Summary
Peptidkonkurrensanalyser används ofta i ett flertal molekylära och immunologiska experiment. Detta papper beskriver en detaljerad metod för en in vitro oligopeptidkompetent kinasassay och de associerade valideringsförfarandena, som kan vara användbara för att hitta specifika fosforyleringsställen.
Abstract
Proteinfosforylering vid specifika ställen bestämmer dess konformation och interaktion med andra molekyler. Således påverkar proteinfosforylering biologiska funktioner och egenskaper hos cellen. För närvarande är den vanligaste metoden för att upptäcka fosforyleringsställen genom analys av vätskekromatografi / masspektrometri (LC / MS), en snabb och känslig metod. Relativt labila fosfatdelar frigörs emellertid ofta från fosfopeptider under fragmenteringssteget, vilket ofta ger falskt negativa signaler. I sådana fall skulle en traditionell in vitro- kinasassay med användning av ställningsriktade mutanter vara mer exakt, men denna metod är mödosam och tidskrävande. Därför kan en alternativ metod som använder peptidkonkurrens vara fördelaktig. Konsensusigenkänningsmotivet för 5'-adenosinmonofosfat-aktiverat proteinkinas (AMPK) har etablerats 1 och validerades med användning av ett positions-scanningpeptidbibliotek assAy 2 . Sålunda kan AMPK-fosforyleringsställen för ett nytt substrat förutspås och bekräftas genom peptidkonkurrensanalyserna. I denna rapport beskriver vi de detaljerade stegen och förfarandena för den in vitro oligopeptidkompetanta kinasassayen genom att illustrera AMPK-medierad kärnfaktor-erythroid 2-relaterad faktor 2 (Nrf2) fosforylering. För att autentisera fosforyleringsstället utförde vi en sekventiell in vitro- kinasassay med användning av en platsspecifik mutant. Sammantaget tillhandahåller peptidkonkurrensanalysen en metod för att screena flera potentiella fosforyleringsställen och för att identifiera ställen för validering av fosforyleringsställsmutanterna.
Introduction
Proteinfosforylering vid en specifik rest spelar en signifikant roll i ett brett spektrum av cellulära processer. Sålunda kräver en förståelse av signaleringsnät identifiering av specifika fosforyleringsställen. Dessutom bestämmer fosforyleringsstället effekten på proteinfunktionen eftersom enskilda domäner inom ett protein har olika strukturer och funktioner. Aktiviteten av kärnfaktor erythroid 2-relaterad faktor 2 (Nrf2), en nyckelantioxidant transkriptionsfaktor, regleras dubbelriktad genom fosforylering vid olika ställen. Våra studier har fokuserat på kinaser som katalyserar fosforyleringen av Nrf2. Spänningsresponsen hos Nrf2 mot oxidativ utmaning sker snabbt, huvudsakligen genom fosforylering vid serin 40 och medierad av proteinkinas C (PKC) -δ, vilket aktiverar Nrf2 3 , 4 . Omvänt katalyserar Fyn den inhiberande fosforyleringen av Nrf2 vid tyrosin 568 för snabb kontroll av aktiviteten 5 .
Den vanligaste metoden som används för att upptäcka fosforyleringsställen är analys av vätskekromatografi / masspektrometri (LC / MS). Snabb och mycket känslig fosforyleringsplats kartläggningsdata kan genereras på detta sätt; Det har dock flera tekniska begränsningar som ofta genererar falsk-negativa signaler. Dålig sekvensdäckning förekommer ofta i LC / MS-analys. För att identifiera fosforyleringsställen krävs information om den maximala aminosyrans täckning av ett protein 6 . Proteolys av proteinet av intresse med flera proteaser under digestionssteget kan vara till hjälp för att förbättra sekvensdäckningen. Ett annat hinder för identifieringen av fosforyleringsrester är den enkla förlusten av fosforsyra som ofta observeras för serin- och treonin-fosforylerade peptider 6 , 7 . Labila fosfatdelar är oftaFrisatt från fosfopeptider under fragmenteringsprocessen 7 . Det andra alternativet när man söker efter fosforyleringsställen använder en peptidmikroarray-metod. Det är möjligt att screena för kinasmål-ställena med användning av ett mikroarray-chip innehållande peptidfragment härledda från ett protein av intresse. På grund av utrustningskravet för produktion och detektering av ett mikroarraychip anses emellertid peptidmikroarraymetoden tidskrävande och dyr.
