Summary
هنا، نقدم طريقة مجسمة، المجزئ البصري، وتستخدم لتحديد تشكيل الخلايا العصبية الجديدة، وبقائهم على قيد الحياة، في الحصين الفئران التالية التحفيز إليكتركونفولزيف. عندما تنفذ بشكل صحيح، حساسية وكفاءة الطرق المجسمة يضمن تقديرات دقيقة مع دقة ثابتة محددة سلفا.
Abstract
تم تصميم الطرق المجسمة لوصف المعلمات الكمية دون افتراضات حول حجم وشكل وتوجيه وتوزيع الخلايا أو الهياكل. وكانت هذه الأساليب ثورية للتحليل الكمي للدماغ الثدييات، حيث السكان الخلية الحجمي مرتفعة جدا للعد يدويا، وعلم التجسيم هو الآن الأسلوب المفضل كلما تقديرات الكميات ثلاثية الأبعاد تحتاج إلى أن تستخرج من القياسات على ثنائي الأبعاد أقسام. جميع الأساليب المجسمة هي من حيث المبدأ غير منحازة. ومع ذلك، فإنها تعتمد على المعرفة المناسبة حول هيكل الفائدة وخصائص الأنسجة. ويستند علم التجسس على منهجية عشوائية عشوائيا أخذ العينات (سورس)، مع تعديل أخذ العينات إلى المستوى الأكثر كفاءة فيما يتعلق الدقة، وتوفير معلومات موثوقة وكمية عن هيكل كامل من الفائدة. هنا نقدم الكسور البصرية بالتزامن مع بردو المناعية تيo تقدير إنتاج وبقاء الخلايا العصبية التي شكلت حديثا في طبقة الخلايا الحبيبية (بما في ذلك المنطقة الفرعية الحبيبية) من الحصين الفئران التالية التحفيز الكهربائي، الذي هو من بين المحفزات أقوى من الخلايا العصبية. تم تصميم تقنية الكسور البصرية لتوفير تقديرات من إجمالي عدد الخلايا من أقسام سميكة عينات من الهيكل الكامل. أقسام سميكة توفر الفرصة لمراقبة الخلايا في كامل 3-D مدى وبالتالي، تسمح لتصنيف الخلايا سهلة وقوية على أساس المعايير المورفولوجية. عندما تنفذ بشكل صحيح، وحساسية وكفاءة المفرق البصري يوفر تقديرات دقيقة مع دقة ثابتة ومحددة سلفا.
Introduction
وقد يتطلب التحديد الكمي للخلايا في هيكل ثلاثي الأبعاد (3-D) الحصول على تقديرات تستند إلى مبادئ غير متحيزة. وحتى اليوم، كثيرا ما تستخدم الدراسات أساليب ثنائية الأبعاد (2-D) للإبلاغ عن بيانات الهياكل ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا تأخذ في الاعتبار الطبيعة غير المتجانسة للهيكل من حيث شكل وتوزيع الخلايا مما أدى إلى قيود منهجية؛ فإنها تجعل افتراضات حول هيكل 3-D من الفائدة والنتائج لا تشير إلى هيكل كامل. هذه القيود تقلل من حساسية ودقة الطرق وكذلك زيادة مخاطر الأخطاء 1 .
التحيز في عد الخلايا يمكن تجنبها من خلال تطبيق علم التجميع القائم على التصميم، وهو أمر ذو أهمية عامة للحصول على معلومات كمية حول عدد الخلايا في نسيج معين أو هيكل معين. في حين أن علم التجسس كان سابقا طريقة تستغرق وقتا طويلا جدا، والتقدم في الإجراءات، لينةوير والتصوير، جعلت تصبح أكثر كفاءة وعلى نطاق واسع المعمول بها. ويستتبع علم التجسيم مبادئ أخذ العينات الإحصائية والنظرية الهندسية العشوائية لتوفير أدوات فعالة لتقدير الحجم ومساحة السطح والطول وعدد الأجسام في بنية ثلاثية الأبعاد عن طريق أخذ العينات في الأقسام 2 -D 2 . وهكذا، يسمح علم التجسيم واحد للحصول على بيانات كمية غير منحازة على التغييرات الهيكلية في أقسام الأنسجة، والتي تعطي متوسط تقديرات الأرقام الحقيقية، دون تحليل شامل 1 . ويعرف علم التجسس بأنه الاستدلال الإحصائي للمعلمات الهندسية من المعلومات المأخوذة من العينات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق أخذ عينات غير منحازة، أي أخذ العينات العشوائية المنهجية، من الأقسام وكذلك قواعد العد التي تضمن أن جميع الكائنات لها احتمالات متساوية للعد 3 . في حين أن النتائج المجسمة يمكن أن يكون درجات متفاوتة من الدقة كما هو مبين من معامل الخطأ (سي)، وهذا يمكن أن يكون الإعلانمبرر لتناسب التباين البيولوجي المتأصل (معامل التباين (كف)) عن طريق ضبط كمية العينات كما هو مطلوب 4 ، 5 . وقد درس عدد قليل من الدراسات المجسمة السابقة الآثار على المدى القصير من التحفيز الكهربائي (إكس) على اللدونة الحصين في القوارض 6،7 . البيانات من هذه الدراسات تظهر زيادة أولية في العدد الإجمالي للخلايا العصبية وكذلك ارتفاع التمايز متشابك بعد إكس المتكررة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لا تقدر تكوين الخلايا العصبية مباشرة، لأنها لا تستخدم علامات محددة لانتشار الخلايا.
هنا نقدم تطبيق طريقة مجسمة، تقنية الكسور البصرية 8 ، 9 ، لقياس العدد الإجمالي للخلايا العصبية التي شكلت حديثا في الفئران الحصين طبقة الخلايا الحبيبية (غكل)، بما في ذلك منطقة شبه الحبيبية (سغز) وكذلك كما طويلة الأجل sبرف 10 ، 11 . اخضعنا الفئران لجدول زمني السريرية ذات الصلة من إكس (ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 3 أسابيع)، والتي هي واحدة من المحفزات أقوى من الخلايا العصبية 12 . تم التعامل مع الحيوانات السيطرة باستخدام نفس الإجراء، ولكن من دون تمرير الحالي. في كل من 21 يوما من التجارب، تم حقن جميع الفئران داخل البريتون مع 5 برومو-2`-ديوكسيوريدين (بردو) الذي يدمج في الحمض النووي بدلا من ثيميدين خلال انقسام الخلايا 13 . بعد التجارب، تم الحفاظ على الفئران لمدة أربع فترات زمنية مختلفة (24 ساعة، 3 أشهر، 6 أشهر و 12 شهرا). باستخدام مبدأ الكسور، حصلنا على جزء معروف من الحصين من خلال أخذ العينات العشوائية موحدة من المقاطع، وتطبيق ديساكتورس البصرية (3-D تحقيقات) لأقسام الأنسجة سميكة و إمونوستيند. ومن الملاحظ بوجه خاص أن المقاطع المجمدة عادة ما تنهار في محور z أثناء العملية، وأنه ينبغي استخدام أجهزة الكشف البصرية استنادا إلى سمك القسم المتوسط المرجح في هذه الحالة بالذات 14 . كما تم نقل الطائرة البؤرية من أجهزة الكشف البصرية مسافة معروفة أسفل من خلال القسم، وحصبت الخلايا العصبية إيجابية بردو عندما تم التعرف على سمة من سماتها بوضوح. في مجال علم التجسيم هناك بعض الجدل حول العدد الإجمالي للجسيمات التي ينبغي أن تحسب 15 ؛ وعادة ما تحسب 150-200 الخلايا العصبية في هيكل الفائدة للحصول على دقة كافية أي معامل 7-8٪ 8 . تم الانتهاء من التهم العصبية إيجابية بردو باستخدام البرمجيات المجسمة مع التصوير من قبل المجهر القياسية مجهزة الكاميرا والأهداف التالية: 2X، 4X و 10X وكذلك 100X الهدف الغمر النفط (فتحة العددية = 1.40)، ومرحلة الآلية . تم قياس الحركات في الاتجاه Z مع ميكروكاتور الرقمية. التكبير النهائيكان 3000X.
Protocol
وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية من الدنماركية تجربة التفتيش الحيوانية واعتمادها من قبل لجنة الأخلاقية المحلية للحيوانات التجريبية.
1. تجهيز الأنسجة
ملاحظة: بعد نضح ترانسكارديال وبعد التثبيت في بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) المخفف في 0.2 M الفوسفات العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، يتم نقل العقول إلى 30٪ السكروز في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لمدة ثلاثة أيام في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، يتم تجميد العقول على مسحوق الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء.
