Summary
Los ensayos de competición de péptidos se usan ampliamente en una variedad de experimentos moleculares e inmunológicos. Este documento describe un método detallado para un ensayo de quinasa que compite con oligopéptido in vitro y los procedimientos de validación asociados, que pueden ser útiles para encontrar sitios de fosforilación específicos.
Abstract
La fosforilación de proteínas en sitios específicos determina su conformación e interacción con otras moléculas. Por lo tanto, la fosforilación proteica afecta las funciones biológicas y las características de la célula. Actualmente, el método más común para descubrir los sitios de fosforilación es el análisis por cromatografía líquida / espectrometría de masas (LC / MS), un método rápido y sensible. Sin embargo, los restos de fosfato relativamente lábiles se liberan a menudo de los fosfopéptidos durante la etapa de fragmentación, que a menudo produce señales falsas negativas. En tales casos, un ensayo de quinasa in vitro tradicional utilizando mutantes dirigidos sería más preciso, pero este método es laborioso y requiere mucho tiempo. Por lo tanto, puede ser ventajoso un método alternativo que utiliza la competencia de péptidos. El motivo de reconocimiento consenso de la proteína quinasa activada por monofosfato de adenosina 5 '(AMPK) se ha establecido 1 y se validó usando un culo de biblioteca de péptidos de exploración posicionalAy 2 Por lo tanto, los sitios de fosforilación de AMPK para un nuevo sustrato podrían predecirse y confirmarse mediante los ensayos de competición de péptidos. En este informe, describimos los pasos detallados y procedimientos para el ensayo de quinasa competitiva de oligopéptido in vitro ilustrando la fosforilación del factor 2 relacionado con el eritrodo 2 del factor nuclear de AMPK (Nrf2). Para autenticar el sitio de fosforilación, llevamos a cabo un ensayo de quinasa in vitro secuencial utilizando un mutante específico del sitio. En general, el ensayo de competición de péptidos proporciona un método para detectar múltiples sitios potenciales de fosforilación e identificar sitios para validación por los mutantes del sitio de fosforilación.
Introduction
La fosforilación de proteínas en un residuo específico juega un papel importante en una amplia gama de procesos celulares. Por lo tanto, la comprensión de las redes de señalización requiere la identificación de sitios específicos de fosforilación. Además, el sitio de fosforilación determina el efecto sobre la función de la proteína porque los dominios individuales dentro de una proteína poseen estructuras y funciones diferentes. La actividad del Factor 2 del factor nuclear eritroide 2 (Nrf2), un factor clave de transcripción antioxidante, es regulada bidireccionalmente a través de la fosforilación en diferentes sitios. Nuestros estudios se han centrado en las quinasas que catalizan la fosforilación de Nrf2. La respuesta al estrés de Nrf2 frente a la exposición oxidativa se produce rápidamente, principalmente a través de la fosforilación en la serina 40 y mediada por la proteína quinasa C (PKC) -δ, que activa Nrf2 3 , 4 . Por el contrario, Fyn cataliza la fosforilación inhibitoria de Nrf2 en la tirosina 568 para el control estricto de la actividad 5 .
El método más común utilizado para descubrir sitios de fosforilación es el análisis de cromatografía líquida / espectrometría de masas (LC / MS). Los datos de mapeo de sitios de fosforilación rápidos y altamente sensibles pueden generarse de esta manera; Sin embargo, tiene varias limitaciones técnicas, a menudo generando señales falsas-negativas. La mala cobertura de la secuencia ocurre con frecuencia en el análisis LC / MS. Para identificar los sitios de fosforilación, la información sobre la máxima cobertura de aminoácidos de una proteína es necesaria [ 6] . La proteólisis de la proteína de interés con varias proteasas durante la etapa de digestión puede ser de ayuda para mejorar la cobertura de la secuencia. Otro obstáculo para la identificación de los residuos de fosforilación es la fácil pérdida de ácido fosfórico que se observa con frecuencia para los péptidos fosforilados con serina y treonina 6,7. Los restos de fosfato lábiles son a menudoLiberado de fosfopéptidos durante el proceso de fragmentación 7 . La segunda opción cuando se buscan sitios de fosforilación está usando un método de microarrays de péptidos. Es posible detectar los sitios diana de cinasa usando un chip de microarrays que contiene fragmentos peptídicos derivados de una proteína de interés. Sin embargo, debido al requisito de equipo para la producción y detección de un chip de microarrays, el método de microarrays de péptidos se considera largo y costoso.
Para superar estos desafíos, se puede usar un ensayo de quinasa competitiva de oligopéptido in vitro para una proteína quinasa con motivos de reconocimiento conocidos. Si se establece el motivo de reconocimiento de consenso de una quinasa, se pueden predecir sitios de fosforilación putativos de un sustrato candidato, y se puede validar la autenticidad de los sitios. El método más convincente para este procedimiento es mostrar la abrogación de la fosforilación en una proteína mutante en la que la predictaD sustituido con un aminoácido no fosforilable ( es decir, serina o treonina a alanina, tirosina a fenilalanina). Sin embargo, la producción y aislamiento de proteínas mutantes lleva mucho tiempo. Como alternativa en la fase inicial de la investigación, el ensayo competitivo de la cinasa peptídica es sencillo y conveniente. Aquí, describimos un protocolo para un ensayo de competición de péptidos in vitro y para la validación del sitio de fosforilación.
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Protocol
1. Seguridad
PRECAUCIÓN: Este protocolo utiliza [γ-32P] -ATP para evaluar la actividad de AMPK. El fósforo-32 es un isótopo radiactivo, que emite en gran parte radiación beta. Dado que el tamaño de una partícula beta es extremadamente pequeño, puede penetrar fácilmente la ropa y la piel. Tanto la exposición externa como la interna a la radiación beta pueden ser nocivas para la salud humana, incluyendo causar quemaduras en la piel y daños en los tejidos.
- Lleve a cabo todos los pasos que requieren el uso de [γ- 32 P] -ATP usando la protección apropiada, tal como el blindaje acrílico.
- Asegúrese de que todo el personal esté equipado con dosímetros electrónicos personales (EPD) para monitorear el grado de exposición a la radiación dañina durante todos los procedimientos.
- Maneje la radiación de código abierto sólo después de la capacitación apropiada y aprobación reglamentaria.
NOTA: Aquí, todos los experimentos se realizaron después de la finalización del entrenamiento sobre el uso de radiación de fuente abierta en la Universidad Nacional de SeúlY la aprobación del gobierno coreano (nssc.go.kr/nssc/en). - Deseche los residuos radiactivos de acuerdo con las regulaciones locales.
NOTA: Aquí se siguieron las directivas del Instituto de Protección Ambiental y Seguridad de la Universidad Nacional de Seúl. Los siguientes son una lista de los reguladores en los Estados Unidos y los países europeos: Los Estados Unidos de América, Estados Unidos Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Reino Unido, Ejecutivo de Salud y Seguridad (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Francia, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Y Alemania, Ministerio Federal de Medio Ambiente, Conservación de la Naturaleza, Construcción y Seguridad Nuclear (BMU) (http://www.bmu.de).
2. Ensayo de quinasa competitiva in vitro
- Construcción de péptidos competitivos
- Determinar el motivo consenso fosforilado por AMPK.
NOTA: AMPK reconoce el motivo de consenso, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. En la secuencia de consenso, Φ representa aminoácidos hidrofóbicos ( es decir, valina [V], leucina [L], metionina [M] e isoleucina [I]) y β representa aminoácidos básicos ( es decir, lisina [K], arginina [ R], e histidina [H]) 1 . - Seleccionar restos de serina o treonina de secuencias diana de acuerdo con el motivo de consenso anterior. Utilizar tres sitios putativos de Nrf2 humano (# 1, 148-157 que comprende Ser153; # 2, 330-339 que comprende Ser335 y # 3, 553-562 que comprende Ser558) 8 .
- Sintetizan comercialmente péptidos de 10 residuos que imitan los sitios putativos. Obtener el producto sintetizado como un polvo liofilizado con una pureza superior al 98% para cada péptido.
- Disolver los péptidos utilizando un tampón de quinasa para conseguir una concentración de 71,667 g / l. Si un péptido no es soluble en un tampón de quinasa, disolverlo en DMSO al 20%. Si permanece insoluble, un péptido que mimetiza el putPuede extenderse para aumentar la solubilidad.
- Determinar el motivo consenso fosforilado por AMPK.
- Ensayo de quinasa AMPK competitiva in vitro
- Preparar el tampón de quinasa 5 x como sigue: HEPES 100 mM, pH 7,4; MgCl $ ₂ $ 25 mM; 5 mM de EGTA; 5 mM de DTT; Β-glicerofosfato 125 mM (inhibidor de serina / treonina fosfatasa); Na _ { 3 } VO _ {4} 5 mM (inhibidor de tirosina fosfatasa); 0,5% (v / v) de inhibidor de proteasa conjunto de cóctel III, ATP frío 1 mM; Y 500 mu M de AMP.
NOTA: AMP es un componente esencial del buffer de quinasa para probar la actividad de AMPK. El tampón puede usarse para medir la actividad tanto de serina / treonina quinasas como de tirosina quinasas. - Descongele la siguiente proteína recombinante y péptidos sintéticos sobre hielo: AMPK; Nrf2; Y oligopeptidos # 1, # 2 y # 3.
- Preparar un tampón de reacción sobre hielo: 0,15 μg de AMPK, 0,4 μg de Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg de oligopeptido (~ 300 nmol) y 6 μl de tampón quinasa 5 ×. UNAjustar el volumen final a 30 μl con agua destilada estéril (DW).
NOTA: La adición de [ gamma - 32P] - ATP después de preparar el tampón de reacción puede reducir la señal radiactiva debida a autofosforilación de quinasa.
- Preparar el tampón de quinasa 5 x como sigue: HEPES 100 mM, pH 7,4; MgCl $ ₂ $ 25 mM; 5 mM de EGTA; 5 mM de DTT; Β-glicerofosfato 125 mM (inhibidor de serina / treonina fosfatasa); Na _ { 3 } VO _ {4} 5 mM (inhibidor de tirosina fosfatasa); 0,5% (v / v) de inhibidor de proteasa conjunto de cóctel III, ATP frío 1 mM; Y 500 mu M de AMP.
- Ejecución de los reactivos
NOTA: Todos los procesos a continuación deben llevarse a cabo bajo protección con un escudo acrílico, estante o bloque, así como equipo de protección personal apropiado.- Ajustar los bloques de calefacción a 30 ° C antes de iniciar el experimento.
- Añadir 1 μl de [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) a los tubos de reacción sobre hielo. Mezclar el tampón de reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
NOTA: La radiactividad de 32 P tiene una semivida corta de aproximadamente 14 días 9 . Ajustar el volumen considerando la semivida ( por ejemplo, después de un mes de la producción de [γ- 32 P] -ATP, añadir 4 μL de [γ- 32 P]-ATP para hacer 1 μCi). - Incubar la muestra en el bloque de calentamiento a 30 ° C durante 15-30 min. Durante esta etapa, se preparan geles de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato sódico al 7,5% (SDS-PAGE). Ajustar el porcentaje del gel de acuerdo con el tamaño de la proteína diana.
- Detener la reacción de quinasa añadiendo 3 μl de tampón de muestra SDS 10x (glicerol al 10% (v / v), SDS al 20% (p / v), ditiotreitol al 15,42% (p / v), 0,5% M de Tris - HCl (pH 6,8) y azul de bromofenol al 0,02% (p / v)). Mezclar el tampón de reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
- Hacer pasar las muestras en un gel SDS-PAGE al 7,5% a 70 V durante 20 min y continuamente a 140 V durante 1 h.
NOTA: La línea azul de bromofenol al final del gel contiene señales radioactivas extremadamente altas. Se recomienda retirar el gel por debajo de la línea azul antes de proceder al siguiente paso para reducir las señales de fondo. - Después de SDS-PAGE, retire suavemente el gel del molde. Coloque el gel en un vaso tUbe para el siguiente paso.
- Fijar el gel con tampón de fijación durante 20 min (50% de metanol y 10% de ácido acético glacial).
- Mueva suavemente el gel sobre papel de filtro y cúbralo con una envoltura transparente. Tenga en cuenta que el gel se puede rasgar fácilmente en este paso. Secar el gel con un secador de gel de vacío a 80 ° C durante 1 h.
- Visualización
- Exponer el gel a una pantalla de fósforo o una película de rayos X durante la noche (generalmente durante aproximadamente 16 h).
NOTA: Una pantalla de fósforo puede reutilizarse después de la exposición a la luz extra luminosa. Cuando se utiliza una película de rayos X, exponer el gel durante dos días. Las películas de rayos X tienen menor sensibilidad que las pantallas de fósforo. - Escanear la pantalla de fósforo con un lector de imágenes de fósforo. Exporte la imagen como un archivo TIFF o de mapa de bits de alta resolución.
- Después de la visualización, mueva el gel a un recipiente de vidrio o plástico para tinción con azul brillante de Coomassie (CBB).
- Lave el gel con DW. Descartar el DW y teñirE gel con el reactivo de tinción durante 1 h.
- Deseche el reactivo y destain el gel con DW durante 1 h o durante la noche. Coloque el gel entre películas de plástico transparentes (o el equivalente) para escanear con un escáner de oficina.
- Exponer el gel a una pantalla de fósforo o una película de rayos X durante la noche (generalmente durante aproximadamente 16 h).
3. Ensayo de quinasa in vitro utilizando un mutante específico del sitio
- Mutagénesis dirigida al sitio de pGEX-Nrf2
- Mutagenic Primer Design
NOTA: El diseño de cebadores mutagénicos adecuados es crítico para el éxito de la mutagénesis. Las siguientes son algunas consideraciones para diseñar cebadores mutagénicos. Crear una imprimación que consta de 25 a 45 bases, con la mutación deseada en el centro de la imprimación. El cebador debe tener 40-60% de contenido de GC y terminar con una o más bases G o C. Asegúrese de que la Tm del cebador sea igual o superior a 78 ° C de acuerdo con la fórmula [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / longitud de las bases) -% desajuste].
NOTA: Purifique elPorque su pureza es importante para la eficacia de la mutación. Hay varios sitios web para el diseño de cebadores mutagénicos.- Abra el programa de diseño de cebadores para "diseñar cebadores para mutagénesis dirigida" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Pegue la secuencia de ADN Nrf2 humana (número de acceso NM_006164.4) y seleccione el botón "subir traducido".
- Seleccione el resto de serina 558 de la secuencia de aminoácidos traducida para ser cambiado a alanina. Utilizando el cebador mutagénico, sustituir el codón por serina de agc a gcc, por alanina.
- Considere la longitud del cebador, T m , y el contenido de GC.
NOTA: El cebador mutagénico se diseña finalmente como 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Reacción para la síntesis de la cadena mutante utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Preparar la mezcla de reacción de PCR sobre hielo: tampón de reacción 10x, 50 ng dePGEX-GST-Nrf2, 125 ng de cebador directo, 125 ng de cebador inverso, 1 μl de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), ADN polimerasa Pfu de 2,5 U y DW estéril a 50 μl.
- Ejecutar la PCR para la síntesis de la cadena mutante pGEX-GST-Nrf2 con el siguiente programa de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 30 s; 18 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 55 ° C durante 1 min ya 68 ° C durante 90 s; Y 1 ciclo a 68 ° C durante 5 min.
NOTA: Dependiendo de la longitud del plásmido, los parámetros de ciclo pueden ser cambiados. - Colóquelo en hielo durante 2 min para enfriar los reactivos para el siguiente paso. Alternativamente, almacenarlos a 4 ° C durante la noche.
- Digestión de Dpn I y la selección de un plásmido mutante
- Añadir 1 μl de enzima de restricción Dpn I (10 U / μl) a cada uno de los reactivos después del enfriamiento. Mezcle bien y suavemente pipeteando y centrifugando durante 1 min.
- Incubar a 37 ° C durante 2 h para digerir parental pGEX-GST-Nrf2 doble-ADN trenzado.
- Descongelar suavemente las células supercompetentes DH5 α en hielo.
- Añadir 50 μl del reactivo a 150 μl de células supercompetentes DH5 α precargadas e incubar en hielo durante al menos 30 min.
- Transfiera los tubos a un bloque calentador precalentado a 42 ° C y déjelos durante 90 s. Colócalos en hielo durante 2 min.
- Se añade el caldo de lisogénesis precalentado (LB) a las células α DH5 transformadas e incuba a 37 ° C durante 1 h con agitación a 180 rpm.
- Se separan las células transformadas en placas de agar LB-ampicilina y se incuban durante la noche a 37ºC.
NOTA: La ampicilina se utiliza para la selección ya que el plásmido GEX-GST-Nrf2 tiene el marcador de resistencia a la ampicilina. Utilizar antibióticos apropiados, dependiendo del marcador de resistencia del plásmido mutagenizado. - Elija una sola colonia de la placa, transfiérala a 5 ml de LB-ampicilina e incube durante la noche a 37 ° C con agitación a 180 rpm.Para la verificación de la secuencia mutagénica, evaluar al menos tres colonias.
- Extraer el ADN usando un kit de miniprep de ADN para el análisis de la secuencia de ADN; Siga el protocolo del fabricante.
- Verificar las secuencias de ADN mutagénico utilizando un analizador automático de secuencia de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilizar al menos 200 ng del constructo de ADN para la verificación de secuencias mutantes.
- Mutagenic Primer Design
- Purificación de la proteína recombinante GST-Nrf2
- Expresión de la proteína de fusión mutagénica GST-Nrf2 en Escherichia coli
- Transformar el plásmido mutagénico pGEX-GST-Nrf2 en células BL21 . Inocular una sola colonia en 25 ml de caldo LB que contiene ampicilina (100 μg / mL) e incubar a 37 ° C en un rotador durante la noche.
- Inocular las células cultivadas en 100 ml de caldo LB que contiene ampicilina (100 μg / ml) a una relación de dilución 1: 100.
- Incubar a 37 ° C sobre una rotaciónO hasta que la absorbancia a 600 nm alcance alrededor de 0,4-0,8 (aproximadamente 4 h).
- Añadir 100 μl de IPTG 1 M a 100 ml de células cultivadas para preparar una concentración final de IPTG 1 mM.
- Incubar las células a 30 ° C en un rotador durante 6 h o durante la noche para la expresión de proteínas.
- Centrifugar las células a 5.000 xg durante 20 min y resuspender los sedimentos celulares con 1 ml de tampón de lisis bacteriana (HEPES 25 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM, CHAPS al 0,1%, pepstatina 1 μg / ml, leupeptina 0,5 μg / Y PMSF 1 mM) sobre hielo.
- Lyse los gránulos de células utilizando un homogeneizador ultrasónico con intervalos de 2 s durante 2 min a 50% de la potencia máxima de salida.
- Centrifugar las células a 12.000 × g durante 15 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante.
- Purificación de la proteína recombinante GST-Nrf2
- Preparar 200 μl de perlas de glutatión-agarosa al 50% (v / v) y lavar con 1 ml de PBS (pH 7,3; NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2 10 mM _ { 4 }, y KH _ { 2 } PO _ { 4 } 1,8 mM). Recoger las perlas por centrifugación a 500 xg durante 1 min. Repita el paso de lavado tres veces.
- Se añade el lisado celular a los 200 μl preparados de perlas de glutatión-agarosa al 50% (v / v) y se incuba a 4ºC en un rotador de extremo sobre extremo durante 2 h.
- Recoger las perlas de glutatión-agarosa combinadas con la proteína GST-Nrf2 por centrifugación a 500 xg durante 1 min. Retirar el sobrenadante con una jeringa de 1 ml con una aguja de 31 G.
- Lavar las perlas con 1 ml de PBS (pH 7,3), como en el paso 1.
- Añadir 500 μl de tampón de elución (Tris-HCl 50 mM y glutationa reducida 10 mM, pH 8,0) a las perlas de glutatión-agarosa combinadas con GST-Nrf2. Incubar a 4 ° C en un rotador de extremo a extremo durante 30 min.
- Centrifugar a 500 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante.
- Añadir de nuevo 300 μl de tampón de elución a las perlas y repetir los pasos 3.2.2.5-3.2.2.6 dos veces.
- Confirmación de la proteína GST-Nrf2 purificada
- Preparar 5 μl de la muestra para la visualización de la cantidad de proteína con 0,5 μg de proteína BSA estándar.
- Ejecutar las muestras en un 7,5% SDS-PAGE gel a 70 V durante 20 min y luego a 140 V durante 60 min.
- Se tiñe el gel con solución de tinción CBB al 0,1% (0,1 g de CBB R250, 40 ml de metanol al 99%, 10 ml de ácido acético glacial y 50 ml de H2O destilada) durante 2 h y se separan (30 ml de metanol, 10 ml de ácido acético glacial y 60 ml de H2O destilada) hasta que se muestren claramente las bandas.
- Coloque el gel descompuesto sobre el papel de filtro y cubra con una envoltura transparente. Secar el gel con un secador de gel de vacío a 80 ° C durante 1 h.
- Determine la cantidad de proteína GST-Nrf2 mutante con densitometría para el ensayo de quinasa AMPK in vitro .
- Expresión de la proteína de fusión mutagénica GST-Nrf2 en Escherichia coli
- Ensayo de actividad AMPK in vitro con un mutante especıfico de sitio
NOE: El ensayo de quinasa AMPK in vitro se lleva a cabo de acuerdo con los pasos 2.2-2.4, usando 0,4 μg de GST-Nrf2 de tipo salvaje purificado o el mutante GST-Nrf2-S558A sin inhibidores peptídicos. Siga todas las pautas de seguridad radiológica descritas en el paso 1.- Preparar un tampón de reacción sobre hielo con 0,15 μg de AMPK, 0,4 μg de GST-Nrf2 mutante o de tipo salvaje y 6 μl de tampón de 5 quinasas. Llene hasta 30 μL con DW estéril.
- Añadir 1 μl de [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μl) a los tubos de reacción sobre hielo. Mezclar el tampón de reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y centrifugar.
- Incubar las muestras en un bloque de calentamiento a 30 ° C durante 30 min.
- Detener la reacción quinasa mediante la adición de 3 μ l de 10 × SDS buffer de muestra.
- Se ejecutan en un gel de SDS-PAGE al 7,5% a 70 V durante 20 min ya continuación a 140 V durante 1 h.
- Fijar el gel con el tampón de fijación durante 20 minutos, moverlo sobre el papel de filtro y cubrir el gel con un papel transparenteEnvoltura
- Se seca el gel con el secador de gel de vacío a 80 ° C durante 1 h y luego se expone durante la noche a una pantalla de fósforo o una película de rayos X.
- Escanear la pantalla de fósforo con un marcador de fósforo y mover el gel a un tubo de vidrio para la tinción CBB después de la visualización de acuerdo con el paso 2.4.
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Representative Results
La Figura 1 y la Figura 2 demuestran los resultados de los experimentos repetidos en el informe anterior 8 . Se sintetizaron tres diferentes oligopéptidos de 10 residuos que imitan los putativos sitios diana de AMPK (# 1, 148-157 que comprenden Ser153; # 2, 330-339 que comprende Ser335 y # 3, 553-562 que comprende Ser558) y se usaron como competidores en el gen Vitro quinasa. La fosforilación de Nrf2 por AMPK se redujo en gran medida en presencia de oligopéptido # 3 ( Figura 1 ]. A continuación, se realizó un ensayo de mutagénesis dirigido a sitio para validar el resultado del experimento peptidomimético. Dado el efecto inhibitorio de oligopéptido # 3 en la fosforilación mediada por AMPK de Nrf2 ( Figura 1 ], hemos generado un S558A-Nrf2 mutante. Los niveles de fosforilación se compararon entre el tipo salvaje Nrf2 y el S558A usando el ensayo de quinasa AMPK in vitro . La única sustitución de aminoácidos de Nrf2 (Ser → Ala a 558) impidió AMPK de fosforilar Nrf2, lo que indica que AMPK fosforila directamente Nrf2 en Ser558 ( Figura 2 ].
Figura 1: Ensayo de quinasa AMPK competitiva in vitro . Los ensayos de quinasa in vitro se realizaron en presencia de los oligopéptidos indicados (# 1, 148-157 que comprenden Ser153; # 2, 330-339 que comprende Ser335 y # 3, 553-562 que comprende Ser558).
Figura 2: Ensayo de quinasa AMPK in vitro usando una proteína mutante específica del sitio. Los ensayos de quinasa in vitro se realizaron en presencia de wildtYpe GST-Nrf2 o su mutante S558A.
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Discussion
Como una manera sencilla y conveniente de evaluar la autenticidad de los sitios de fosforilación predichos mediados por AMPK, aquí se describe un ensayo de quinasa in vitro que puede usarse para descubrir un sitio específico de fosforilación utilizando péptidos competitivos y verificarlo usando un mutante específico de sitio . Los datos representativos obtenidos del ensayo de actividad de AMPK competitivo in vitro coincidían con los resultados de un ensayo usando una proteína mutante dirigida al sitio, lo que indica que el ensayo de competición de péptidos es una herramienta útil para determinar un sitio de fosforilación. Este método también se utilizó en el estudio que identifica el sitio específico fosforilado por PKCδ, que phosphorylates Nrf2 en la serina [40, 3] . Dado que los péptidos se unen competitivamente a una proteína, el principio también se puede aplicar a un ensayo de desprendimiento de GST in vitro para identificar un motivo de unión 10 , 11 . Además, este peptidomimeTic también puede ser aplicable a la identificación de otras modificaciones postraduccionales, tales como la acetilación en residuos de lisina.
Usando este protocolo, puede ser difícil disolver algunos péptidos hidrófobos. Si un péptido es insoluble en un tampón de quinasa, puede ser útil disolverlo en DMSO al 20%. Para disolver péptidos extremadamente hidrófobos, primero intente disolverlo en DMSO al 100% y luego diluir la solución con un tampón de quinasa. La sonicación también puede ser de ayuda en la disolución de los péptidos. Si permanece insoluble, se debe extender un péptido imitando el sitio putativo para aumentar la solubilidad.
El protocolo introducido en este documento describe un "sistema in vitro " en el que se hace reaccionar una quinasa purificada y sustrato. En el sistema in vitro , pequeñas diferencias en la concentración de péptidos competitivos no afectarán los resultados a menos que la concentración sea menor que la proteína sustrato. El rObtenido de un experimento in vitro incluye la posibilidad inherente de ser un evento artefactual producido por proximidad artificial y la alta concentración de reactivos. Para eliminar esta perspectiva, la interpretación de los datos debe ir acompañada de los resultados de experimentos basados en células. Otra posibilidad de obtener resultados falsos positivos usando péptidos puede deberse a alteraciones en la conformación del substrato y / o reconocimiento de quinasa. Para excluir esta posibilidad, es necesario hacer experimentos de confirmación con proteínas mutantes.
Por otro lado, los datos falsos negativos también se pueden producir a partir de este sistema. Muchas quinasas actúan como complejos de proteínas dentro del contexto celular y requieren cofactores para una funcionalidad completa. AMPK es un complejo de proteína quinasa representativo compuesto por subunidades AMPKα, AMPKβ y AMPKγ, y la unión de AMP a la subunidad AMPKγ es necesaria para la activación de la quinasa. De hecho, AMPKNo fosforilan Nrf2 en un tampón de quinasa libre de AMP (datos no mostrados). Por lo tanto, debe observarse que AMP debe disolverse en el tampón de reacción de quinasa para un ensayo in vitro exitoso.
El uso de la espectrometría de masas para la identificación de sitios de fosforilación, el método más popular, tiene varias limitaciones técnicas, a menudo generando señales falsas negativas por la pérdida fácil de ácido fosfórico durante el proceso de fragmentación [ 7] . Un método de microarrays de péptidos puede ser la segunda opción para buscar sitios de fosforilación. Sin embargo, este método se considera largo y costoso. Como un método alternativo para cribar sitios de fosforilación putativos, el método peptídico competitivo puede ser una manera conveniente y barata de comprender mejor la naturaleza de un sitio de fosforilación putativo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea subvención financiada por el gobierno de Corea (MSIP) (No. 2015R1A2A1A10052663 y No. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
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- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
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- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
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- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
