3 ए02034698)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 15630
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 208337
EGTA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E3889
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D9779
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G9422
Na3VO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 450243
Protease inhibitor cocktail Calbiochem, Nottingham, UK 539134
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A2383
AMP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1752
AMPK Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 14-840
Nrf2 (WT) Abnova, Taipei City, Taiwan H00004780-P01
[γ-32P]-ATP PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA NEG502A
EZblue staining reagent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1041
Pfu turbo DNA polymerase Agilent Technologies, Santa Clara, CA 600250
dNTP mix Agilent Technologies, Santa Clara, CA 200415-51 Avoid multiple thaw and freezing cycle
DpnI New England Biolabs, Ipswich, MA R0176S
LB broth Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands L1704
Ampicillin Affymetrix, Santa Clara, CA 11259
Agarose LE iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea 32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 161-0400
Bovine Serum Albumin Bovogen Biologicals, Victoria, Australia BSA100
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare, Marlborough, MA 17-0756-01
Acetic Acid glacial Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea
Methyl alcohol
 
 		 Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea 5558-4410
Name Company Catalog Number Comments
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare, Marlborough, MA 28-9558-09
SDS-PAGE kit Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 1658001FC
Vacuum pump Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-178
Gel dryer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-1746
Dancing shaker FINEPCR, Seoul, Korea CR300 The machine is needed for washing step
PCR machine Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA T100
Incubator/shakers N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea NB-205L
Microcentrifuges LABOGENE, Seoul, Korea 1730R
Chromatography columns Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 732-1010

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References

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  3. Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
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  6. Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
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जैव रसायन अंक 123, पेप्टाइड अवरोध करनेवाला फास्फोरिलेशन एएमपीके एनआरएफ 2 सर्वसम्मति वाला आकृति साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन
फास्फोरिलेशन साइट निर्धारण के लिए ओलिगोपेप्टाइड प्रतियोगिता परख
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Joo, M. S., Koo, J. H., Shin, S. B., … More

Joo, M. S., Koo, J. H., Shin, S. B., Yim, H., Kim, S. G. Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination. J. Vis. Exp. (123), e55708, doi:10.3791/55708 (2017).

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