- فصل نصفي الكرة الأرضية الأيمن والأيسر على طول خط الوسط من الدماغ باستخدام مشرط ثم اختيار واحد أو نصف الكرة الآخر بشكل عشوائي في الدماغ الأول، وبعد ذلك تحول بشكل منهجي بين الكرة الأرضية اليمنى واليسرى ( الشكل 1A ). جبل نصف الكرة العينة على قرص عينة مع محور طويل عمودي على القرصباستخدام وسط تصاعد.
- وضع حاويات متعددة العدد مرقمة للتبريد المسبق في ناظم البرد.
- جبل القرص عينة في ناظم البرد وقطع مجمل الحصين (بريجما 1.80 إلى - 7.04 16 ) إلى 80 ميكرون أقسام سميكة في الطائرة الاكليلية ( الشكل 1B ).
- وضع جميع المقاطع عينات على التوالي في الحاويات مولديديش المبردة، لضمان أن يتم الاحتفاظ الأقسام في قطع النظام.
- تغطية أقسام تماما مع كريوبروتكتانت وعقد الحاويات في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
2. إمونوستينينغ
ملاحظة: لتتبع المقاطع الفردية في جميع أنحاء إجراء تلطيخ، ضع المقاطع عينات في شبكات تلطيخ 25 جيدا. استخدام كل 5 القسم ث ، إعطاء متوسط العدد النهائي من 12 (8-16) أقسام في الحصين ل إمونوستينينغ والعد الخلايا اللاحقة.
- قبل أخذ العينات الفرعية كل قسم ن ث مع بداية عشوائية بين القسم الأول وقسم ن ( الشكل 1C ) نقل الحاويات من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة (رت).
- استخدام على سبيل المثال فرشاة الطلاء، لنقل المقاطع في الترتيب العددي لشبكات تلطيخ 25 جيدا وضعت في أطباق بتري مليئة بس.
ملاحظة: من هذه النقطة، والحفاظ على المقاطع في شباك تلطيخ التي يتم وضعها في أطباق الزجاج مطابقة وضعت على شاكر المداري (القسم 2-3 إلى 2.9). - نقل شباك تلطيخ للأطباق الزجاج مطابقة وغسل المقاطع مرتين لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني في رت قبل الحضانة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2 ) المخفف في الماء المقطر (د 2 O) لمدة 20 دقيقة.
- نقل الأقسام إلى ثلاثة حلول مختلفة من حمض الهيدروكلوريك (هكل) (1 م في 0 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 2 M في رت لمدة 10 دقيقة، و 2 M عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) قبل تحييد في 0.1 M تيترابوريت الصوديوم ار رت لمدة 20 دقيقة.
- بعد 3 × 10 حضانات في 1٪ تريتون X-100 المخفف في برنامج تلفزيوني (غسل العازلة)، ونقل المقاطع إلى غسل العازلة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (حجب الحل) لمدة 1 ساعة في رت.
- احتضان المقاطع لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية في الماوس مكافحة بردو المخفف 1: 100 في حجب الحل.
- غسل المقاطع 3 × 10 دقيقة في غسل العازلة، واحتضان لمدة 48 ساعة في الفجل الحصان البيروكسيديز المخفف 1:10 في غسل العازلة.
- نقل المقاطع إلى برنامج تلفزيوني لمدة 5 × 10 دقيقة، ثم لمدة 7 دقائق في 0.01٪ ديامينوبنزيدين (داب) المخفف في برنامج تلفزيوني قبل أن يتم نقلها إلى محلول داب مماثل يحتوي على 0.02٪ H 2 O 2 لمدة 10 دقيقة في رت.
- استكمال سلسلة من يغسل (2 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني و 2 × 10 دقيقة في الفوسفات العازلة دون إضافة كلوريد الصوديوم) وجبل المقاطع في الترتيب العددي على الشرائح المجهر.
- تجفيف المقاطع لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل كونتيرستينينغ مع الكريزيلالبنفسجي.
- وضع الشرائح المجهر في رف الشريحة.
- ترطيب المقاطع لمدة 10 دقيقة في شرائح تلطيخ الأطباق التي تحتوي على د 2 O، ومن ثم نقل الشرائح إلى 0.02٪ البنفسجي الكريزيل في د 2 O لمدة 15 دقيقة.
- كرر الخطوة 2.12 قبل أن يتم تجفيف المقاطع ثلاث مرات في الإيثانول (96٪ لمدة 5 دقائق و 99٪ لمدة 2 × 2 دقيقة).
- وضع أقسام في زيلين لمدة 2 × 15 دقيقة وتغطية زلة الشرائح باستخدام وسيلة التجفيف السريع لتركيب.
- وأخيرا، وترك الشرائح تراجع انزلاق لمدة 24 ساعة تقريبا قبل أن يمكن استخدامها للمجهر.
3. تقدير إجمالي عدد الخلايا العصبية بردو المسمى باستخدام الكسور البصرية
ملاحظة: إجراء دراسة تجريبية بما في ذلك عدد قليل من الحيوانات لتحديد المعلمات أخذ العينات المثلى، مثل عدد من الأقسام التي سيتم تحليلها وعدد من أجهزة الكشف البصرية داخل أقسام العينة. ويوفر هذا البرنامج التجريبي أيضا(انظر القسم 3.9.3) للحصول على دقة مرضية للتقديرات التي يحددها المحقق (لمزيد من التفاصيل انظر أدناه). وبالمثل إجراء تحليل توزيع z لمعالجة النقاط التالية: انكماش الأنسجة، ونوعية تلطيخ في جميع أنحاء القسم وتوزيع الخلايا في المحور Z 14 .
- تحقق من سماكة الأنسجة في المقاطع للتأكد من أنها مناسبة لاستخدام المجزء البصري، على سبيل المثال سميكة بما فيه الكفاية لارتفاع المشبك المختار بما في ذلك مناطق الحراسة (انظر أدناه). ملاحظة: سمك الأنسجة هو تدابير في عدة أماكن داخل المنطقة ذات الاهتمام.
- وضع الشرائح على مرحلة الميكانيكيه من المجهر وتشغيل البرمجيات المجسمة المفضلة.
- تحديد مجال الفائدة باستخدام هدف منخفضة التكبير (2X أو 4X) قبل تغيير إلى 100X النفط-إمهدف الانحناء (انظر الشكل 2A ).
- باستخدام نقطة محددة من إطار العد (على سبيل المثال في الزاوية أو المجاورة لها)، حدد موقع الجزء العلوي من القسم عن طريق التحرك على طول المستوى البؤري حتى تظهر بعض سمات القسم في التركيز. تسجيل هذا Z- موقف كما 0 (انظر الشكل 2B ).
- نقل الطائرة البؤرية إلى أسفل من خلال الأنسجة حتى نفس نقطة محددة من إطار العد هو على مستوى z الماضي من الأنسجة في التركيز ووضع علامة على هذا الموقف. يتم تعريف سماكة الأنسجة المحلية من 0 إلى هذه النقطة النهائية ويمكن قراءتها على المحور z. تسجيل سمك الأنسجة (انظر الشكل 2B ).
- وثيقة اختراق كامل من وصمة عار وتوزيع الخلايا في سمك كامل من القسم.
ملاحظة: يتم استخدام توزيع الخلايا العصبية بردو المسمى كدليل لتحديد مناطق الحراسة المطلوبة. على الرغم من التوزيع الموحد للخلايا أمر بالغ الأهمية، فإنهمن المقبول مراقبة عدد أقل من الخلايا بالقرب من أعلى وأسفل القسم، مما يشير إلى تأثير القبعات المفقودة (لمزيد من التفاصيل انظر دورف-بيترسن وآخرون، 2009).- عينة الخلايا العصبية بردو المسمى وتسجيل موقفهم z جنبا إلى جنب مع سمك القسم المحلي يقاس في الزاوية المحددة من كل إطار العد.
- رسم عدد من الخلايا العصبية إيجابية بردو كدالة من Z- موقفهم.
- إصلاح ارتفاع مناطق المشبك والحراسة على أساس متوسط سمك القسم وتوزيع الخلايا (انظر 3.1 و 3.2).
ملاحظة: يجب أن يكون ارتفاع المشبك أقل من سمك القسم لتجنب القطع الأثرية بالقرب من الأسطح. يتم التحايل على هذا الخطر من خلال تضمين مناطق الحراسة إلى أعلى وأسفل القسم. - تحديد طول الخطوة بين أجهزة الكشف.
- تحديد المنطقة ذات الاهتمام على جميع الأقسام ليتم تحليلها وتسجيل المناطق.
- جمع هذه المناطق ثم تقسيم بy عدد من المفتشين ليتم وضعها داخل هذه المنطقة.
ملاحظة: استنادا إلى الخبرة السابقة نقطة انطلاق جيدة يستتبع 75 تحقيقات. وسيوفر ذلك تقريبا للمنطقة ومواقع أخذ العينات المناظرة ( خطوة ) (لمزيد من التفاصيل انظر غرب، 2012). - اتخاذ الجذر التربيعي للخطوة ، والتي سوف توفر حجم خطوة زي.
- تحديد حجم إطار العد.
- تعيين حجم إطار العد إلى وحدة التعسفي وإجراء عينة التجريبية من الخلايا العصبية إيجابية بردو باستخدام المعلمات التي تم الحصول عليها في القسم 3.3 و 3.4.
ملاحظة: يجب تحديد حجم تجريبيا من قبل التجربة والخطأ، ولكن من المستحسن أن يتم تعديلها لتمكين عينات من 2-3 خلايا لكل ديسكتور 8 .
- تعيين حجم إطار العد إلى وحدة التعسفي وإجراء عينة التجريبية من الخلايا العصبية إيجابية بردو باستخدام المعلمات التي تم الحصول عليها في القسم 3.3 و 3.4.
- بعد هذه الخطوة النهائية من الدراسة التجريبية تبدأ أخذ العينات الخلية.
ملاحظة: يجب أن تؤدي المعلمات أخذ العينات التي تم الحصول عليها في التهم من حوالي 150-200 خلايا طن كل حيوان وهو ما يكفي للحصول على تصميم مجسم كفاءة 8 . - عد الخلايا العصبية إيجابية بردو باستخدام 100 × هدف الغمر النفط والتكبير النهائي من 2000-3000 ×. في كل كاشف بصري، وتحديد أي الخلايا العصبية المسمى بردو التي يتم التعرف عليها بوضوح من قبل ميزة الفائدة (في هذه الدراسة، والمعيار هو عندما الحافة الرائدة للخلايا العصبية بردو المسمى يأتي في التركيز لأول مرة)، وتقع داخل إطار العد أو لمس خطوط إدراج ( الشكل 2B ). لا تحسب الخلايا العصبية الإيجابية بردو أنه، عندما تعترف بوضوح من قبل ميزة الفائدة داخل ارتفاع المشبك، لمس خطوط الاستبعاد. من الأهمية بمكان أن تتبع بدقة هذه قواعد العد في جميع أنحاء الكمي التجريبي بأكمله.
ملاحظة: كما يضم بردو في جميع الخلايا تقسيم، يتم استخدام التشكل للتمييز بين الخلايا العصبية وأنواع أخرى من الخلايا. نويخصائص رون هي نواة محددة بوضوح مع السيتوبلازم محايدة ونواة مظلمة. يتم التعرف على خلايا إيجابية بردو كما الخلايا العصبية التي شكلت حديثا على أساس حجمها أكبر نسبيا بالمقارنة مع الخلايا الدبقية. وتجدر الإشارة إلى أنه في دراسات انتشار على المدى القصير (على سبيل المثال <24 ساعة) تلطيخ مزدوج باستخدام علامات الخلايا العصبية غير ناضجة قد يكون شرطا مسبقا 17 . - تقدير العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في كل الدماغ عن طريق ضرب العدد الإجمالي للخلايا عد (Σ Q - ) مع الكسور أخذ العينات المتبادلة:
إلى عن على
أين
Q- هو متوسط سماكة القسم المتوسط، h هو ارتفاع الكاشف، أسف هو جزء أخذ العينات في المنطقة، سف هو المقطع sوجزء الطرح و t i هو سمك القسم في إطار العد الأول مع عدد الخلايا 
في المنشق 14 ، 18 . - حساب معامل الخطأ (سي) 8 وهو التباين أخذ العينات من الخلايا العصبية إيجابية بردو في منهجية عشوائية عشوائيا أخذ العينات (سورس).
- أولا، حساب الضوضاء ، وهو ما يعادل العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو عدها:
- بعد ذلك، حساب التباين في سورس:
ملاحظة: لقد حكمنا على المنطقة وتعداد الخلايا في الحصين لتغيير بسلاسة من قسم إلى قسم، وبالتالي تستخدم "الطبقة نعومة" م = 1 (1/240) 8 ، 19
أين
P i هو عدد النقاط التي يتم حسابها للكائن في القسم i و n هو عدد الأقسام 4 و 20 . - وأخيرا، حساب سي من التقدير:
ملاحظة: بشكل عام، وعادة ما يتحقق الدقة المثلى عندما تكون قيمة سي أقل من نصف السيرة الذاتية التي تمت ملاحظتها، كما أوكف 2 = إكف 2 + سي 2 ، حيث أوكف هو السيرة الذاتية و إيكف هو السيرة الذاتية الكامنة 4 .
- أولا، حساب الضوضاء ، وهو ما يعادل العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو عدها:
Q- هو متوسط سماكة القسم المتوسط، h هو ارتفاع الكاشف، أسف هو جزء أخذ العينات في المنطقة، سف هو المقطع sوجزء الطرح و t i هو سمك القسم في إطار العد الأول مع عدد الخلايا 
في المنشق 14 ، 18 . 
Fإيغور 1: رسم تخطيطي يظهر معالجة الأنسجة وفقا لمبادئ الكسور المستخدمة في هذه الدراسة.
بعد التجارب، يتم فصل نصف الكرة الأرضية ونصف الكرة الأيمن أو اليسار اختيارها بشكل منهجي وبشكل عشوائي (A). يتم قطع الدماغ الكامل الذي يمتد على الحصين بأكمله إلى أقسام الاكليلية 80 ميكرون سميكة (B)، وعند ذلك كل قسم 5TH هو عينات فرعية، بدءا عشوائيا بين القسم 1 إلى 5، ل إمونوستينينغ النهائي والكمي التجريبي (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم توضيحي يوضح إجراء أخذ العينات المجسمة باستخدام أجهزة الكشف البصرية.
(A) بعد المعالجة النسيجية hإيبوكامبال غكل / سغز كان يرسم و ديساكتورس البصرية تطبيقها بشكل موحد وعشوائي في المنطقة. (ب) في أجهزة الكشف البصرية (يسار)، تم عد الخلايا العصبية الإيجابية بردو إلا إذا تم التعرف بوضوح على سماتها من الفائدة ضمن ارتفاع المشبك، وتقع داخل إطار العد أو لمس خط إدراج (يمين). لم تحسب الخلايا العصبية التي تلمس خط الاستبعاد. مقياس الحانات = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
معايير أخذ العينات
من خلال تحليل توزيع Z في دراسة تجريبية ( الشكل 3 )، وجدنا توزيع موحد للخلايا العصبية إيجابية بردو في ارتفاع المفتش. تم قياس انكماش الأقسام. وكان متوسط سمك النهائي 26.4 ميكرون (19.0-32.0 ميكرون) في أقسام قطع أصلا في 80 ميكرون. استنادا إلى سمك الأنسجة وتوزيع بردو المسمى الخلايا العصبية تم تعيين ارتفاع المشبك إلى 10 ميكرون، والمناطق الحرس في الجزء العلوي والسفلي من القسم تم تعيين إلى 5 ميكرون و4-17 ميكرون على التوالي. اعتمادا على كثافة الخلايا، كانت مساحة إطارات العد 1414 أو 5210 ميكرون 2 . كان طول الخطوة 220 ميكرون في كل من الاتجاهين س و ص وتم إجراء عد الخلايا في معدل 12 (نطاق 8-16) أقسام لكل حيوان. أدت هذه المعلمات أخذ العينات في المتوسط من 133 (مجموعة 33-372) بردوخلايا -positive تحسب في 173 (107-204) ديساكتورس في كل نصف الكرة المخ.
على سبيل المثال، حصلنا على القيم التالية كف و سي ل بردو إيجابية تقديرات الخلايا العصبية في إكس الجرذان تعامل: 24 ساعة: كف = 0.59، سي = 0.11؛ 3 أشهر: كف = 0.34، سي = 0.12؛ 6 أشهر: كف = 0.43، سي = 0.09؛ 12 شهرا: كف = 0.22، سي = 0.09.
نحن كميا العدد الإجمالي للخلايا العصبية التي شكلت حديثا والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في الحصين الفئران التالية إكس باستخدام الكسور البصرية بالتزامن مع تقنية تلطيخ بردو 10 ، 11 . وأظهرت النتائج النهائية وجود الخلايا العصبية القاعدية في المجموعات الأربع من الحيوانات السيطرة، والتي لم تختلف اختلافا كبيرا بوصفها وظيفة من الوقت البقاء على قيد الحياة ( الشكل 3 ). وعلاوة على ذلك، تسببت إكس زيادة كبيرة في العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في 24(259٪، p <0.0001)، 3 (229٪، p <0.001)، 6 (152٪، p <0.05) و 12 شهرا (162٪، p <0.05) بعد التجريب، بالمقارنة مع حيوانات التحكم.
الشكل 3: البيانات الكمية من العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في غكل / سغز من الحصين الفئران 10 ، 11 .
وتمثل الحانات الأفقية القيم المتوسطة. الاختصارات: غكل، طبقة الخلايا الحبيبية؛ سغز، المنطقة الفرعية الحبيبية. ساعة، ساعات؛ م، أشهر. **** p <0.0001، *** p <0.001 و * p <0.05 مقابل السيطرة (ن = 11-12 لكل مجموعة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
باستخدام إكس كمنهج للحث على تكوين الخلايا العصبية، نجد زيادة فورية من 260٪ في تشكيل الخلايا العصبية إيجابية بردو جديدة في الحصين. في هذه المجموعة من الخلايا العصبية ولدت بشكل حاد وجدنا 40٪ الاستنزاف من يوم 1 إلى ثلاثة أشهر، مع ما يقرب من 50٪ من الخلايا العصبية التي شكلت حديثا على قيد الحياة بعد 12 شهرا على الأقل بعد العلاج 10 ، 11 . وتبع فرز الخلايا العصبية التي تحمل اسم بردو مخطط أخذ عينات صارم، حيث تم تقطيع الحصين بالكامل إلى أقسام سميكة بسمك 80 ميكرون، يليها أخذ عينات فرعية من كل قسم 5 مع بدء أخذ العينات عشوائيا بين القسم الأول والجزء الخامس. يتم اختيار هذه الأقسام بطريقة عشوائية منهجية، وهذا هو طريقة ممتازة للحد من التباين في النتيجة النهائية، دون عد شامل 1 . هذا مخطط أخذ العينات سمح لنا لحساب الخلايا العصبية إيجابية بردو في متوسط 12 (8-16) هيبوكامبآل أقسام في كل دماغ الفئران، مع الدقة النهائية من 9-11٪.
عند استخدام طريقة الكسور، فمن الضروري أن تعرف جزء من ارتفاع القسم الذي يتم تنفيذ العد، منذ انكماش الأنسجة وتشوه يحدث في كثير من الأحيان أثناء معالجة النسيجية 14 . في الواقع، رأينا انكماش كبير في سمك في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن انكماش الأنسجة التفاضلية قد تحدث، كما هو موضح في دورف-بيترسن وآخرون. 2001. ومع ذلك، طالما أن هيكل كامل من الفائدة متاح للتحليل، وهذه القيود لا يؤدي إلى التحيز من العدد الإجمالي للجسيمات، أي الخلايا العصبية إيجابية بردو. في الدراسات حيث انكماش الأنسجة هو قضية معينة، فإنه ينبغي دائما أن يذكر أن يتم الحصول على النتائج في الأنسجة المشوهة. في هذه الدراسة، ونحن تحسب في ارتفاع كاشف من 10 ميكرون. كان لأقسام هذه الدراسة سمك متوسط نهائي قدره 26 ميكرون، 5 ميكرونمنطقة الحراسة في الجزء العلوي و 11 ميكرون (متوسط) منطقة الحراسة في الجزء السفلي من القسم. هذه المعلمات مقبولة لأن مناطق الحراسة يجب أن تكون تقريبا قطر الجسيمات العينة.
