Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55708
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, 2College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

Summary

Peptidkonkurrenceanalyser anvendes i vid udstrækning i en række molekylære og immunologiske eksperimenter. Dette papir beskriver en detaljeret fremgangsmåde til et in vitro oligopeptidkompeterende kinaseassay og de tilhørende valideringsprocedurer, som kan være nyttige til at finde specifikke phosphoryleringssteder.

Abstract

Proteinphosphorylering på bestemte steder bestemmer dets konformation og interaktion med andre molekyler. Proteinphosphorylering påvirker således biologiske funktioner og egenskaber hos cellen. For øjeblikket er den mest almindelige metode til opdagelse af phosphoryleringssteder ved hjælp af væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse, en hurtig og følsom metode. Imidlertid frigives relativt labile phosphatdele ofte fra phosphopeptider under fragmenteringstrinnet, hvilket ofte giver falske negative signaler. I sådanne tilfælde ville et traditionelt in vitro kinase assay ved anvendelse af stedregistrerede mutanter være mere præcist, men denne metode er besværlig og tidskrævende. Derfor kan en alternativ metode ved anvendelse af peptidkonkurrence være fordelagtig. Konsensusgenkendelsesmotivet for 5'-adenosinmonophosphat-aktiveret proteinkinase (AMPK) er blevet etableret 1 og blev valideret ved anvendelse af et positionsscanningpeptid bibliotek assAy 2 . Således kan AMPK-phosphoryleringssteder for et nyt substrat forudsiges og bekræftes af peptidkonkurrenceanalyserne. I denne rapport beskriver vi de detaljerede trin og procedurer for det in vitro oligopeptidkompeterende kinasassay ved at illustrere AMPK-medieret nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2) phosphorylering. For at autentificere phosphoryleringsstedet gennemførte vi et sekventielt in vitro kinase assay ved anvendelse af en site-specifik mutant. Samlet set tilvejebringer peptidkonkurrenceassayet en fremgangsmåde til screening af multiple potentielle phosphoryleringssteder og for at identificere steder til validering af phosphoryleringsstedsmutanterne.

Introduction

Proteinphosphorylering ved en specifik rest spiller en væsentlig rolle i en bred vifte af cellulære processer. En forståelse af signaleringsnetværk kræver således identifikation af specifikke phosphoryleringssteder. Derudover bestemmer phosphoryleringsstedet virkningen på proteinfunktionen, fordi individuelle domæner i et protein har forskellige strukturer og funktioner. Aktiviteten af ​​nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2), en nøgle antioxidant transkriptionsfaktor, reguleres tovejs gennem phosphorylering på forskellige steder. Vores studier har fokuseret på kinaser, der katalyserer phosphoryleringen af ​​Nrf2. Spændingsresponsen af ​​Nrf2 mod oxidativ udfordring sker hurtigt, hovedsagelig gennem phosphorylering ved serin 40 og formidlet af proteinkinase C (PKC) -δ, som aktiverer Nrf2 3 , 4 . Omvendt katalyserer Fyn den inhibitoriske phosphorylering af Nrf2 ved tyrosin 568 for tæt kontrol af aktiviteten 5 .

Den mest almindelige metode, der anvendes til at opdage phosphoryleringssteder, er væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse. Hurtige og meget følsomme phosphoryleringssteder mapping data kan genereres på denne måde; Det har dog flere tekniske begrænsninger, der ofte genererer falsk-negative signaler. Dårlig sekvensdækning forekommer ofte i LC / MS analyse. For at identificere phosphoryleringssteder kræves der information om den maksimale aminosyredækning af et protein 6 . Proteolyse af proteinet af interesse med flere proteaser under fordøjelsestrinnet kan være til hjælp til forbedring af sekvensdækning. En anden hindring for identifikationen af ​​phosphoryleringsrester er det letforløb af phosphorsyre, som ofte observeres for serin- og threoninphosphorylerede peptider 6 , 7 . Labile phosphatdele er ofteFrigivet fra phosphopeptider under fragmenteringsprocessen 7 . Den anden mulighed, når man søger efter phosphoryleringssteder, bruger en peptidmikroarray metode. Det er muligt at screene for kinase-målstederne ved anvendelse af en mikroarraychip indeholdende peptidfragmenter afledt af et protein af interesse. På grund af udstyrets krav til produktion og påvisning af en microarray-chip betragtes peptid-mikroarray-metoden imidlertid tidskrævende og dyr.