För att övervinna dessa utmaningar kan en in vitro oligopeptidkompetent kinasassay användas för ett proteinkinas med kända igenkänningsmotiv. Om konsensusidentifieringsmotivet för ett kinas är etablerat kan förmodade fosforyleringsställen för ett kandidatsubstrat förutses och äktheten hos sidorna kan valideras. Den mest övertygande metoden för denna procedur är att visa upphävandet av fosforylering i ett mutant protein i vilket prediktenD-återstoden är substituerad med en icke-fosforylerbar aminosyra ( dvs serin eller treonin till alanin, tyrosin till fenylalanin). Produktionen och isoleringen av mutanta proteiner är emellertid tidskrävande. Som ett alternativ vid den inledande fasen av forskningen är den kompetitiva peptidkinasanalysen enkel och bekväm. Här beskriver vi ett protokoll för en in vitro -peptidkonkurrensanalys och för validering av fosforyleringsstället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Säkerhet
VARNING: Detta protokoll använder [γ- 32 P] -ATP för att bedöma AMPKs aktivitet. Fosfor-32 är en radioaktiv isotop, som i stor utsträckning utsänder beta-strålning. Eftersom storleken på en beta-partikel är extremt liten kan den lätt tränga in i kläder och hud. Både extern och intern exponering för beta-strålning kan vara skadlig för människors hälsa, bland annat genom att orsaka hudbrännskador och vävnadskador.
- Utför alla steg som kräver användning av [γ- 32 P] -ATP med lämpligt skydd, såsom akrylskärmning.
- Se till att all personal är utrustad med elektroniska personliga dosimetrar (EPD) för att övervaka exponeringen för skadlig strålning under alla förfaranden.
- Hantera öppen källkodsstrålning först efter lämplig träning och godkännande av myndigheter.
OBS: Här utfördes alla experiment efter avslutad utbildning på öppen källkodsstrålning vid Seoul National UnivErsättning och godkännande av den koreanska regeringen (nssc.go.kr/nssc/en). - Kassera radioaktivt avfall enligt lokala föreskrifter.
OBS: Här följdes direktiv från Institute of Environmental Protection & Safety från Seoul National University. Följande är en lista över tillsynsmyndigheter i USA och europeiska länder: Amerikas förenta stater, Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Förenade kungariket, HSE (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Frankrike, Autorité de Sûreté Nucléaire (https://www.asn.fr/); Och Tyskland, federala ministeriet för miljö, naturskydd, byggnad och kärnsäkerhet (BMU) (http://www.bmu.de).
2. In Vitro Competitive Kinase Assay
- Konstruktion av konkurrerande peptider
- Bestäm konsensusmotivet fosforylerat av AMPK.
OBS: AMPK känner igen konsensusmotivet, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. I konsensussekvensen representerar Φ hydrofoba aminosyror ( dvs valin [V], leucin [L], metionin [M] och isoleucin [I]) och p representerar basiska aminosyror ( dvs lysin [K], arginin [ R] och histidin [H]) 1 . - Välj serin- eller treoninrester från målsekvenser enligt ovanstående konsensusmotiv. Använd tre förmodade ställen av humant Nrf2 (# 1, 148-157 innefattande Ser153; # 2, 330-339 innefattande Ser335; och # 3, 553-562 innefattande Ser558) 8 .
- Kommersiellt syntetisera peptider med 10 rester som efterliknar de förmodade ställena. Hämta den syntetiserade produkten som ett lyofiliserat pulver med en renhet som är större än 98% för varje peptid.
- Lös peptiderna med hjälp av en kinasbuffert för att uppnå en koncentration av 71,667 g / L. Om en peptid inte är löslig i en kinasbuffert, lös den upp i 20% DMSO. Om det är olösligt, mimickar en peptid puttenAtivställe kan förlängas för att öka lösligheten.
- Bestäm konsensusmotivet fosforylerat av AMPK.
- In Vitro Competitive AMPK Kinase Assay
- Förbered 5 × kinasbuffert enligt följande: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM p-glycerofosfat (serin / treonin fosfatasinhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosinfosfatashämmare); 0,5% (volym / volym) Proteasinhibitor Cocktail Set III, 1 mM kall ATP; Och 500 | im AMP.
OBS: AMP är en väsentlig del av kinasbufferten för att testa AMPK-aktivitet. Bufferten kan användas för att mäta aktiviteten hos både serin / treoninkinaser och tyrosinkinaser. - Tina följande rekombinanta proteiner och syntetiska peptider på is: AMPK; Nrf2; Och oligopeptiderna # 1, # 2 och # 3.
- Bered en reaktionsbuffert på is: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg oligopeptid (~ 300 nmol) och 6 μl 5 × kinasbuffert. enJust den slutliga volymen till 30 μL med sterilt destillerat vatten (DW).
OBS: Tillsatsen av [y-32P] -ATP efter beredning av reaktionsbufferten kan reducera den radioaktiva signalen på grund av kinas autofosforylering.
- Förbered 5 × kinasbuffert enligt följande: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM p-glycerofosfat (serin / treonin fosfatasinhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosinfosfatashämmare); 0,5% (volym / volym) Proteasinhibitor Cocktail Set III, 1 mM kall ATP; Och 500 | im AMP.
- Körning av reaktanterna
OBS! Samtliga processer nedan måste utföras under skydd med en akrylsköld, rack eller block samt lämplig personlig skyddsutrustning.- Ställ upp värmeblock till 30 ° C innan experimentet påbörjas.
- Tillsätt 1 μl [y-32P] -ATP (1 μCi) till reaktionsrören på is. Blanda reaktionsbufferten genom att pipettera upp och ner flera gånger.
OBS: Radioaktiviteten på 32 P har en kort halveringstid på cirka 14 dagar 9 . Justera volymen med hänsyn till halveringstiden ( t.ex. efter en månad från produktionen av [y- 32 P] -ATP, tillsätt 4 μL [γ- 32 P]-ATP för att göra 1 μCi). - Inkubera provet i värmeblocket vid 30 ° C i 15-30 minuter. Under detta steg framställer 7,5% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) geler. Justera procenten av gelén beroende på målproteinets storlek.
- Stopp kinasreaktionen genom att tillsätta 3 | xl 10 x SDS-provbuffert (10% (volym / volym) glycerol, 20% (vikt / volym) SDS, 15,42% (vikt / volym) ditiotreitol, 90% M Tris-HCl (pH 6,8) och 0,02% (vikt / volym) bromfenolblå). Blanda reaktionsbufferten genom att pipettera upp och ner flera gånger.
- Kör proverna i en 7,5% SDS-PAGE gel vid 70 V under 20 min och kontinuerligt vid 140 V under 1 h.
OBS! Den bromofenolblå linjen vid slutet av gelén innehåller extremt höga radioaktiva signaler. Det rekommenderas att ta bort gelén under den blå linjen innan du går vidare till nästa steg för att minska bakgrundssignalerna. - Efter SDS-PAGE, försiktigt avlägsna gelén från caster. Placera gelén i ett glas tUbe för nästa steg.
- Fixa gelén med fixeringsbuffert under 20 minuter (50% metanol och 10% isättika).
- Flytta gelen försiktigt på filterpapper och täck den med ett genomskinligt omslag. Observera att gelén lätt kan slits på detta steg. Torka gelén med en vakuumdroger vid 80 ° C i 1 h.
- visualisering
- Utsätt gelén för antingen en fosforskärm eller en röntgenfilm över natten (vanligtvis i ca 16 h).
OBS! En fosforskärm kan återanvändas efter exponering för det extra ljusa ljuset. När en röntgenfilm används, exponera gelén över två dagar. Röntgenfilmer har lägre känslighet än fosforskärmar. - Skanna fosforskärmen med en fosforbildare. Exportera bilden som en TIFF- eller bitmappfil med hög upplösning.
- Efter visualisering flyttar du gelén till en glas- eller plastbehållare för färgning av Coomassie brilliant blue (CBB).
- Tvätta gelén med DW. Kassera DW och fläck thGel med färgningsreagenset i 1 h.
- Kassera reagenset och avlägsna gelén med DW i 1 h eller över natten. Placera gelén mellan transparenta plastfilmer (eller motsvarande) för att skanna med en kontorscanner.
- Utsätt gelén för antingen en fosforskärm eller en röntgenfilm över natten (vanligtvis i ca 16 h).
3. In Vitro Kinase Assay Använda en Site-specifik Mutant
- Site-Directed Mutagenesis av pGEX-Nrf2
- Mutagen Primer Design
OBS! Att konstruera lämpliga mutagena primers är kritisk för det framgångsrika resultatet av mutagenes. Nedan följer några överväganden för utformning av mutagena primers. Skapa en primer bestående av 25 till 45 baser, med önskad mutation i mitten av primern. Primeren ska ha 40-60% GC-innehåll och avsluta med en eller flera G- eller C-baser. Se till att primerns Tm är lika med 78 ° C eller högre enligt formeln [Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / längd baser) -% mismatch].
OBS: RengörPrimer eftersom dess renhet är viktig för mutationseffektivitet. Det finns flera webbplatser för att utforma mutagena primers.- Öppna primerdesignprogrammet för "utformning av primers för site-directed mutagenesis" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Klistra mänsklig Nrf2-DNA-sekvens (Access nr NM_006164.4) och välj knappen "ladda upp översatt".
- Välj serin 558 rest från den översatta aminosyrasekvensen som ska ändras till alanin. Använd den mutagena primeren, ersätt kodonet för serin från agc till gcc, för alanin.
- Tänk på primerlängden, T m och GC-innehållet.
OBS: Den mutagena primeren är äntligen utformad som 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Reaktion för mutantstrandsyntes med användning av polymerasekedjereaktion (PCR)
- Förbered PCR-reaktionsblandningen på is: 10 x reaktionsbuffert, 50 ng avPGEX-GST-Nrf2, 125 ng framåtprimer, 125 ng omvänd primer, 1 jil dNTP-blandning (10 mM vardera), 2,5 U Pfu DNA-polymeras och steril DW till 50 jil.
- Kör PCR för pGEX-GST-Nrf2-mutantsträngsyntes med följande cykelprogram: 1 cykel vid 95 ° C i 30 s; 18 cykler vid 95 ° C under 30 s, vid 55 ° C under 1 min och vid 68 ° C under 90 s; Och 1 cykel vid 68 ° C i 5 min.
OBS: Beroende på plasmidlängden kan cykelparametrarna ändras. - Placera den på is i 2 minuter för att kyla reaktanterna för nästa steg. Alternativt lagra dem vid 4 ° C över natten.
- Dpn I Digestion och urvalet av en Mutant Plasmid
- Tillsätt 1 μl Dpn I- restriktionsenzym (10 U / μl) till var och en av reaktanterna efter kylning. Blanda noggrant och försiktigt genom pipettering och centrifugering i 1 min.
- Inkubera vid 37 ° C i 2 h för att smälta föräldra pGEX-GST-Nrf2 dubbel-Strängad DNA.
- Tina försiktigt DH5 α superkompetenta celler på is.
- Tillsätt 50 μL av reaktanten till 150 | il av förkylda DH5a superkompetenta celler och inkubera på is under minst 30 minuter.
- Överför rören till ett värmeblock som förvärmts till 42 ° C och lämna dem i 90 s. Placera dem på is i 2 minuter.
- Tillsätt förvärmd lysogenibocker (LB) till de transformerade DH5a- cellerna och inkubera vid 37 ° C under 1 timme med skakning vid 180 rpm.
- Sprid de transformerade cellerna på LB-ampicillinagarplattor och inkubera över natten vid 37 ° C.
OBS: Ampicillin används för selektion eftersom plasmiden GEX-GST-Nrf2 har ampicillinresistensmarkören. Använd lämpliga antibiotika, beroende på resistansmarkören för den mutageniserade plasmiden. - Välj en enda koloni från plattan, överför den till 5 ml LB-ampicillin och inkubera över natten vid 37 ° C med skakning vid 180 rpm.För att verifiera den mutagena sekvensen, utvärdera minst tre kolonier.
- Extrakt DNA genom att använda ett DNA miniprep kit för DNA-sekvensanalys; Följ tillverkarens protokoll.
- Verifiera mutagena DNA-sekvenser med hjälp av en automatisk DNA-sekvensanalysator enligt tillverkarens protokoll. Använd minst 200 ng av DNA-konstruktionen för verifiering av mutanta sekvenser.
- Mutagen Primer Design
- Rening av rekombinant GST-Nrf2-protein
- Uttryck av mutagen GST-Nrf2-fusionsprotein i Escherichia coli
- Transformera den mutagena pGEX-GST-Nrf2-plasmiden i BL21- celler. Inokulera en enda koloni i 25 ml LB-buljong innehållande ampicillin (100 | ig / ml) och inkubera vid 37 ° C på en rotator över natten.
- Inokulera de odlade cellerna i 100 ml LB-buljong innehållande ampicillin (100 | ig / ml) vid ett utspädningsförhållande 1: 100.
- Inkubera vid 37 ° C på en rotatEller tills absorbansen vid 600 nm når omkring 0,4-0,8 (ungefär 4 timmar).
- Tillsätt 100 μl 1 M IPTG till 100 ml odlade celler för att framställa en slutlig koncentration av 1 mM IPTG.
- Inkubera cellerna vid 30 ° C på en rotator under 6 timmar eller över natten för proteinuttryck.
- Centrifugera cellerna vid 5000 xg under 20 minuter och resuspendera cellpellets med 1 ml bakteriell lysbuffert (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 pg / ml pepstatin, 0,5 pg / ml leupeptin, Och 1 mM PMSF) på is.
- Lyse cellpellets med hjälp av en ultraljudshomogenisator med 2-s intervaller i 2 min vid 50% av den maximala effektutgången.
- Centrifugera cellerna vid 12 000 x g under 15 min vid 4 ° C och uppsamla supernatanten.
- Rening av rekombinant GST-Nrf2-protein
- Förbered 200 μl 50% (v / v) glutation-agarospärlor och tvätta med 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2
- Tillsätt celllysatet till de preparerade 200 | il 50% (v / v) glutation-agaros-pärlorna och inkubera vid 4 ° C på en roterande ände-ände i 2 timmar.
- Samla glutation-agaroskulorna i kombination med GST-Nrf2-protein genom centrifugering vid 500 xg under 1 min. Ta bort supernatanten med en 1 ml spruta med en 31 G nål.
- Tvätta pärlorna med 1 ml PBS (pH 7,3), som i steg 1.
- Tillsätt 500 μl elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl och 10 mM reducerad glutation, pH 8,0) till glutation-agaros-pärlorna kombinerat med GST-Nrf2. Inkubera vid 4 ° C på en rotor i slutet-ände under 30 minuter.
- Centrifugera vid 500 xg under 1 min och uppsamla supernatanten.
- Åter tillsätt 300 μL elueringsbuffert till pärlorna och upprepa steg 3.2.2.5-3.2.2.6 två gånger.
- Bekräftelse av det renade GST-Nrf2 proteinet
- Bered 5 μL av provet för visualisering av proteinkvantitet med 0,5 | jg standard protein BSA.
- Kör proverna i en 7,5% SDS-PAGE gel vid 70 V i 20 min och därefter vid 140 V i 60 min.
- Stänk gelén med 0,1% CBB-färglösning (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% metanol, 10 ml isättika och 50 ml destillerad H2O) i 2 h och avlägsna (30 ml metanol, 10 ml isättika och 60 ml destillerad H2O) tills banden tydligt visas.
- Placera den avlägsnade gelén på filterpapper och täck med ett transparent omslag. Torka gelén med en vakuumdroger vid 80 ° C i 1 h.
- Bestäm mängden mutant GST-Nrf2-protein med densitometri för in vitro AMPK-kinasassayen.
- Uttryck av mutagen GST-Nrf2-fusionsprotein i Escherichia coli
- I Vitro AMPK Aktivitetsanalys med en Site-Specific Mutant
INTEE: In vitro AMPK-kinasassay utföres i enlighet med steg 2.2-2.4, med användning av 0,4 / xg renad vildtyp GST-Nrf2 eller GST-Nrf2-S558A-mutanten utan peptidinhibitorer. Följ alla riktlinjer för strålskyddssäkerhet som beskrivs i steg 1.- Bered en reaktionsbuffert på is med 0,15 μg AMPK, 0,4 μg mutant eller vildtyp GST-Nrf2 och 6 μl 5-kinasbuffert. Fyll upp till 30 μL med steril DW.
- Tillsätt 1 μl [y-32P] -ATP (1 μCi / μl) till reaktionsrören på is. Blanda reaktionsbufferten genom pipettering upp och ner flera gånger och centrifugera.
- Inkubera proven i ett värmeblock vid 30 ° C under 30 minuter.
- Stoppa kinasreaktionen genom att tillsätta 3 xl av 10 x SDS-provbuffert.
- Kör i en 7,5% SDS-PAGE gel vid 70 V i 20 min och sedan vid 140 V i 1 h.
- Fixa gelén med fixeringsbufferten i 20 minuter, flytta den på filterpapperet och täcka gelén med en transparentEnt wrapper.
- Torka gelén med vakuumgeltorken vid 80 ° C i 1 h och exponera den sedan över natten till antingen en fosforskärm eller en röntgenfilm.
- Skanna fosforskärmen med en fosforbildare och flytta gelén till ett glasrör för CBB-färgning efter visualisering enligt steg 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 och Figur 2 visar resultaten från upprepade försök i det tidigare rapporterade papperet 8 . Tre olika oligoseptider med 10 rester efterliknande de förmodade AMPK-målställena (# 1, 148-157 innefattande Ser153; # 2, 330-339 innefattande Ser335; och # 3, 553-562 innefattande Ser558) syntetiserades och användes som konkurrenter i Vitro- kinasassay. Fosforyleringen av Nrf2 med AMPK minskades avsevärt i närvaro av oligopeptid # 3 ( Figur 1 ). Därefter utfördes en site-directed mutagenesis assay för att validera resultatet av det peptidomimetiska experimentet. Med tanke på den inhiberande effekten av oligopeptid nr 3 på AMPK-medierad fosforylering av Nrf2 ( Figur 1 ) genererade vi en S558A-Nrf2-mutant. Fosforyleringsnivåerna jämfördes mellan vildtypen Nrf2 och S558A-mutant med användning av in vitro AMPK-kinasassayen. Den enda aminosyrasubstitutionen av Nrf2 (Ser → Ala vid 558) förhindrade AMPK från fosforylering Nrf2, vilket indikerar att AMPK direkt fosforylerar Nrf2 vid Ser558 ( Figur 2 ).
Figur 1: In vitro- kompetitiv AMPK-kinasassay. In vitro- kinasanalyser utfördes i närvaro av de angivna oligopeptiderna (nr 1, 148-157 innefattande Ser153; # 2, 330-339 innefattande Ser335; och # 3, 553-562 innefattande Ser558).
Figur 2: In vitro AMPK-kinasassay med användning av ett sitsspecifikt mutantprotein. In vitro- kinasassays utfördes i närvaro av vildtYp GST-Nrf2 eller dess S558A-mutant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som ett enkelt och bekvämt sätt att bedöma äktheten hos de förutspådda fosforyleringsställena medierade av AMPK beskriver vi här en in vitro- kinasanalys som kan användas för att upptäcka en specifik fosforyleringsplats med användning av konkurrerande peptider och för att verifiera den med hjälp av en sitsspecifik mutant . De representativa data som erhölls från den in vitro- kompetitiva AMPK-aktivitetsanalysen matchade resultaten från en analys med användning av ett platsriktat mutantprotein, vilket indikerar att peptidkonkurrensanalysen är ett användbart verktyg för att bestämma en fosforyleringsplats. Denna metod användes också i studien identifiering av den specifika platsen fosforylerad av PKCδ, vilken fosforylerar Nrf2 vid serin 403. Eftersom peptider binder konkurrenskraftigt till ett protein kan principen också appliceras på en in vitro GST-neddragningsanalys för att identifiera ett bindningsmotiv 10 , 11 . Dessutom denna peptidomimTic-metoden kan också vara tillämplig på identifieringen av andra posttranslationella modifieringar, såsom acetylering vid lysinrester.
Med användning av detta protokoll kan det vara svårt att lösa upp några hydrofoba peptider. Om en peptid är olöslig i en kinasbuffert kan lösningen i 20% DMSO vara till hjälp. För att lösa upp extremt hydrofoba peptider, försök först att lösa upp det i 100% DMSO och späd sedan lösningen med en kinasbuffert. Sonikering kan också vara till hjälp vid upplösning av peptiderna. Om det är olösligt, bör en peptid som efterliknar den förmodade platsen utvidgas för att öka lösligheten.
Protokollet som införs i detta dokument beskriver ett " in vitro- system", i vilket en renad kinas och substrat reageras. I in vitro- systemet påverkar små skillnader i koncentrationen av konkurrerande peptider inte resultaten om inte koncentrationen är lägre än substratproteinet. REsult erhållen från ett in vitro- experiment innefattar den inneboende möjligheten att vara en artefaktuell händelse som produceras genom artificiell närhet och den höga koncentrationen av reaktanter. För att eliminera detta perspektiv bör tolkningen av data åtföljas av resultaten från cellbaserade experiment. En annan möjlighet att erhålla falskt positiva resultat med användning av peptider kan bero på förändringar i substratkonformation och / eller kinasigenkänning. För att utesluta denna möjlighet är det nödvändigt att göra bekräftelsesexperiment med mutanta proteiner.
Å andra sidan kan falsk-negativa data också produceras från detta system. Många kinaser fungerar som proteinkomplex inom cellulärt sammanhang och kräver samfaktorer för fullständig funktionalitet. AMPK är ett representativt proteinkininkomplex bestående av AMPKa, AMPKβ och AMPKγ-subenheter, och bindningen av AMP till AMPKy-subenheten är nödvändig för aktiveringen av kinaset. Faktum är AMPKFosforylerar Nof2 i en AMP-fri kinasbuffert (data ej visad). Således bör det noteras att AMP måste lösas i kinasreaktionsbufferten för en framgångsrik in vitro- analys.
Användningen av masspektrometri för identifiering av fosforyleringsställen, den mest populära metoden, har flera tekniska begränsningar, som ofta genererar falsk-negativa signaler genom ansiktsförlusten av fosforsyra under fragmenteringsprocessen 7 . En peptidmikroarraymetod kan vara det andra alternativet att söka efter fosforyleringsställen. Denna metod anses emellertid tidskrävande och dyr. Som en alternativ metod för screening av förmodade fosforyleringsställen kan den konkurrerande peptidmetoden vara ett bekvämt och billigt sätt att få insikt i naturen hos en antagen fosforyleringsplats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea bidrag som finansierades av den koreanska regeringen (MSIP) (nr 2015R1A2A1A10052663 och nr 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F.
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