بعد تحديد غكل / سغز، تم وضع المتفجرات عشوائيا بشكل موحد داخل المنطقة المحددة. يجب أن يتم وضع المفتشين بطول خط ثابت يحسن من أخذ العينات والعد للحصول على تقديرات فعالة بدقة يحددها المحقق. يتم تحقيق الدقة المثلى عادة من خلال عد ما يصل إلى 150-200 الخلايا في كل هيكل من الفائدة 5 . في هذه الدراسة، عدنا متوسط 133 (المدى 33-372) الخلايا العصبية إيجابية بردو في كل الحصين الفئران. وبسبب انخفاض أعداد الخلايا في بعض حيوانات السيطرة، انخفضت أعدادنا من الخلايا العصبية الإيجابية بردو تحت العدد المقبول عموما من الخلايا المطلوبة للحصول على دقة مناسبة، مما أدى إلى قيم سي عالية نسبيا لتلك الحالات. Hكما أننا حصلنا على قيم سي أقل من نصف قيم السيرة الذاتية (انظر قسم نتائج الممثل) لم تكن هناك حاجة إلى أخذ العينات والعد إضافية. وتبين القيم العالية كف أن أكبر مساهم في الاختلاف الملحوظ ينبع من الاختلاف البيولوجي. في الواقع، يمكننا أن نؤكد أن متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية بردو في هذه الدراسة كان أعلى من اللازم. على سبيل المثال، في مجموعة واحدة من الفئران حققنا قيمة سي-9٪، ولاحظت قيمة كف-43٪. في هذه الحالة بالذات، كنا يمكن أن تهدف إلى دقة حوالي 20٪. وباختصار، فإن دقة العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في هذه الدراسة كافية في أنه يلتقط آثار العلاج الحقيقي على الأرقام الحقيقية للجسيمات. وبسبب التباين البيولوجي الكبير نوعا ما في مجموعات معينة من الحيوانات، كان من الممكن الحصول على التقديرات نفسها بدقة مقبولة، على الرغم من انخفاض الجهد المبذول. لا يمكن إلا أن الفروق البيولوجية العالية داخل المجموعاتيتم تعويضهم عن طريق زيادة عدد الحيوانات.
يمكن للمرء أن يجادل بأن المعيار الذهبي للحصول على أرقام الخلايا الدقيقة يستتبع عد شامل لجميع الكائنات ذات الاهتمام. ومع ذلك، في معظم الدراسات من الدماغ هذا ليس احتمالا بسبب الأعداد الهائلة من الخلايا. على الرغم من أن أكثر كفاءة من العد الخلايا شاملة، وكسر اختياري هو مضيعة للوقت نسبيا بالمقارنة مع الفرز بسيطة من الاختلافات في أرقام الخلايا التي يفضل إذا كان عدد دقيق من الخلايا ليست ضرورية. ومن خبرتنا أن الاختلافات في أكثر من 20-30٪ يمكن الكشف عنها بحتة من خلال إجراءات الفرز.
إذا أجريت بشكل صحيح، وأخذ العينات باستخدام علم التجميع القائم على التصميم يوفر تقديرات غير منحازة ودقيقة بطريقة فعالة 1 . الملكية غير منحازة من علم التنجيم تنتج التقديرات التي، عند تكرارها، تقريب المتوسط السكاني الحقيقي، وتعزيز استنساختقدير 21 . في البداية، يجب الحصول على عينة تمثيلية من هيكل كامل من الفائدة (في هذه الدراسة الحصين غكل / سغز)، مما يسمح للتقدير في مجموعة فرعية صحيحة إحصائيا من الأقسام 4 . للحصول على عدد مناسب من الأقسام وتحقيقات العد نطبق سورس، مما يقلل من التباين مقارنة مع العينات العشوائية 8 . وعلاوة على ذلك، يضمن سورس أن الجسيمات ذات الاهتمام داخل الهيكل يتم أخذ العينات مع نفس الاحتمالات، بغض النظر عن حجمها وشكلها وتوجهها وتوزيعها في الهيكل. وینبغي أن یوصى بھذا التجسید بشدة عندما یكون الحصول على تقدیرات دقیقة وغیر منحازة جانبا محوريا من جوانب المشروع.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر سوزان سورنسن على المساعدة التقنية الماهرة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة فيلوكس؛ مؤسسة جاشا. مؤسسة آيس وإجنار دانيلسنس؛ مؤسسة هارتمان براذرز؛ مدير جاكوب مادسن وزوجة أولغا مادسنز مؤسسة؛ الطبيب سوفوس كارل اميل فريس وزوجة دوريس فريس 'الثقة؛ مؤسسة 1870؛ توربين ومؤسسة أليس فريمودتس ومؤسسة البحوث العصبية. تم إجراء تحرير المخطوطة بواسطة إنجلوود بيوميديكال إديتينغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
