ड्रोसोफिला कल्पना का डिस्क एपिथेलिया में मोजाइक क्लोन विश्लेषण ट्यूमोरिजेन्सिज़ के आनुवंशिक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। यहाँ हम GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करते हुए ड्रोसोफिला विंग काल्पनिक डिस्क में ट्यूमर को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और ट्यूमर फेनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति का परिचय देते हैं।
कैंसर के प्रारंभिक दौर में, उत्परिवर्ती कोशिकाओं को बदलकर, कोशिका संबंधी असामान्यताएं दिखाई देती हैं, अनियंत्रित अतिवृद्धि शुरू होती है, और ऊतक संगठन को उत्तरोत्तर बाधित होती है। ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर ट्यूमोरिजिनेसिस के आनुवांशिक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए कैंसर जीव विज्ञान में एक लोकप्रिय प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला कल्पना के लिए आनुवांशिक उपकरण (लार्वा में एपिथेलिया का विकास) एक सामान्य उपकला टिशू के भीतर बदलकर समर्थक ट्यूमर कोशिकाओं के निर्माण को सक्षम करता है, जो मानव कैंसर के प्रारंभिक चरण के समान है। ड्रोसोफिला विंग काल्पनिक डिस्क में ट्यूमोरिजिनेसिस के एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि ट्यूमर की शुरुआत ऊतक-आंतरिक cytoarchitecture और स्थानीय सूक्ष्म ऊर्जा पर निर्भर करती है, यह सुझाव देती है कि ट्यूमरिजेनिक उत्तेजनाओं को ट्यूमरिजेनिक उत्तेजनाओं को कल्पना के लिए ट्यूमर phenotypes में मूल्यांकन करने पर विचार करना महत्वपूर्ण है। डिस्क। ट्यूमर प्रगति के फेनोटाइपिक विश्लेषण की सुविधा के लिएकल्पनाशील डिस्क पर, यहां हम विस्फोट काल्पनिक डिस्क में नवपालक ट्यूमर को प्रेरित करने के लिए GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करते हुए आनुवंशिक प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम आगे कल्पनात्मक एपिथेलिया में प्रेरित क्लोनल घावों के फेनोटाईप्स को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति का परिचय देते हैं, क्योंकि ट्यूमर की प्रगति के विभिन्न चरणों (जैसे हाइपरप्लासिया, डिस्प्लेशिया, या नियोप्लासिया) को भेदभाव करने के लिए एक स्पष्ट वर्गीकरण विधि के रूप में पहले वर्णित नहीं किया गया था। ड्रॉसोफिला में विभिन्न अंगों में ट्यूमर फेनोटाइप के क्लोनल विश्लेषण के लिए ये विधियां मोटे तौर पर लागू हो सकती हैं।
उपकला ऊतक अत्यधिक संगठित सिस्टम हैं जिनके विकास और सेल टर्नओवर के माध्यम से अपने संगठन को बनाए रखने की उल्लेखनीय होमोस्टेटिक क्षमता है। हालांकि, यह मजबूत स्व-आयोजन प्रणाली, ट्यूमर के विकास के दौरान उत्तरोत्तर बाधित है। ट्यूमर के विकास की शुरुआत में, ऑन्कोजीन सक्रियण या ट्यूमर-दमनकारी जीन निष्क्रियता से उत्पन्न होने वाली व्यक्तिगत उत्परिवर्ती कोशिकाएं एक उपकला परत के भीतर उभरती हैं। जब यह रूपांतरित "प्रो-ट्यूमर सेल" एक दमनकारी वातावरण से बचा जाता है, उपकला संगठन को बाधित करता है, और अनियंत्रित प्रसार शुरू होता है, ट्यूमोरिजिनेसिस 1 होता है पिछले कुछ दशकों के दौरान आनुवंशिकी और आणविक जीव विज्ञान में बकाया तकनीकी प्रगति ने कैंसर अनुसंधान पर उल्लेखनीय प्रगति की है। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर में आनुवंशिक रूप से मोज़ेक विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करते हुए हाल ही के अध्ययन, जैसे कि FLP-FRT (फ्लिप्पस रिंकंबेस / फ्लिपबेस रीकंबीनस लक्ष्य) mitotic recombinआयन 2 और फ्लिप-आउट- जीएएल 4-यूएएस (अपस्ट्रीम सक्रिय अनुक्रम) सिस्टम 3 , ट्यूमर 4 , 5 , 6 के गठन और मेटास्टेसिस में शामिल आनुवांशिक तंत्र को बेहतर समझने में काफी योगदान दिया है।
संरक्षित ड्रोसोफिला ट्यूमर शमन करने वाले जीन का एक समूह, घातक विशाल लार्वा (LGL), डिस्क बड़े (dlg), और घसीटना (scrib) के अध्ययन, उपकला संगठन और ट्यूमर के विकास के नुकसान के बीच महत्वपूर्ण संबंध पर प्रकाश डाला, के रूप में इन जीनों महत्वपूर्ण भूमिका निभाते एपिकल-बेसल सेल पोलारिटी के विनियमन और उपकला ऊतकों 7 में सेल प्रसार जबकि ड्रोसोफिला कल्पना डिस्क्स आमतौर पर मोनोलेयर एपिथेलिया हैं, इनमें से किसी भी तीन जीन में होमोजियग्ज म्यूटेशन कोशिकाएं संरचना और ध्रुवीकरण खोने का कारण बनती हैंकिराए पर करना, अतिरंजित और अंततः बहुपरमेय अनाकार वाले लोगों का निर्माण होता है जो आसन्न ऊतकों के साथ फ्यूज 7 इसी प्रकार, स्तनधारियों में इन जीनों का विघटन, घातक ट्यूमर 8 , 9 के विकास में शामिल है। उत्परिवर्ती ऊतकों द्वारा प्रदर्शित नवप्रोपिक phenotypes ने इन तीन जीनों के वर्गीकरण को संरक्षित, नवप्रोपिक ट्यूमर-सप्रेस दांत (एनटीएसजी) 7 , 8 के रूप में वर्गीकृत किया है। हालांकि, जब होमोजीजीस एनटीएसजी उत्परिवर्ती कोशिकाओं को जंगली-प्रकार की कल्पना डिप्लोक्स के विकास में उत्पन्न किया जाता है, तो FLP-FRT-mediated mitotic recombination का उपयोग कर, उत्परिवर्ती कोशिकाओं को ऊतक से सी-जून एन-टर्मिनल किनेज (जेएनके) -निर्धारित एपोपोसिस 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , एक्सट्रूज़न 15 </suP> , 16 , या पड़ोसियों द्वारा घुसपैठ और phagocytosis 17 आनुवंशिक रूप से मोज़ेक एपिथेलिया में, एपोपोसिस को ज्यादातर क्लोन सीरेज़ पर स्थित एनटीएसजी उत्परिवर्ती कोशिकाओं में पाया जाता है, यह सुझाव देता है कि आसन्न सामान्य कोशिकाओं ने एनटीएसजी उत्परिवर्ती कोशिकाओं 10 , 11 , 12 , 18 के एपोपोसिस को ट्रिगर किया। स्तनधारी कोशिकाओं में हाल के अध्ययन ने पुष्टि की है कि प्रो-ट्यूमर कोशिकाओं के इस सेल प्रतिस्पर्धा पर निर्भरता उन्मूलन 1 9 , 20 , 21 , 22 , 23 के कैंसर के खिलाफ एक विकासशील संरक्षित उपकला स्वयं रक्षा तंत्र है।
ड्रोसोफिला कल्पना डिस्क्स में एक हालिया अध्ययन, हालांकि, दिखाया गया है कि मोज़ेक एनटीएसजी-नॉकडाउन क्लोन ने नवोप्लेस्टिक ट्यूमर को निर्दिष्ट में लाया हैआईसी के पंख कल्पना के डिस्क क्षेत्रों 16 शुरुआती ट्यूमर गठन हमेशा परिधीय "हिंग" क्षेत्र में पाया जाता था और कभी-कभी पंख डिस्क उपकला के केंद्रीय "पाउच" क्षेत्र में नहीं देखा जाता था, यह सुझाव देते हुए कि एनटीएसजी-दस्तक की कोशिकाओं की ट्यूमेरीजेनिक क्षमता स्थानीय पर्यावरण पर निर्भर करती है। सेंट्रल पाउच क्षेत्र "ट्यूमर ठंडस्पोट" के रूप में कार्य करता है जहां प्रो-ट्यूमर कोशिकाओं को डिसएप्लास्टिक ओवरग्रोथ नहीं दिखाती है, जबकि परिधीय काज क्षेत्र "ट्यूमर हॉटस्पॉट" 16 के रूप में व्यवहार करता है। "थूकपॉट" पाउच क्षेत्रों में, एनटीएसजी-नॉकडाउन कोशिकाओं को बेसल तरफ से विस्फोट किया जाता है और एपोप्टोसिस होता है। इसके विपरीत, "हॉटस्पॉट" कणिका कोशिकाओं के रूप में उनके बेसल पक्षों पर मजबूत साइटोस्केलेलेट संरचनाओं का एक नेटवर्क है, एनटीएसजी-नॉकडाउन कोशिकाओं ने एपिथेलियम के शिखर पक्ष से भिगोया और ट्यूमेरीजेनिक अतिवृद्धि 16 आरंभ किया। इसलिए, कल्पनात्मक डिस्क में ट्यूमर फ़िनोटीप्स के विश्लेषण के लिए सावधानीपूर्वक कॉन्सी की आवश्यकता होती हैट्यूमेरीजेनिक उत्तेजनाओं के लिए क्षेत्र-विशिष्ट संवेदनशीलता की गति।
यहां, हम जीओएल 4-यूएएस- आरएनएआई प्रणाली का उपयोग करते हुए ड्रोसोफिला विंग इम्प्लांटल डिस्क्स में नियोप्लास्टिक ट्यूमर गठन को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके द्वारा सामान्य विंग डिस्क एपिथेलिया में एनटीएसजी-नॉकडाउन कोशिका उत्पन्न होती हैं। यद्यपि इन प्रयोगात्मक प्रणालियां कैंसर के शुरुआती चरणों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, हालांकि, कल्पित डिस्क एपिथेलिया में ट्यूमर प्रगति के चरणों का मूल्यांकन करने के लिए एक स्पष्ट वर्गीकरण विधि स्पष्ट रूप से पहले वर्णित नहीं है। इसलिए, हम तीन श्रेणियों में विंग डिस्क एपिथेलिया में प्रेरित प्रो-ट्यूमर क्लोनल फेनोनिटि को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति का प्रस्ताव भी देते हैं: हाइपरप्लासिया (बढ़ी हुई प्रसार के साथ सामान्य दिखाई देने वाले कोशिकाओं की एक अत्यधिक संख्या में संचय), डिस्प्लासीआ (असामान्य रूप से प्रदर्शित होने से बना प्रीमेंग्लांट टिशू) कोशिकाओं), और नेपलाशिया (सौम्य या घातक ट्यूमर जिसमें असामान्य उपस्थिति और असामान्य प्रसार पैटर्न वाले कोशिकाओं)।
GAL4-UAS प्रणाली ड्रोसोफिला 26 में लक्षित जीन अभिव्यक्ति के लिए सबसे शक्तिशाली आनुवंशिक टूल में से एक है और विवो 4 में ट्यूमर सेल प्रेरण और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इस प?…
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जे। यह काम जेएसपीएस कंकनी ग्रांट नंबर 26891025, 15 एच 01500 से अनुदान और YT को टूकेडा साइंस फाउंडेशन रिसर्च अनुदान द्वारा समर्थित था
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |