Summary
Her presenterer vi en stereologisk metode, den optiske fraksjonatoren, som brukes til å kvantifisere dannelsen av nye nevroner, og deres overlevelse i rottehippocampus etter elektrokonvulsiv stimulering. Når korrekt implementert, sikrer følsomheten og effektiviteten til stereologiske metoder nøyaktige estimater med en fast og forhåndsbestemt presisjon.
Abstract
Stereologiske metoder er utformet for å beskrive kvantitative parametere uten å anta forutsetninger om størrelse, form, orientering og distribusjon av celler eller strukturer. Disse metodene har vært revolusjonerende for kvantitativ analyse av pattedyrhjernen, hvor volumetriske cellepopulasjoner er for høye til å telle manuelt, og stereologi er nå den valgte teknikken når estimater av tredimensjonale mengder må utvinnes fra målinger på todimensjonale seksjoner. Alle stereologiske metoder er i prinsippet objektive; De stoler imidlertid på riktig kunnskap om strukturen av interesse og egenskapene til vevet. Stereologi er basert på systematisk ensartet tilfeldig sampling (SURS), med justering av prøvetaking til det mest effektive nivået med hensyn til presisjon, og gir pålitelig, kvantitativ informasjon om hele strukturen av interesse. Her presenterer vi den optiske fraksjonatoren i forbindelse med BrdU immunhistokjemi tO Estimere produksjon og overlevelse av nyformede nevroner i granulasjonscellelaget (inkludert den undergranulære sonen) av rottehippocampusen etter elektrokonvulsiv stimulering, som er blant de mest potente stimulatorene til neurogenese. Den optiske fraksjoneringsteknikken er utformet for å gi estimater av totalt antall celler fra tykke seksjoner samplet fra den fulle strukturen. Tykke seksjoner gir mulighet til å observere celler i sin fulle 3-D-grad og dermed tillate enkel og robust celleklassifisering basert på morfologiske kriterier. Når korrekt implementert, gir sensitiviteten og effektiviteten til den optiske fraksjonatoren nøyaktige estimater med en fast og forhåndsbestemt presisjon.
Introduction
Kvantifisering av celler i en tredimensjonal (3-D) struktur kan kreve å oppnå estimater basert på objektive prinsipper. Selv i dag bruker studier ofte todimensjonale (2-D) metoder for å rapportere data om 3-D-strukturer. Imidlertid vurderer disse metodene ikke den heterogene karakteren av strukturen når det gjelder form og distribusjon av celler som resulterer i metodiske begrensninger; De gjør antagelser om 3-D-strukturen av interesse, og resultatene refererer ikke til den komplette strukturen. Disse begrensningene reduserer følsomheten og nøyaktigheten av metodene, samt øker risikoen for feil 1 .
Bias i celle telling kan unngås ved anvendelse av design-basert stereologi, som er av generell betydning for å skaffe kvantitativ informasjon om antall celler i et gitt vev eller struktur. Mens stereologi tidligere har vært en svært tidkrevende metode, fremskritt i prosedyrer, mykWare og bildebehandling, har gjort det blitt mye mer effektivt og vidt anvendelig. Stereologi innebærer statistiske samplingsprinsipper og stokastisk geometrisk teori for å gi effektive verktøy for estimering av volum, overflateareal, lengde og antall objekter i en 3-D struktur ved prøvetaking i 2-D seksjoner 2 . Dermed gir stereologi en til å oppnå upartiske kvantitative data om strukturelle endringer i vevseksjoner, noe som gir gjennomsnittlige estimater av de sanne tallene, uten uttømmende analyse 1 . Stereologi er definert som den statistiske inngangen til geometriske parametere fra samplet informasjon. Dette kan oppnås ved upartisk prøvetaking, det vil si systematisk tilfeldig prøvetaking, av seksjoner samt telleregler som sikrer at alle objekter har like muligheter for å bli talt 3 . Mens stereologiske resultater kan ha varierende grad av presisjon som angitt av feilkoeffisienten (CE), kan dette være annonseJustert for å passe til den iboende biologiske variansen (varianskoeffisienten) ved å justere mengden av prøvetaking som nødvendig 4 , 5 . Noen tidligere stereologiske studier har undersøkt kortsiktige effekter av elektrokonvulsiv stimulering (ECS) på hippocampal plasticitet hos gnagere 6,7 . Data fra disse studiene viser en innledende økning i totalt antall nevroner samt forhøyet synaptisk differensiering etter gjentatt ECS. Imidlertid estimerer disse studiene ikke nøyeogenese direkte, da de ikke bruker spesifikke markører for celleproliferasjon.