For at overvinde disse udfordringer kan et in vitro oligopeptidkompeterende kinaseassay anvendes til en proteinkinase med kendte genkendelsesmotiver. Hvis konsensusgenkendelsesmotivet for en kinase er etableret, kan der forudses formodede phosphoryleringssteder for et kandidatsubstrat, og autentiteten af ​​lokaliteterne kan valideres. Den mest overbevisende metode til denne procedure er at vise ophævelsen af ​​phosphorylering i et mutantprotein, hvori den predicteD rest er substitueret med en ikke-phosphorylerbar aminosyre ( dvs. serin eller threonin til alanin; tyrosin til phenylalanin). Imidlertid er produktion og isolering af mutante proteiner tidskrævende. Som et alternativ i den indledende fase af undersøgelsen er den konkurrencedygtige peptidkinaseanalyse ligetil og bekvem. Her beskriver vi en protokol for en in vitro -peptidkonkurrenceanalyse og til validering af phosphoryleringsstedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sikkerhed

FORSIGTIG: Denne protokol bruger [γ- 32 P] -ATP til at vurdere aktiviteten af ​​AMPK. Fosfor-32 er en radioaktiv isotop, der i høj grad udsender beta-stråling. Da størrelsen af ​​en beta-partikel er ekstremt lille, kan den let trænge ind i tøj og hud. Både ekstern og intern eksponering for beta-stråling kan være skadelig for menneskers sundhed, herunder ved at forårsage hudforbrændinger og vævsskader.

  1. Udfør alle trin, der kræver brug af [γ- 32 P] -ATP ved brug af en passende beskyttelse, såsom akrylafskærmning.
  2. Sørg for, at alt personale er udstyret med elektroniske personlige dosimetre (EPD) for at overvåge omfanget af eksponering for skadelig stråling under alle procedurer.
  3. Håndter kun open source-stråling efter passende træning og godkendelse.
    BEMÆRK: Her blev alle eksperimenter udført efter afslutningen af ​​træning på open source-stråleanvendelse ved Seoul National UnivErstatning og godkendelse fra den koreanske regering (nssc.go.kr/nssc/en).
  4. Kassér radioaktivt affald i henhold til lokale bestemmelser.
    BEMÆRK: Her blev direktiver fra Institut for Miljøbeskyttelse og Sikkerhed fra Seoul National University fulgt. Følgende er en liste over regulatorer i USA og europæiske lande: USA, USA's Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Det Forenede Kongerige, Health and Safety Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Frankrig, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Og Tyskland, Forbundsministeriet for Miljø, Naturbeskyttelse, Bygning og Kerne Sikkerhed (BMU) (http://www.bmu.de).

2. In Vitro Competitive Kinase Assay

  1. Konstruktion af konkurrencedygtige peptider
    1. Bestem konsensusmotivet phosphoryleret af AMPK.
      BEMÆRK: AMPK genkender konsensusmotivet, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. I konsensussekvensen repræsenterer Φ hydrofobiske aminosyrer ( dvs. valin [V], leucin [L], methionin [M] og isoleucin [I]) og p betegner basiske aminosyrer ( dvs. lysin [K], arginin [ R] og histidin [H]) 1 .
    2. Vælg serin- eller threoninrester fra målsekvenser i overensstemmelse med det ovenfor nævnte konsensusmotiv. Brug tre formodede steder af humant Nrf2 (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558) 8 .
    3. Kommercielt syntetiser 10 peptidrester, som efterligner de formodede steder. Hent den syntetiserede produkt som et lyofiliseret pulver med en renhed på mere end 98% for hvert peptid.
    4. Opløs peptiderne ved anvendelse af en kinasepuffer for at opnå en koncentration på 71.667 g / L. Hvis et peptid ikke er opløseligt i en kinase buffer, opløses det i 20% DMSO. Hvis det forbliver uopløseligt, imiterer et peptid puttenAtivsted kan udvides til at øge opløseligheden.
  1. In Vitro Competitive AMPK Kinase Assay
    1. Forbered 5 × kinasebuffer som følger: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-glycerophosphat (serin / threoninphosphataseinhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosinphosphataseinhibitor); 0,5% (vol / vol) proteaseinhibitor Cocktail Sæt III, 1 mM kold ATP; Og 500 μM AMP.
      BEMÆRK: AMP er en væsentlig bestanddel af kinasepufferen for at teste AMPK-aktivitet. Bufferen kan anvendes til at måle aktiviteten af ​​både serin / threoninkinaser og tyrosinkinaser.
    2. Optø det følgende rekombinante protein og syntetiske peptider på is: AMPK; Nrf2; Og oligopeptiderne nr. 1, nr. 2 og nr. 3.
    3. Forbered en reaktionsbuffer på is: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg oligopeptid (~ 300 nmol) og 6 μl 5 × kinaser buffer. ENLige det sidste volumen til 30 μL med sterilt destilleret vand (DW).
      BEMÆRK: Tilsætningen af ​​[y-32P] -ATP efter fremstilling af reaktionsbufferen kan reducere det radioaktive signal på grund af kinaseautophosphorylering.
  2. Kørsel af reaktanterne
    BEMÆRK: Alle processer nedenfor skal udføres under beskyttelse med et akrylskærm, rack eller blok samt passende personlige værnemidler.
    1. Sæt opvarmningsblokke til 30 ° C inden forsøg påbegyndes.
    2. Tilsæt 1 μL [γ-32P] -ATP (1 μCi) til reaktionsrørene på is. Bland reaktionsbufferen ved pipettering op og ned flere gange.
      BEMÆRK: Radioaktiviteten på 32 P har en kort halveringstid på ca. 14 dage 9 . Juster lydstyrken ved at tage hensyn til halveringstiden ( fx efter en måned fra produktionen af ​​[γ-32P] -ATP, tilsæt 4 μL [γ- 32 P]-ATP for at gøre 1 μCi).
    3. Inkuber prøven i opvarmningsblokken ved 30 ° C i 15-30 minutter. Under dette trin fremstilles 7,5% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler. Juster procentdelen af ​​gelen i overensstemmelse med målproteinets størrelse.
    4. Stop kinasereaktionen ved at tilsætte 3 μl 10 x SDS prøvebuffer (10% (vol / vol) glycerol, 20% (vægt / volumen) SDS, 15,42% (vægt / volumen) ditithreitol, 90% (vol / vol) 0,5 M Tris-HCI (pH 6,8) og 0,02% (vægt / volumen) bromphenolblåt). Bland reaktionsbufferen ved pipettering op og ned flere gange.
    5. Kør prøverne i en 7,5% SDS-PAGE gel ved 70 V i 20 minutter og kontinuerligt ved 140 V i 1 time.
      BEMÆRK: Bromofenolblå linjen ved enden af ​​gelen indeholder ekstremt høje radioaktive signaler. Det anbefales at fjerne gelen under den blå linje, før du fortsætter til næste trin for at reducere baggrundssignaler.
    6. Efter SDS-PAGE fjern forsigtigt gelen fra caster. Placer gelen i et glas tUbe til næste trin.
    7. Fastgør gelen med fikseringsbuffer i 20 minutter (50% methanol og 10% iseddikesyre).
    8. Flyt gelen forsigtigt på filterpapir og dækk den med en gennemsigtig pakning. Bemærk at gelen let kan revet på dette trin. Tør gelen med en vakuumtørretørrer ved 80 ° C i 1 time.
  3. Visualisering
    1. Udsæt gelen til enten en fosforskærm eller en røntgenfilm natten over (normalt i ca. 16 timer).
      BEMÆRK: En fosforskærm kan genbruges efter udsættelse for det ekstra lyse lys. Når en røntgenfilm anvendes, udsættes gelen over to dage. Røntgenfilm har lavere følsomheder end fosforskærme.
    2. Scan fosfor skærmen med en phosphor imager. Eksporter billedet som en TIFF- eller bitmapfil med høj opløsning.
    3. Efter visualisering, flyt gelen til en glas- eller plastbeholder til Coomassie brilliant blue (CBB) farvning.
    4. Vask gelen med DW. Kassér DW'en og smør denGel med farvningsreagenset i 1 time.
    5. Kassér reagenset og fjern gelen med DW i 1 time eller natten over. Placer gelen mellem gennemsigtige plastikfilm (eller tilsvarende) for at scanne med en kontorscanner.

3. I Vitro Kinase Assay ved anvendelse af en Site-specifik Mutant

  1. Site-Directed Mutagenese af pGEX-Nrf2
    1. Mutagen Primer Design
      BEMÆRK: At designe egnede mutagene primere er kritisk for det vellykkede resultat af mutagenese. Nedenstående er nogle overvejelser for udformning af mutagene primere. Opret en primer bestående af 25 til 45 baser, med den ønskede mutation i midten af ​​primeren. Primeren skal have 40-60% GC-indhold og ophøre med et eller flere G- eller C-baser. Sørg for, at primerens Tm er lig med 78 ° C eller derover i henhold til formlen [ Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / længde af baser) -% mismatch].
      BEMÆRK: RensPrimer, fordi dets renhed er vigtig for mutationseffektivitet. Der er flere hjemmesider til udformning af mutagene primere.
      1. Åbn primer design programmet til "designe primere til site-directed mutagenese" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
      2. Indsæt human Nrf2 DNA-sekvens (Adgang nr. NM_006164.4) og vælg knappen "Upload translated".
      3. Vælg serin 558 rest fra den translaterede aminosyresekvens, der skal ændres til alanin. Brug den mutagene primer, erstat kodonet for serin fra agc til gcc, for alanin.
      4. Overvej primerlængde, Tm og GC-indholdet.
        BEMÆRK: Den mutagene primer er endelig designet som 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
    2. Reaktion for mutantstrandsyntese under anvendelse af polymerase-kædereaktion (PCR)
      1. Forbered PCR reaktionsblandingen på is: 10 x reaktionsbuffer, 50 ngPGEX-GST-Nrf2, 125 ng fremadsprimer, 125 ng omvendt primer, 1 μl dNTP-blanding (10 mM hver), 2,5 U Pfu DNA-polymerase og steril DW til 50 μl.
      2. Kør PCR'en for pGEX-GST-Nrf2-mutantstrengsyntese med det følgende cyklusprogram: 1 cyklus ved 95 ° C i 30 s; 18 cykler ved 95 ° C i 30 s, ved 55 ° C i 1 min og ved 68 ° C i 90 s; Og 1 cyklus ved 68 ° C i 5 minutter.
        BEMÆRK: Afhængig af plasmidlængden kan cykliparametrene ændres.
      3. Placer det på is i 2 minutter for at afkøle reaktanterne til næste trin. Alternativt opbevares dem ved 4 ° C natten over.
    3. Dpn I Digestion og udvælgelsen af ​​en Mutant Plasmid
      1. Tilsæt 1 μl Dpn I restriktionsenzym (10 U / μl) til hver af reaktanterne efter afkøling. Blandes grundigt og forsigtigt ved pipettering og centrifugering i 1 minut.
      2. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer for at fordøje forældre pGEX-GST-Nrf2 dobbelt-Strandet DNA.
      3. Tør forsigtigt DH5 α superkompetente celler på is.
      4. Tilsæt 50 μl reaktanten til 150 μl af forkølet DH5 α superkompetente celler og inkuber på is i mindst 30 minutter.
      5. Overfør rørene til en varmeblok, der er forvarmet til 42 ° C, og lad dem stå i 90 s. Placer dem på is i 2 min.
      6. Tilsæt forvarmet lysogeniboks (LB) til de transformerede DH5 a- celler og inkuber ved 37 ° C i 1 time under omrystning ved 180 omdr./min.
      7. Spred de transformerede celler på LB-ampicillin-agarplader og inkuber natten over ved 37 ° C.
        BEMÆRK: Ampicillin anvendes til selektion, da plasmidet GEX-GST-Nrf2 har ampicillinresistensmarkøren. Brug passende antibiotika, afhængigt af resistensmarkøren for det mutageniserede plasmid.
      8. Vælg en enkelt koloni fra pladen, overfør den til 5 ml LB-ampicillin, og inkuber natten over ved 37 ° C med omrystning ved 180 omdr./min.For at verificere den mutagene sekvens skal du evaluere mindst tre kolonier.
      9. Ekstraher DNA ved anvendelse af et DNA miniprep kit til DNA sekvensanalyse; Følg producentens protokol.
      10. Verificere de mutagene DNA-sekvenser ved hjælp af en automatisk DNA-sekvensanalysator ifølge producentens protokol. Brug mindst 200 ng af DNA-konstruktionen til verifikation af mutante sekvenser.
  2. Oprensning af rekombinant GST-Nrf2 protein
    1. Ekspression af mutagen GST-Nrf2- fusionsprotein i Escherichia coli
      1. Transformér det mutagene pGEX-GST-Nrf2 plasmid i BL21 celler. Inokulere en enkelt koloni i 25 ml LB bouillon indeholdende ampicillin (100 μg / ml) og inkuber ved 37 ° C på en rotator natten over.
      2. Inokulere de dyrkede celler i 100 ml LB bouillon indeholdende ampicillin (100 μg / ml) ved et 1: 100 fortyndingsforhold.
      3. Inkuber ved 37 ° C på en rotatEller indtil absorbansen ved 600 nm når omkring 0,4-0,8 (ca. 4 timer).
      4. Tilsæt 100 μl 1 M IPTG til 100 ml dyrkede celler for at fremstille en slutkoncentration på 1 mM IPTG.
      5. Inkuber cellerne ved 30 ° C på en rotator i 6 timer eller natten over for proteinekspression.
      6. Centrifuger cellerne ved 5.000 xg i 20 minutter og resuspender cellepellets med 1 ml bakteriel lysebuffer (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 μg / ml pepstatin, 0,5 μg / ml leupeptin, Og 1 mM PMSF) på is.
      7. Lyse cellepellets ved hjælp af en ultralydshomogenisator med 2-s intervaller i 2 minutter ved 50% af den maksimale effektudgang.
      8. Centrifuger cellerne ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C og opsamler supernatanten.
    2. Oprensning af rekombinant GST-Nrf2 protein
      1. Forbered 200 μl 50% (v / v) glutathion-agarosekugler og vask med 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2
      2. Tilsæt cellelysatet til de fremstillede 200 μl 50% (v / v) glutathion-agarosekugler og inkuber ved 4 ° C på en ende-over-ende rotator i 2 timer.
      3. Saml glutathion-agarosekuglerne kombineret med GST-Nrf2-protein ved centrifugering ved 500 xg i 1 min. Fjern supernatanten ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 31 G nål.
      4. Vask perlerne med 1 ml PBS (pH 7,3) som i trin 1.
      5. Tilsæt 500 μl elueringsbuffer (50 mM Tris-HCI og 10 mM reduceret glutathion, pH 8,0) til glutathion-agarosekuglerne kombineret med GST-Nrf2. Inkuber ved 4 ° C på en roterende ende-over-ende i 30 minutter.
      6. Centrifuger ved 500 xg i 1 min og opsamler supernatanten.
      7. Tilsæt igen 300 μl elueringsbuffer til perlerne og gentag trin 3.2.2.5-3.2.2.6 to gange.
    3. Bekræftelse af det oprensede GST-Nrf2 Protein
      1. Forbered 5 μL af prøven til visualisering af proteinmængde med 0,5 μg standard protein BSA.
      2. Kør prøverne i en 7,5% SDS-PAGE gel ved 70 V i 20 minutter og derefter ved 140 V i 60 minutter.
      3. Farv gelen med 0,1% CBB-farvningsløsning (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% methanol, 10 ml iseddikesyre og 50 ml destilleret H20) i 2 timer og destillere (30 ml methanol, 10 ml iseddikesyre og 60 ml destilleret H20) indtil båndene er tydeligt vist.
      4. Anbring den afsatte gel på filterpapir og dække med en gennemsigtig pakning. Tør gelen med en vakuumtørretørrer ved 80 ° C i 1 time.
      5. Bestem mængden af ​​mutant GST-Nrf2 protein med densitometri til in vitro AMPK kinase assayet.
  3. I Vitro AMPK Activity Assay med en Site-Specific Mutant
    IKKEE: In vitro AMPK-kinaseanalysen udføres i overensstemmelse med trin 2.2-2.4 ved anvendelse af 0,4 μg renset vildtype-GST-Nrf2 eller GST-Nrf2-S558A-mutanten uden peptidinhibitorer. Følg alle retningslinjer for strålingssikkerhed, der er beskrevet i trin 1.
    1. Forbered en reaktionsbuffer på is med 0,15 μg AMPK, 0,4 μg mutant eller wildtype GST-Nrf2 og 6 μl 5 kinasebuffer. Fyld op til 30 μL med sterilt DW.
    2. Tilsæt 1 μL [γ-32P] -ATP (1 μCi / μL) til reaktionsrørene på is. Bland reaktionsbufferen ved pipettering op og ned flere gange og centrifuger.
    3. Inkuber prøverne i en varmeblok ved 30 ° C i 30 minutter.
    4. Stop kinasereaktionen ved at tilsætte 3 μl 10 x SDS prøvebuffer.
    5. Kør i en 7,5% SDS-PAGE gel ved 70 V i 20 minutter og derefter ved 140 V i 1 time.
    6. Fastgør gelen med fikseringsbufferen i 20 minutter, flyt den på filterpapiret og dækk gelen med en gennemsigtighedEnt wrapper.
    7. Tør gelen med vakuumgel-tørretumbleren ved 80 ° C i 1 time og udsæt den derefter natten over til enten en fosforskærm eller en røntgenfilm.
    8. Scan phosphorskærmen med en phosphor-billedbeholder og flyt gelen til et glasrør til CBB-farvning efter visualisering i henhold til trin 2.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 og Figur 2 viser resultaterne fra gentagne forsøg i det tidligere rapporterede papir 8 . Tre forskellige oligopeptider med 10 rester efterligner de formodede AMPK-målsteder (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558) blev syntetiseret og anvendt som konkurrenter i den Vitro kinase assay. Fosforyleringen af ​​Nrf2 ved AMPK blev væsentligt reduceret i nærvær af oligopeptid nr. 3 ( figur 1 ). Dernæst blev en site-directed mutagenesis assay udført for at validere resultatet af det peptidomimetiske eksperiment. I betragtning af den inhiberende effekt af oligopeptid nr. 3 på den AMPK-medierede phosphorylering af Nrf2 ( Figur 1 ) genererede vi en S558A-Nrf2-mutant. Fosforyleringsniveauerne blev sammenlignet mellem vildtypen nrf2 og S558A mutant ved anvendelse af in vitro AMPK kinase assayet. Den enkelt aminosyresubstitution af Nrf2 (Ser → Ala ved 558) forhindrede AMPK fra phosphorylering Nrf2, hvilket indikerer, at AMPK direkte phosphorylerer Nrf2 ved Ser558 ( Figur 2 ).