Her presenterer vi en anvendelse av en stereologisk metode, den optiske fraksjoneringsteknikken 8 , 9 , for å kvantifisere det totale antall nybildede nevroner i rottehippocampal granulatcellelaget (GCL), inkludert også den undergranulære sonen (SGZ) Som deres langsiktige sUrvival 10 , 11 . Vi underkastet rotter til en klinisk relevant tidsplan for ECS (tre ganger i uken i 3 uker), som er en av de mest potente stimulatorene til nevrogenese 12 . Kontrolldyr ble behandlet under anvendelse av samme fremgangsmåte, men uten å føre strøm. På hver av de 21 døgnene av eksperimentet ble alle rotter injisert intraperitonealt med 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) som inkorporerer i DNA i stedet for tymidin under celledeling 13 . Etter eksperimentering ble rotter opprettholdt i fire forskjellige tidsperioder (24 timer, 3 måneder, 6 måneder og 12 måneder). Ved bruk av fraksjonsprinsippet oppnådde vi en kjent fraksjon av hippocampuset gjennom ensartet tilfeldig prøvetaking av seksjoner og påførte optiske disektorer (3-D-prober) til de samplede og immunfargede tykke vevseksjonene. Det er spesielt bemerket at frosne seksjoner vanligvis faller sammen i z-aksen under prosessenOg at optiske disektorer basert på den antallvektede midlere seksjonstykkelse skal benyttes i dette spesielle tilfellet 14 . Som fokalplanet til de optiske disektorer ble flyttet en kjent avstand ned gjennom seksjonen, ble BrdU-positive nevroner telt da deres egenskaper av interesse var tydelig anerkjent. I stereologien er det noen debatt om det totale antall partikler som skal regnes 15 ; Typisk 150-200 nevroner regnes i strukturen av interesse for å oppnå tilstrekkelig presisjon, dvs. en koeffisient på 7-8% 8 . BrdU-positive neurontalene ble fullført ved hjelp av stereologisk programvare med avbildning ved hjelp av et standardmikroskop utstyrt med kamera og følgende mål: 2X, 4X og 10X samt et 100X oljedempingsmål (numerisk blenderåpning = 1,40) og en motorisert scene . Bevegelser i z-retningen ble målt med en digital mikrocator. Den endelige forstørrelsenVar 3000X.
Protocol
Alle dyreprosedyrene ble utført i samsvar med retningslinjer fra Dyreforsøksinspektoratet og godkjent av den lokale etiske komiteen for eksperimentelle dyr.
1. Vev behandling
MERK: Etter transcardiell perfusjon og postfiksering i 4% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i 0,2 M fosfatbuffer over natten ved 4 ° C overføres hjerner til 30% sukrose i fosfatbuffert saltvann (PBS) i tre dager ved 4 ° C. Deretter fryses hjernene på pulverisert tøris og lagres ved -80 ° C til snitting.
- Separat høyre og venstre halvkule langs hjernens midtre med en skalpell og velg deretter den ene eller den andre halvkule tilfeldig i den første hjernen, deretter skift systematisk mellom høyre og venstre halvkule ( Figur 1A ). Monter den samplede halvkule på en prøveplate med lengdeaksen vinkelrett på platenBruker et monteringsmedium.
- Plasser nummererte flerkartede beholdere for forkjøling i kryostat.
- Monter prøveplaten i kryostat og kapp hele hippocampusen (Bregma 1,80 til - 7,0416) i 80 μm tykke seksjoner i koronalplanet ( Figur 1B ).
- Plasser alle samplede seksjoner i hverandre i de avkjølte flerside beholderne, for å sikre at delene holdes i skjærefølge.
- Dekk seksjonene helt med kryoskyddsmiddel og hold beholderne ved -20 ° C til videre bruk.
2. Immunostaining
MERK: For å holde oversikt over de enkelte seksjonene gjennom fargingsprosedyren, plasser de samplede delene i 25-brønn fargegarn. Bruk hver 5. del, og gi et gjennomsnittlig slutt antall 12 (8-16) seksjoner per hippocampus for immunfarging og etterfølgende celletelling.
- Før subsampling hver ns seksjon med en tilfeldig start mellom seksjon 1 og seksjon n ( figur 1C ) overfører beholderne fra -20 ° C til romtemperatur (RT).
- Bruk f.eks. En pensel, for å overføre delene i numerisk rekkefølge til 25-brønnfargingsnettene plassert i petriskål fylt med PBS.
MERK: Fra dette punktet må du holde seksjonene i fargegarnene som er plassert i matchende glassrør plassert på en orbital shaker (kapittel 2.3 til 2.9). - Overfør fargegarnene til de tilsvarende glassrørene og vask seksjonene to ganger i 10 minutter i PBS ved RT før inkubering i 3% hydrogenperoksid (H 2 O 2 ) fortynnet i destillert vann (dH 2 O) i 20 min.
- Overfør seksjonene til tre forskjellige oppløsninger av saltsyre (HCl) (1 M ved 0 ° C i 10 minutter, 2 M ved RT i 10 minutter og 2 M ved 37 ° C i 20 minutter) før nøytralisering i 0,1 M natriumtetraborat enT RT i 20 min.
- Etter 3 x 10 min inkubasjoner i 1% Triton X-100 fortynnet i PBS (vaskebuffer), overfør seksjonene til vaskebuffer som inneholder 10% føtalt bovint serum (blokkering) i 1 time ved RT.
- Inkubér seksjonene i 48 timer ved 4 ° C i mus-anti-BrdU fortynnet 1: 100 i blokkeringsoppløsning.
- Vask seksjonene 3 × 10 min i vaskebuffer og inkuber i 48 timer i hestegrytperoksidase fortynnet 1:10 i vaskebuffer.
- Overfør seksjonene til PBS i 5 x 10 minutter, og deretter i 7 minutter i 0,01% diaminobenzidin (DAB) fortynnet i PBS før de overføres til en lignende DAB-løsning som inneholder 0,02% H20 i 10 minutter ved RT.
- Fullfør en rekke vasker (2 x 10 min i PBS og 2 x 10 min i fosfatbuffer uten tilsatt natriumklorid) og monter delene i numerisk rekkefølge på mikroskopdyser.
- Tørk seksjonene i ca. 30 minutter før motstrykning med cresylfiolett.
- Plasser mikroskopets lysbilder i et lysstativ.
- Rehydrere seksjonene i 10 minutter i lysrørfargingskåler som inneholder dH20 og deretter overfør glidene til 0,02% cresylviolett i dH20 i 15 min.
- Gjenta trinn 2.12 før seksjonene dehydreres tre ganger i etanol (96% i 5 minutter og 99% i 2 × 2 min).
- Plasser seksjonene i xylen i 2 x 15 min og dekk glidene med et hurtigtørkemiddel for montering.
- Til slutt, la dekselet glide i omtrent 24 timer før de kan brukes til mikroskopi.
3. Estimering av totalt antall BrdU-merkede nevroner ved bruk av den optiske fraksjonatoren
MERK: Utfør en pilotundersøkelse, inkludert noen få dyr, for å bestemme de optimale prøvetakingsparametrene, for eksempel antall seksjoner som skal analyseres og antall optiske disektorer innenfor de utvalgte delene. Denne pilot gir også enForeløpig CV (standardavvik / middel) og muligheten til å justere CE (se avsnitt 3.9.3) for å oppnå en tilfredsstillende presisjon av estimatene bestemt av etterforskeren (for nærmere detaljer se nedenfor). På samme måte utføre en z-fordelingsanalyse for å adressere følgende punkter: krymping av vevet, fargekvaliteten i hele seksjonen og distribusjon av cellene i z-aksen 14 .
- Kontroller tykkelsen på vevet i seksjonene for å bekrefte at de passer for bruk av den optiske fraksjonatoren, f.eks. Er tykk nok til den valgte disistorhøyden, inkludert vaktsoner (se nedenfor). MERK: Vevtykkelsen er mål på flere steder i regionen av interesse.
- Plasser lysbildene på det motoriserte trinnet i mikroskopet og slå på den foretrukne stereologiske programvaren.
- Avgrens området med interesse ved hjelp av et lav forstørrelsesmål (2X eller 4X) før du bytter til en 100X olje-immErstatningsmål (se figur 2A ).
- Bruk et bestemt punkt i en telleramme ( f.eks. Ved eller ved siden av et hjørne), og finn toppen av seksjonen ved å bevege seg langs fokalplanet til noen av funksjonene i seksjonen vises i fokus. Registrer denne z-stillingen som 0 (se figur 2B ).
- Flytt fokalplanet ned gjennom vevet til det samme bestemte punktet i tellerammen er på det siste z-nivået av vev i fokus og merk denne posisjonen. Den lokale vevstykkelsen er definert fra 0 til dette endepunktet og kan leses på z-aksen. Registrer vevtykkelsen (se figur 2B ).
- Dokument full penetrasjon av flekken og distribusjon av cellene i hele tykkelsen av seksjonen.
MERK: Fordelingen av BrdU-merkede nevroner brukes som en veiledning for å bestemme de nødvendige beskyttelsessonene. Selv om en jevn fordeling av celler er kritisk, er detDet er akseptabelt å observere færre celler nær toppen og bunnen av seksjonen, noe som indikerer effekten av tapt kapsler (for ytterligere detaljer se Dorph-Petersen et al., 2009).- Prøve BrdU-merkede nevroner og registrer deres z-posisjon sammen med den lokale seksjonstykkelsen målt i det valgte hjørnet av hver telleramme.
- Plot antall BrdU-positive nevroner som en funksjon av deres z-posisjon.
- Fest høyden på disektor og beskyttelsessoner basert på gjennomsnittlig seksjonstykkelse og distribusjon av celler (se 3.1 og 3.2).
MERK: Disksens høyde skal være mindre enn snittykkelsen for å unngå gjenstander nær overflatene. Denne risikoen er omgått ved å inkludere vaktsoner til toppen og bunnen av delen. - Bestem trinnlengden mellom disktorene.
- Avgrens regionen av interesse på alle delene som skal analyseres og registrer områdene.
- Sum disse områdene og del deretter bY antall disektorer som skal plasseres innenfor dette området.
MERK: Basert på tidligere erfaring medfører et godt utgangspunkt 75 sondene. Dette vil gi en tilnærming av området og de tilsvarende samplingsposisjonene (Et trinn ) (for ytterligere detaljer se Vest, 2012). - Ta kvadratroten til et trinn , som vil gi xy-trinns størrelse.
- Bestem størrelsen på tellerammen.
- Still størrelsen på tellerammen til en vilkårlig enhet og utfør en pilotprøve av BrdU-positive nevroner ved hjelp av parametrene som er oppnådd i avsnitt 3.3 og 3.4.
MERK: Størrelsen må bestemmes empirisk av prøve og feil, men det anbefales at det justeres for å aktivere sampling av 2-3 celler per disektor 8 .
- Still størrelsen på tellerammen til en vilkårlig enhet og utfør en pilotprøve av BrdU-positive nevroner ved hjelp av parametrene som er oppnådd i avsnitt 3.3 og 3.4.
- Etter dette siste trinnet i pilotstudien begynner celleprøvetaking.
MERK: De oppnådde prøvetakingsparametrene skal resultere i teller på ca. 150-200 celler iN hvert dyr som er tilstrekkelig til å oppnå en effektiv stereologisk utforming 8 . - Telle BrdU-positive nervene ved hjelp av et 100 × olje-nedsenkningsmål og en endelig forstørrelse på 2000-3000 ×. I hver optisk disektor identifiserer du eventuelle BrdU-merkede nevroner som klart gjenkjennes av funksjonen av interesse (i den foreliggende studien er kriteriet når forkanten av BrdU-merket nevron kommer i fokus for første gang) Inne i tellerrammen eller berør inkluderingslinjene ( figur 2B ). Teller ikke de BrdU-positive nevronene som, når de er klart gjenkjent av funksjonen av interesse inne i disektorhøyden, berører ekskluderingslinjene. Det er kritisk viktig å følge nøye disse tellereglene gjennom hele stereologisk kvantifisering.
MERK: Som BrdU inkorporerer i alle delende celler, brukes morfologi til å skille mellom neuroner og andre typer celler. NeuRon egenskaper er en klart definert kjernen med en nøytral cytoplasma og en mørk nukleolus. BrdU-positive celler anerkjennes som nydannede nevroner basert på deres relativt større størrelse sammenlignet med glialceller. Det bør nevnes at i studier av kortsiktig proliferasjon (f.eks. <24 timer) kan dobbeltfarging ved hjelp av umodne nevronmarkører være en forutsetning 17 . - Estimér det totale antallet BrdU-positive nevroner i hver hjerne ved å multiplisere totalt antall celler tellet (Σ Q - ) med gjensidige samplingsfraksjoner:
til
hvor
Q- er den tallveide midlere tykkelsen, h er disksjonshøyde, asf er samplingsfraksjonen, ssf er seksjonen sAmple fraksjon og t i er tykkelsen i den telle rammen med en celle telling av 
I disectoren 14 , 18 . - Beregn feilkoeffisienten (CE) 8, som er prøvetakningsvariasjonen for BrdU-positive nevroner i systematisk ensartet tilfeldig prøvetaking (SURS).
- Først beregner du støyen , som er lik det totale antallet BrdU-positive nevroner som regnes:
- Deretter beregner variansen i SURS:
MERK: Vi har dømt området og celleverdiene i hippocampus for å bytte jevnt fra seksjon til seksjon og benyttet følgelig "glatthetsklasse" m = 1 (1/240) 8 , 19
hvor
P jeg er antall poeng som er talt for objektet i den i - seksjonen, og n er antall seksjoner 4 , 20 . - Til slutt beregner du CE av estimatet:
MERK: Generelt oppnås optimal presisjon når CE-verdien er mindre enn halvparten av den observerte CVen som OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , hvor OCV er den observerte CV og ICV er den inneboende CV 4 .
- Først beregner du støyen , som er lik det totale antallet BrdU-positive nevroner som regnes:
Q- er den tallveide midlere tykkelsen, h er disksjonshøyde, asf er samplingsfraksjonen, ssf er seksjonen sAmple fraksjon og t i er tykkelsen i den telle rammen med en celle telling av 
I disectoren 14 , 18 . 
FIgur 1: Skjematisk illustrasjon som viser vevsbehandling i henhold til fraksjoneringsprinsippene som brukes i foreliggende studie.
Etter eksperimentering separeres hemisfærene og høyre eller venstre halvkule valgt systematisk og tilfeldig (A). Den komplette hjernen som strekker seg over hele hippocampus er kuttet i 80 μm tykke koronale seksjoner (B), hvoretter hver 5. del er subsamplet, starter tilfeldig mellom avsnitt 1 til 5, for endelig immunfarging og stereologisk kvantifisering (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Illustrasjon som viser den stereologiske prøvetakingsprosedyren ved hjelp av optiske disektorer.
(A) Etter histologisk behandling av hIppocampal GCL / SGZ var avgrensede og optiske disektorer anvendt jevnt og tilfeldig over regionen. (B) I de optiske disektorer (til venstre) ble de BrdU-positive nevronene regnet bare hvis deres egenskaper av interesse var klart gjenkjent innenfor disektorhøyden, og plassert inne i tellerammen eller berøre inkluderingslinjen (høyre). Neuroner som berører ekskluderingslinjen ble ikke talt. Skalestenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Sampling parametere
Ved å analysere z-fordelingen i en pilotstudie ( Figur 3 ) fant vi en jevn fordeling av BrdU-positive neuroner i disektorhøyde. Krymping av seksjonene ble målt; Endelig middeltykkelse var 26,4 μm (19,0-32,0 μm) i seksjoner som opprinnelig ble kuttet til 80 μm. Basert på vevtykkelsen og fordelingen av BrdU-merkede nevroner ble diskehøyden satt til 10 μm, og vaktsonene på toppen og bunnen av delen ble satt til henholdsvis 5 μm og 4-17 μm. Avhengig av cellens tetthet var området av tellerammene 1414 eller 5210 μm 2 . Trinnlengden var 220 μm i både x- og y-retningene og celletelling ble utført i et gjennomsnitt på 12 (område 8-16) seksjoner per dyr. Disse prøvetakingsparametrene ga et gjennomsnitt på 133 (rekkevidde 33-372) BrdU-positive celler telt i 173 (107-204) disektorer i hver hjernehalvdel.
Som et eksempel oppnådde vi følgende CV- og CE-verdier for BrdU-positive neuronestimuleringer i ECS-behandlede rotter: 24 timer: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 måneder: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 måneder: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 måneder: CV = 0,22, CE = 0,09.
Vi kvantifiserte det totale antall nybildede nevroner og deres langsiktige overlevelse i rottehippocampus etter ECS ved bruk av den optiske fraksjonatoren i forbindelse med en BrdU-fargingsteknikk 10 , 11 . De endelige resultatene viste en basal neurogenese i de fire gruppene av kontrolldyr, som ikke var vesentlig forskjellig som en funksjon av overlevelsestid ( figur 3 ). Videre induserte ECS en betydelig økning i totalt antall BrdU-positive nevroner ved 24Timer (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001), 6 (152%, p <0,05) og 12 måneder (162%, p <0,05) etter eksperimentasjon, sammenlignet med kontrollerte dyr.
Figur 3: Kvantitative data av totalt antall BrdU-positive nevroner i GCL / SGZ i rottehippocampus 10 , 11 .
Horisontale stenger representerer middelverdiene. Forkortelser: GCL, granulatcellelag; SGZ, sub-granulær sone; H, timer; M, måneder. **** p <0,0001, *** p <0,001 og * p <0,05 versus kontroll (n = 11-12 per gruppe). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Ved å bruke ECS som metode for å indusere neurogenese finner vi en umiddelbar økning på 260% i dannelsen av nye BrdU-positive nevroner i hippocampus. I dette bassenget av akutte genererte nevroner fant vi 40% avgang fra dag 1 til 3 måneder, med nesten 50% av de nylig dannede nevronene overlevde minst 12 måneder etter behandling 10 , 11 . Tellingen av BrdU-merkede nevroner fulgte et strengt utvalgsskjema, hvorved hele hippocampus ble kuttet i 80 μm tykke seksjoner etterfulgt av undersampling av hver 5. del med en tilfeldig prøveuttak mellom del ett og seksjon fem. Å gi disse delene er valgt på en systematisk tilfeldig måte, dette er påviselig en utmerket metode for å redusere variansen til sluttresultatet, uten uttømmende telling 1 . Dette prøvetakingssystemet tillot oss å telle BrdU-positive nevroner i et gjennomsnitt på 12 (8-16) hippocampAl seksjoner i hver rottehjerne, med en endelig presisjon på 9-11%.
Ved bruk av fraksjoneringsmetoden er det viktig å kjenne fraksjonen av seksjonshøyden der teller utføres, siden vevskrymping og deformasjon ofte oppstår under histologisk behandling 14 . Faktisk så vi tydelig nedgang i tykkelsen i denne studien. Videre bør det bemerkes at differensial vevskrymping kan forekomme, som presentert i Dorph-Petersen et al. 2001. Så lenge den totale interessestrukturen er tilgjengelig for analyse, resulterer disse begrensningene ikke i en bias av det totale antall partikler, det vil si BrdU-positive nevroner. I studier hvor vevskrymping er et bestemt problem, bør det alltid oppgis at resultatene oppnås i deformert vev. I denne studien telt vi i en disektorhøyde på 10 μm. Seksjonene i den foreliggende studien hadde en endelig middeltykkelse på 26 μm, en 5 μmVaktsone øverst og en 11-μm (middel) vaktsone nederst på seksjonen. Disse parametrene er akseptable siden vaktsonene skal være omtrent diameteren av de samplede partiklene.
Etter avgrensning av GCL / SGZ ble disktorer jevnt plassert i det avgrensede området. Disektorene skal plasseres med en fast trinnlengde som optimaliserer prøvetaking og telling for effektivt å oppnå estimater med en presisjon bestemt av etterforskeren. Optimal presisjon oppnås typisk ved å telle opptil 150-200 celler i hver interessestruktur 5 . I den foreliggende studien telt vi et gjennomsnitt på 133 (rekkevidde 33-372) BrdU-positive nevroner i hver rottehippocampus. På grunn av lave celle tall i noen av kontrolldyrene, falt våre teller av BrdU-positive nevroner under det generelt akseptable antall celler som var nødvendig for å oppnå en passende presisjon, noe som resulterte i relativt høye CE-verdier for disse tilfellene. HOwever, da vi oppnådde CE-verdier på mindre enn halvparten av CV-verdiene (se representativ resultateksjon) var det ikke nødvendig med ytterligere prøvetaking og telling. Høye CV-verdier viser at den største bidragsyteren til den observerte variasjonen stammer fra den biologiske variasjonen. Faktisk kan vi hevde at gjennomsnittlig antall BrdU-positive nevroner som ble talt i den foreliggende studien, var høyere enn nødvendig. For eksempel oppnådde vi i en gruppe rotter en CE-verdi på 9%, og observert en CV-verdi på 43%. I dette tilfellet kunne vi ha sikret en presisjon på ca 20%. Oppsummert er presisjonen til det totale antall BrdU-positive nevroner i den foreliggende studien tilstrekkelig ved at den fanger opp virkelige behandlingseffekter på det sanne antall partikler. På grunn av den ganske store biologiske variasjonen i bestemte grupper av dyr kunne de samme estimatene ha blitt oppnådd med en akseptabel presisjon, til tross for mindre utgifter til innsats. Høye biologiske avvik i grupper kan bareKompenseres ved å øke antall dyr.
Man kan hevde at gullstandarden for å oppnå nøyaktige celle tall innebærer uttømmende telling av alle gjenstandene av interesse. Men i de fleste hjernestudier er dette ikke en mulighet på grunn av det store antallet celler. Selv om det er mye mer effektivt enn uttømmende celletelling, er valgfri fraksjonator relativt tidkrevende i forhold til enkel screening av forskjeller i celle tall som er foretrukket dersom det nøyaktige antall celler ikke er essensielt. Det er vår erfaring at forskjeller på mer enn 20-30% kan oppdages rent ved screening prosedyrer.
Hvis det utføres riktig, gir prøvetaking ved hjelp av designbasert stereologi enkle og presise estimater på en effektiv måte 1 . Den objektive egenskapen til stereologi produserer estimater for at når den replikeres, omtrentlig sanne populasjonsmiddel, og øke reproduserbarheten avAnslå 21 . I utgangspunktet må det oppnås et representativt utvalg av hele interessekonstruksjonen (i denne studien, Hippocampal GCL / SGZ), slik at det kan estimeres i et statistisk gyldig delsett av seksjoner 4 . For å få et passende antall seksjoner og tellerprober bruker vi SURS, noe som reduserer variansen i forhold til tilfeldig prøvetaking 8 . Videre sikrer SURS at partiklene av interesse i strukturen samples med de samme sannsynlighetene, uavhengig av størrelse, form, orientering og fordeling i strukturen. Som sådan er stereologien sterkt anbefalt når man oppnår presise og objektive estimater, et sentralt aspekt av prosjektet.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Susanne Sørensen for den dyktige tekniske assistansen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra The Velux Foundation; The Jascha Foundation; Aase og Ejnar Danielsens Stiftelse; Hartmann Brothers Foundation; Direktør Jacob Madsen og kone Olga Madsens Foundation; Doktor Sofus Carl Emil Friis og kone Doris Friis 'Trust; Stiftelsen 1870; Torben og Alice Frimodts Foundation og Stiftelsen for Neurologisk Forskning. Manuskriptredigering ble utført av Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