figur 1
Figur 1: In vitro kompetitivt AMPK kinase assay. In vitro kinase assays blev udført i nærvær af de indikerede oligopeptider (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558).

Figur 2
Figur 2: In vitro AMPK kinase assay ved anvendelse af et site-specifikt mutantprotein. In vitro kinase assays blev udført i nærværelse af wildtYpe GST-Nrf2 eller dens S558A mutant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som en enkel og bekvem måde til at vurdere ægtheden af ​​de forudsagte phosphoryleringssteder medieret af AMPK beskriver vi her et in vitro kinase assay, der kan anvendes til at opdage et specifikt phosphoryleringssted ved anvendelse af konkurrencedygtige peptider og for at verificere det ved anvendelse af en site-specifik mutant . De repræsentative data opnået fra det in vitro- konkurrencedygtige AMPK-aktivitetsassay matchede resultaterne fra et assay ved anvendelse af et site-rettet mutantprotein, hvilket indikerer, at peptidkonkurrenceanalysen er et nyttigt værktøj til bestemmelse af et phosphoryleringssted. Denne metode blev også anvendt i undersøgelsen identificering af det specifikke sted phosphoryleret af PKCδ, som phosphorylerer Nrf2 ved serin 403. Da peptiderne binder konkurrencedygtigt til et protein, kan princippet også anvendes på et in vitro GST-tilbagetrækningsassay for at identificere et bindingsmotiv 10 , 11 . Desuden er denne peptidomimTic-metoden kan også være anvendelig til identifikationen af ​​andre posttranslationelle modifikationer, såsom acetylering ved lysinrester.

Ved anvendelse af denne protokol kan det være vanskeligt at opløse nogle hydrofobe peptider. Hvis et peptid er uopløseligt i en kinasebuffer, kan det opløse det i 20% DMSO. For at opløse ekstremt hydrofobe peptider, forsøg først at opløse det i 100% DMSO og fortynd derefter opløsningen med en kinase buffer. Sonikering kan også være til hjælp ved opløsning af peptiderne. Hvis det forbliver uopløseligt, bør et peptid, som efterligner det formodede sted, udvides til at øge opløseligheden.

Protokollen indført i dette papir beskriver et " in vitro system", hvori en renset kinase og substrat reageres. I in vitro- systemet vil små forskelle i koncentrationen af ​​konkurrencedygtige peptider ikke påvirke resultaterne, medmindre koncentrationen er lavere end substratproteinet. REsult opnået fra et in vitro-forsøg indbefatter den iboende mulighed for at være en artefaktuel begivenhed frembragt ved kunstig nærhed og den høje koncentration af reaktanter. For at eliminere dette perspektiv bør fortolkningen af ​​data ledsages af resultaterne fra cellebaserede eksperimenter. En anden mulighed for at opnå falske positive resultater ved anvendelse af peptider kan skyldes ændringer i substratkonformation og / eller kinaseigenkendelse. For at udelukke denne mulighed er det nødvendigt at foretage bekræftelsesforsøg med mutante proteiner.

På den anden side kan falske negative data også produceres fra dette system. Mange kinaser virker som proteinkomplekser i den cellulære kontekst og kræver co-faktorer for fuld funktionalitet. AMPK er et repræsentativt proteinkinase kompleks bestående af AMPKa, AMPKβ og AMPKγ subunits, og bindingen af ​​AMP til AMPKγ-underenheden er nødvendig for aktiveringen af ​​kinasen. Faktisk AMPKPhosphoryler ikke Nrf2 i en AMP-fri kinase buffer (data ikke vist). Det skal således bemærkes, at AMP skal opløses i kinasereaktionsbufferen til en vellykket in vitro- analyse.

Anvendelsen af ​​massespektrometri til identifikation af phosphoryleringssteder, den mest populære metode, har adskillige tekniske begrænsninger, der ofte genererer falsk-negative signaler ved hjælp af facile tab af phosphorsyre under fragmenteringsprocessen 7 . En peptidmikroarray-metode kan være den anden mulighed for at søge efter phosphoryleringssteder. Denne metode anses imidlertid for tidskrævende og dyr. Som en alternativ metode til screening af formodede phosphoryleringssteder kan den konkurrencedygtige peptidmetode være en bekvem og billig måde at opnå indsigt i karakteren af ​​et formodet phosphoryleringssted.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 og nr. 2014M1A3A3A02034698).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 15630
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 208337
EGTA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E3889
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D9779
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G9422
Na3VO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 450243
Protease inhibitor cocktail Calbiochem, Nottingham, UK 539134
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A2383
AMP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1752
AMPK Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 14-840
Nrf2 (WT) Abnova, Taipei City, Taiwan H00004780-P01
[γ-32P]-ATP PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA NEG502A
EZblue staining reagent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1041
Pfu turbo DNA polymerase Agilent Technologies, Santa Clara, CA 600250
dNTP mix Agilent Technologies, Santa Clara, CA 200415-51 Avoid multiple thaw and freezing cycle
DpnI New England Biolabs, Ipswich, MA R0176S
LB broth Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands L1704
Ampicillin Affymetrix, Santa Clara, CA 11259
Agarose LE iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea 32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 161-0400
Bovine Serum Albumin Bovogen Biologicals, Victoria, Australia BSA100
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare, Marlborough, MA 17-0756-01
Acetic Acid glacial Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea
Methyl alcohol
 
 		 Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea 5558-4410
Name Company Catalog Number Comments
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare, Marlborough, MA 28-9558-09
SDS-PAGE kit Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 1658001FC
Vacuum pump Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-178
Gel dryer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-1746
Dancing shaker FINEPCR, Seoul, Korea CR300 The machine is needed for washing step
PCR machine Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA T100
Incubator/shakers N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea NB-205L
Microcentrifuges LABOGENE, Seoul, Korea 1730R
Chromatography columns Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 732-1010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
  2. Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
  3. Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
  4. Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
  5. Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
  6. Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
  7. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
  8. Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
  9. Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
  10. Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
  11. Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).

Tags

Biochemistry udgave 123, peptidinhibitor phosphorylering AMPK Nrf2 konsensusmotiv site-directed mutagenese
Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joo, M. S., Koo, J. H., Shin, S. B., … More

Joo, M. S., Koo, J. H., Shin, S. B., Yim, H., Kim, S. G. Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination. J. Vis. Exp. (123), e55708, doi:10.3791/55708 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter