Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55903
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

Summary

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

Abstract

מערכת ההנדסה הגנטית של CRISPR / Cas9 חוללה מהפכה ביולוגית בכך שהיא מאפשרת עריכה מדויקת של הגנום עם מעט מאמץ. מודרך על ידי מדריך יחיד RNA (sgRNA) המעניק סגוליות, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי DNA ב מוקד ממוקדת. ההפצה DNA יכול להפעיל או שאינם הומולוגיים סוף שהצטרף (NHEJ) או הומולוגיה מכוונת לתקן (HDR). NHEJ יכול להציג מחיקות קטנות או הוספות אשר להוביל מוטציות מסגרת משמרת, בעוד HDR מאפשר הפרעות גדול יותר מדויק. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להפקת קווי תא נוקאאוט על ידי צימוד הוקמה CRISPR / Cas9 שיטות עם שתי אפשרויות לבחירה במורד / הקרנה. הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית הבחירה, שבו ייצור החלבון מוערכת על ידי אימונובלוט נקודה בצורה תפוקה גבוהה. הגישה HDR משתמש בשני sgRNA לחתוך אתרים כי טווח הגן של עניין. יחד עם תבנית HDR בתנאי, שיטה זו יכולה להשיג מחיקהשל עשרות kb, בסיוע סמן התנגדות לבחירה לבחירה. היישומים והיתרונות המתאימים של כל שיטה נדונים.

Introduction

שינויים גנטיים יציבים מספקים יתרון על פני שיטות חולפות של הפרעות סלולר, אשר יכול להיות משתנה ביעילות שלהם משך. עריכה גנומית הפכה נפוצה יותר ויותר בשנים האחרונות עקב התפתחות של נוקלאזות ספציפיות למטרה, כגון נוקלאזות של אבץ אצבע , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ו RNA מונחה נוקלאזות הנגזרות, מקובצים בקביעות interinded קצר palindromic חוזר (CRISPR) מערכת 10 .

CRISPR / Cas9 מכונות העריכה מותאמת מתוך המערכת החיסונית כי חיידקים ארכאי להשתמש כדי להגן מפני זיהומים ויראלייםהתחת = "xref"> 11 , 12 , 13 . בתהליך זה, קצרים, 20-30 nt שברי רצף ויראלי פולש משולבים לתוך לוקוס גנומי כמו "מרווחים" מוקף יחידות חוזרות 14 , 15 . תעתיק לאחר עיבוד RNA מייצר קטן CRISPR הקשורים RNAs 16 (crRNAs) כי, יחד עם הפעלת crRNA 17 (tracrRNA) מפעיל, להרכיב עם endonuclease Cas9 effector. CRRNAs ובכך לספק ספציפיות למיקוד Cas9, המנחה את המתחם לדבק רצפים דנ"א ויראלי משלימה ומניעת זיהומים נוספים 18 , 19 . כל רצף "protospacer" בדנ"א ממוקד יכול לשמש כמקור של ה- CRRNA, כל עוד הוא ישירות 5 'כדי מוטיב קצר סמוך protospacer (PAM), NGG במקרה של S. pyogenes Cas9 21 .

עם הביטוי של Cas9 ו sgRNA בתאים אוקריוטים, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי דנ"א על ​​מוקד ממוקדת. בהיעדר אזור מתאים של רצף הומולוגי, התא מתקן את ההפסקה הזאת באמצעות חיבור לא הומולוגי (NHEJ) 22 , 23 , 24 , אשר בדרך כלל מציג מחיקות קטנות או, לעתים נדירות, כניסות. בעת מיקוד פתוחמסגרת הקריאה, התיקון עלול להוביל frameeshift translational שמייצר מוצר חלבון שאינו פונקציונלי. לעומת זאת, כאשר מסופק עם תבנית אקסוגני עם אזורים גדולים של הומולוגיה, התא יכול לתקן את הפער פעמיים גדיל על ידי הומולוגיה מכוונת לתקן 25 , 26 . נתיב זה מאפשר מחיקות מדויקות יותר, תחליפים או הוספות בגנום, יחד עם הכנסת סמני הבחירה הנבחרים 27 .

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ליצירת שורות תאים נוקאאוט על ידי אחד משני אלה CRISPR / Cas9 שיטות ( איור 1 א ). הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית ההקרנה, ולכן דורש הכנה מראש upfront. בעת שימוש בשיטה זו, מדריך RNAs משלימים אקסונים ליד הקצה 5 'של התמליל, אשר סביר להניח לייצר נוקאאוט, חייב להיות מתוכנן. מאז modificatיונים לגנום במקרה זה הם קטנים, ההקרנה שיבוטים נוקאאוט מבוסס על כתמים נקודה, שבו המוצר חלבון מוערך בצורה תפוקה גבוהה. אנו משתמשים בדוגמה של ELAVL 1 כמו חלבון 1 (ELAVL1). הגישה השנייה מסתמכת על תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) ומשתמשת בשני אתרי חיתוך sgRNA המשתרעים על פני הגן או אזור העניין, ומאפשרים מחיקות של עשרות קילובייט. פלסמיד עם שני אזורים של הומולוגיה כי האגף אתרי מחשוף מספק תבנית תחליף ( איור 1B ), מציגה סמן התנגדות לבחירה כי מגביר את היעילות של הדור נוקאאוט. שיטה זו יכולה גם להיות מותאם כדי להציג שינויים גנים עם זרועות הומולוגיה מתוכנן כראוי. במקרה זה, שילוב של קטע DNA חדש מאפשר סינון מבוסס PCR ( איור 1C ). כאן, אנו משתמשים הדור של Pumilio RNA מחייב בן משפחה 2 (PUM2) נוקאוט שורות כדוגמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זיהוי של הומולוגיה אזורים סביב המחיקה הרצוי

הערה: יש צורך רק אם אתה משתמש בעריכה המבוססת על בחירה.

  1. בחר שני אזורים, בהתחלה 1.5-2 kb, משני צדי המקום הרצוי המחיקה, אשר ישמשו זרועות הומולוגיה בתבנית HDR ( איור 1 א ). זהה אזורים ללא אתרי הכרה ב- BSAI בשני החוטים (GGTC) כדי להקל על שיבוט. אם אתרי BSAI הם בלתי נמנעים, להשתמש באנזים הגבלת סוג IIs חלופי (BsmBI, SapI, BbsI) ולשנות את האתרים המתאימים של פלסמיד הנמען (pUC19-BSAI), סמן ההתנגדות התורם פלסמיד (pGolden-Neo או pGolden- היגרו), ו זרוע הומולוגיה PCR - -.

2. הדור של Cas9-sgRNA ביטוי פלסמידים

  1. הגדר את אתרי המיקוד עבור mutagenesis. עבור יחיד לחתוך, בחירה חופשית שיטה, יעד 5 'אקסונים קידוד הפרוקסימלי כדי להגדיל את ההסתברות של non-fuמוטציה פונקציונלית. עבור שני לחתוך שיטה, בחר שני אתרים כי להקיף את כמות הגן כפי הצורך.
    הערה: מניסיוננו, מחיקות של עד 53 kb נוצרות ביעילות.
  2. קלט 200-300 BP של רצף האזור ממוקד לתוך כלי העיצוב של crispr.mit.edu. עבור שיבוט מבוסס הבחירה, השתמש 200-300 BP של אזורים הומולוגיה זיהו כי הם הפרוקסימלי לוקוס המחיקה ( איור 1 א ). בחר 2-3 של הדירוג הגבוה ביותר sgRNAs לכל אזור ממוקד כדי להסביר את ההבדלים בפעילות שלהם, כדי לבודד שיבוטים עצמאיים שאינם חולקים את הפוטנציאל אותו מחוץ היעד הפוטנציאל.
  3. כדי לעצב oligonucleotides דו-צדדית עם overhangs המתאים להכנסת הביטוי פלסמיד, להשמיט את רצף PAM מסתיים (NGG) ו לצרף 5'-CACC הסככה ואחריו G אל החוט העליון אוליגו. עבור גדיל התחתונה אוליגו, לצרף 5'-AAAC התלוי על רצף היעד המשלים לאחור, ואחריו 3'-C, כמו ilמבוהל מתחת:
    רצף 1
  4. הכנס oligonucleotides סינתטי המתאים sgRNAs לתוך pSpCas9 (BB) פלסמיד באמצעות שער הזהב שיבוט 28 כמתואר בפרוטוקול מעבדה ג 'אנג 29 .

3. הדור של הומולוגיה מכוונת תיקון תבנית פלסמידים

הערה: יש צורך רק אם אתה משתמש בעריכה המבוססת על בחירה. ההומולוגיה מכוונת תיקון התבנית פלסמיד מורכב קלטת עמידות התרופה מוקף על ידי שני אזורים המשלימים את הגנום רק מחוץ לשני אתרי היעד sgRNA ( איור 1 ב ).

  1. מתוך אזורים ההומולוגיה רחב יותר מזוהה בשלב 1.1, בחר 800-1,000 bp 26 לא יותר מ 5-10 BP הרחק מעוצב Cas9 אתרים לחתוך, לשמש זרועות הומולוגיה ( איור 1 א ). הקפד לא לכלול את sgRNAאתר היעד שלה PAM בזרועות ההומולוגיה, כמו זה יגרום CRISPR / Cas9 cleavage של התבנית פלסמיד עצמו. אם הזרועות ההומולוגיה מכילות אתרי BSAI פנימיים, השתמש באתרי sgRNA חלופיים.
  2. PCR להגביר את זרועות ההומולוגיה של דנ"א גנומי באמצעות פולימראז DNA גבוהה נאמנות, לפי הוראות היצרן, באמצעות primers קדימה ויורדים עם רצף 5 'נוספים זה מציג את אתרי BSAI (GGTCTC) ו overhangs ייחודי משני צדי האזור ההומולוגיה. את overhangs חייב להכיל sequences הנכון כדי ליצור בסדר הרכבה נכונה וכיוון, כפי שמתואר להלן ( איור 1 ב ):
    שמאל זרוע ההומולוגיה זרוע FP: 5 'GGGTCTCA GGCC
    שמאל הידומולוגיה זרוע RP overhang: 5 'GGGTCTCT CACG
    זרוע הומולוגיה ימין זרוע FP: 5 'GGGTCTCA GTCC
    זרוע ההומולוגיה הנכונה: "5 GGGTCTCT CCAC
  3. בדוק נשק הומולוגיה עבור amplif המתאיםקרח באמצעות אלקטרופורזה ג'ל לפני שתמשיך קדימה.
  4. להרכיב את ימין ושמאל זרוע ההומולוגיה אזורים עם קלטת התנגדות לתוך HDR תבנית פלסמיד על ידי גולדן שער שיבוט 28 . השתמש pGolden-Neo או pGolden-היגרו פלסמידים 30 כמקור של קלטות התנגדות loxP-flanked (loxP-PGK-Neo-pA-loxP או loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). השתמש pUC19-BSAI, PUC19 שונה עם אתרים BSAI באזור שיבוט מרובים וביטל אתרי BSAI במקום אחר, כמו וקטור הנמען (זמין על פי בקשה). השתמש ביחס של 1: 1: 1: 1 עבור שלושת התוספות והקטור.
    1. הכן את תערובת התגובה הבאה 30 :
      נכון זרוע ההומולוגיה PCR המוצר 0.06 pmol (30-40ng)
      שמאל זרוע ההומולוגיה PCR המוצר 0.06 pmol (30-40ng)
      PGolden-Neo פלסמיד (100 ng / μL) /# 181; L
      PUC19-BSAI פלסמיד (100 ng / μL) 1 μL
      2x T7 DNA חיץ ligase 5 μL
      BSAI (10 U / μL) 0.75 μL
      T7 DNA ligase (3000 U / μL) 0.25 μL
      מַיִם עד 10 μL
    2. השתמש בפרמטרים thermocycler הבאים: 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור על 30 מחזורים.
    3. פנקו את המוצר שיבוט עם exonuclease לכל הוראות היצרן לעכל משם כל DNA ליניארית הנותרים.
    4. להפוך את תערובת התגובה לתוך זן E. מוסמכת coli בהתאם לפרוטוקול שסופקו עם התאים, ואת צלחת על מאכלים המכילים ampicillin.
  5. כדי לזהות שיבוטים עם הרכבה התבנית הנכונה, לבצע חיידקיםאל מושבה PCR כדי להגביר את זרועות ההומולוגיה subregions של הכנס המורכבת (כמו להכניס את כל יכול להיות גדול מדי כדי להגביר באופן מהימן). השתמש חישול אחד תחל על רצף פלסמיד אגף פריימר השני משלימים את הקלטת של התנגדות קלטת ( איור 1 ב , רצף נפוץ הן ניאו והיגרו מוסיף), יצירת מוצר תלויי הרכבה, כי הוא כ 200 BP זמן ארוך יותר מאשר זרוע ההומולוגיה הכלולה:
    PUC19-Bsal-Left: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
    התנגדות- Left: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
    PUC19-BSAI-Right: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
    התנגדות-מימין: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
    1. בחר מושבות חיידקים עם קיסמים קיסריים להשעות את החיידקים במים 20 μL. מחממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ספין למטה צנטריפוגה השולחן במהירות מקסימלית במשך 5 דקות. מניחים מיד על הקרח.
    2. הכן את תערובת ה- PCR הבאה/ Sup>
      מדולל תבנית המושבה 1.25 μL
      10x חיץ התגובה Taq 1.25 μL
      20mM dNTPs 0.25 μL
      10 מיקרומטר קדימה תחל 0.25 μL
      10 מיקרומטר הפוך פריימר 0.25 μL
      Taq פולימראז 0.25 μL
      מַיִם 9 μL
    3. השתמש פרמטרים thermocycler הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, (95 מעלות צלזיוס 30 מעלות, 61 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות / Kb), לחזור על 25 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. בדוק את המוצר PCR עבור גודל amplicon הנכון על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל.
    5. לחלופין, DNA miniprep פלסמיד מ מושבות בודדים עם גודל הכנס הנכון ורצף הE homology זרוע אזורים על ידי סנגר רצף עם primers הגברה שהוזכרו לעיל.

4. transfection של רכיבי CRISPR לתוך תאים תרבותיים

  1. לפני transfection: תרבות T-Rex293 תאים בתקשורת DMEM בתוספת 10% FBS ב 37 ° C ו 5% CO 2 .
  2. תאים צלחת על 6 צלחות היטב לגדול כ confluency 70%. כלול גם עבור שליטה untransfected.
  3. Transfect תאים עם 2.5 מיקרוגרם סה"כ פלסמיד באמצעות פרוטוקול transfection מסחרי. במקביל, לשמור על שליטה untransfected.
    הערה: שיטת Transfection ויעילות להשתנות בהתאם לסוג התא. קביעת השיטה המתאימה transfection עבור המערכת לפני הניסוי.
    1. עבור transfection של תאים עם הבחירה, להשתמש 0.75 מיקרוגרם Cas9-sgRNA 1 (חתך שמאל), 0.75 מיקרוגרם Cas9-sgRNA 2 (לחתוך מימין), ו 1.0 microg הומולוגיים רקומבינציה תבנית.
    2. עבור transfectiעל תאים ללא בחירה, להשתמש 2.5 מיקרוגרם Cas9-sgRNA פלסמיד.

5. בחירת סמים

  1. 48 שעות לאחר transfection, לטפל בתאים עם התרופה המתאימה (Neomycin / Hygromycin). לבצע את הבחירה עד שכל התאים בשליטה untransfected למות (בדרך כלל 3-5 ימים עבור ניאו, 7-14 ימים עבור היגרו).
    הערה: שימוש בריכוז של 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור Neomycin ו Hygromycin, בהתאמה עבור T-Rex293 תאים. עבור סוגי תאים אחרים, זה עשוי להיות שימושי לבצע טיטרציה מוקדמת של התרופה על תאים untransfected לקבוע את הריכוז האפקטיבי.

6. בידוד של אוכלוסיות Clonal

  1. לגדל תאים 100% confluency בבאר המקורי לאחר הבחירה. תאים זרע לתוך 96 צלחות היטב בצפיפות של 0.33 תאים לכל טוב.
    הערה: זריעת שלוש 96 צלחות טוב היא נקודת התחלה טובה כדי להבטיח בידוד של יותר אחד שיבוט נכונה, אבל פחות או יותר ייתכן שיהיה צורך depמסתיים על יעילות sgRNA ו HDR.
  2. שימו לב המושבות על פני 2-4 שבועות תקופה, עד מושבות גלויים לעין. בחר מושבות גלוי עם קצה פיפטה סטרילית reseed בבארות חדשות לעודד צמיחה monolayer. בעת שימוש בתאים ההשעיה, אפילו צפיפות זריעה נמוכה יותר ניתן להשתמש כדי להבטיח חלק גדול יותר של בארות יחיד המושבה.

7. סקר המועמדים

  1. הקרנת מועמדים ללא שימוש בבחירה: כתם נקודה
    1. לגדל שיבוטים בודדים confluency 50-100%. סילוק monolayer של תאים על ידי pipetting בתוך הבאר.
    2. Aliquot 90 μL של נפח 100 μL הכולל צינור microcentrifuge נקי. ספין למטה ב 6000 סל"ד במשך 5 דקות, להסיר מדיה, ו lyse תא גלולה ב 10 μL של 1x תמוגה חיץ או 1x SDS טוען חיץ (5x: 250 מ"מ טריס- CL pH 6.8, 8% SDS, 0.1% ברומופנול כחול, 40% גליצרול, 100 מ"מ DTT). הוסף 90 μL של מדיה חדשה לשאר התאים ב wel• להמשיך ולהפיץ.
    3. פיפטה 1 μL של lysate התא על קרום nitrocellulose יבש כדי ליצור נקודה. כתם כל פעמיים על שני קרום נפרד, יצירת שני דפוסים זהים של דגימות.
    4. לחסום את הממברנות בחלב 5 ב TBST (טריס שנאגרו מלוחים + 0.01% Tween 20: 8 גרם NaCl, 0.2g KCl, 3 גרם בסיס Tris, עד 1 L מים מזוקקים, pH 7.4) 31 עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר ( עם נדנדה, כאן לאורך כל התהליך).
    5. כתם באמצעות נוגדנים ראשוניים נגד חלבון המטרה על קרום אחד, ואת הנוגדן העיקרי עבור חלבון שליטה (טובולין, GAPDH, או כל חלבון אחר שלא צפוי לשנות) מצד שני. השתמש דילול נוגדן ראשוני מומלץ (0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור ELAVL1 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור Pum2 במקרה זה) ב TBST + 5% חלב. דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    6. לשטוף 3 פעמים עם TBST במשך 5 דקות.
    7. דגירה כל קרום עם המתאים HRP מצומדות נוגדנים משני ב TBST + 5% חלב עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    8. לשטוף 3 פעמים עם TBST במשך 5 דקות.
    9. החל פתרון chemiluminescence המצע (ראה טבלה חומרים) בעקבות הוראות היצרן ואת התמונה קרום מנוקב על imager דיגיטלית chemiluminescence.
    10. לכמת עוצמות נקודה עבור היעד וחלבונים שליטה באמצעות התוכנה המתאימה.
    11. לחסל את המועמדים עם האות חלבון שליטה נמוכה, ולחשב יחסי יחס-הרקע של היעד לשלוט בעוצמות חלבון עבור המועמדים הנותרים. בחר את המועמדים עם היחס הנמוך ביותר עבור מעבר אימות נוסף על ידי כתם המערבי.
  2. הקרנת מועמדים עם הבחירה של בחירה: מושבה PCR
    1. איסוף lysate התא באמצעות ערכת הכנה DNA (ראה טבלת חומרים ).
      1. כפולות מושבות בודדות חדש 96 גם לגדול עד 100% confluency.
      2. הסר מדיה מקבוצה אחת של שיבוטים, אNd resuspend תאים μL 30 של חיץ החילוץ מתוך הערכה. העברה צינור נקי 1.5 מ"ל microcentrifuge.
      3. מחממים את הפתרון ל 96 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולתת מגניב לטמפרטורת החדר.
      4. הוסף 30 μL של חיץ ייצוב מן הערכה. לערבב היטב.
    2. זיהוי wildtype ו monoallelic / biallelic שורות מוטציה על ידי המושבה PCR.
      1. עיצוב שתי קבוצות נפרדות של primers PCR (בצד שמאל וימין של מוקד לוקוס) כדי להגביר את האזורים סביב זרועות הומולוגיה מבוסס על שילוב מוצלח או לא מוצלח של קלטת התנגדות ( איור 2 ג ). בכל צד, להשתמש פריימר משותף (אדום) כי anneals מחוץ זרוע ההומולוגיה. השתמש בו עם פריימר משויך המקביל כי הוא משלים את רצף אנדוגני, פורש באזור ההומולוגיה (כחול), כדי לבדוק את אלל wild-type. השתמש בפריימר משויך אחר, המשלים לקלטת ההתנגדות שהוכנסה (ראה פריימרים בסעיף2.3), כדי לבדוק את המוטציה הרצויה.
      2. (מומלץ) לאמת את ערכות פריימר באמצעות lysate התא מתוך האוכלוסייה שנבחרה בתא המקומי בתפזורת, שכן הוא יכיל תערובת של אללים WT ו מוטנטים ( איור 2 ד ).
      3. הכינו את תערובת התגובה הבאה:
        נייד lysate 0.5 μL
        10x חיץ KOD 1.25 μL
        25 מ"מ MgSO4 0.75 μL
        2 mN dNTPs 1.25 μL
        10 מיקרומטר קדימה תחל 0.375 μL
        10 מיקרומטר הפוך פריימר 0.375 μL
        פולימרז KOD 0.25 μL
        מַיִם 7.75 μL
      4. השתמש בתנאי thermocycler הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, פריימר TM במשך 10 שניות, 70 מעלות צלזיוס למשך 20 s / kb) חזור על 25 מחזורים.
      5. דמיינו את מוצר ה- PCR על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל.
    3. חזור על בדיקת המושבה PCR עבור כל צד של האינטגרציה החזוי. בחר והרחב מועמדים המציגים נוכחות של אינטגרציה וללא מוצר אנדוגני רצף עבור האזור שנמחק.
    4. לאמת מועמדים חיוביים על ידי כתם המערבי ו / או RT-qPCR.

8. אמת את המוטציה הגנומית על ידי רצף

  1. בידוד DNA גנומי מקווי תא מוטציה על ידי הפקת chloroform פנול 31 .
  2. PCR להגביר את אזור היעד sgRNA, באמצעות primers עם 5 'overhangs כי להוסיף אתרים הגבלת BSAI לכל קצה.
    הערה: עבור שיבוטים שנערכו עם HDR, כאשר האללים עשויים להיות זהים, ניתן יהיה לרשום את מוצר ה- PCR ישירות.
  3. לשכפל את האזור מוגבר לתוך pUC19-BSAI על ידי שיבוט שער הזהב.
  4. להפוך את תערובת התגובה לתוך זן E. המוסמכת coli .
  5. Miniprep DNA פלסמיד מ 6-10 מושבות בודדות רצף האזור משובטים על ידי רצף סנגר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבור הדור של שורות ELOWL1 נוקאאוט, נוגדנים חזקים היה זמין, כך העריכה באמצעות sgRNAs יחיד ( איור 1 א , משמאל) בוצעה, ואחריו אימונובלוט נקודה. שלושה sgRNAs היו transfected באופן עצמאי כדי להשוות את היעילות כדי לשלול את ההשפעות היעד שיבוטים וכתוצאה מכך. לאחר איסוף ו lysates תא סופג מאוכלוסיות משובטים על שני קרומי ניטרוצלולוזה, כתמים נבדקו הן ELAVL1 ו PUM2 (כבקרת נורמליזציה) ( איור 2 א ). היחס הכמותי של ELAVL1 לאות PUM2 הראה טווח רחב מאוד, של 10 4 בין הקווים המבודדים ( איור 2 ב ). באמצעות יחס זה כקריטריון לבחירה, אנו לאמת מספר שורות באמצעות elavl1 כתמים המערבי ( איור 3 א ). ברוב המקרים, אוכלוסיות משובטות עם האות ELAVL1 הנמוך ביותר היומזוהה כראוי knockouts ( איור 2 ב ), המאשר את הכוח החזוי של כימות זה (למרות השתנות ניכרת האות שליטה, אשר ככל הנראה נובעים ממספר שונה של תאים שנאספו). לעומת זאת, רוב שיבוטים עם יחסי ביניים הראו אות ELAVL1 על אימות, המייצג פוטנציאל מחיקת אירועים monoallelic. עם זאת, לא נמצאו שכבות כלליות של היחידות ל- WT, monalallelic ומלא (biallelic) בריכות מוטציה, ואפילו שיבוטים חיוביים ELAVL1 הציג מגוון רחב ומתמשך של רמות, ככל הנראה עקב השתנות המשובטים של הביטוי. האפקטיביות הכוללת של הדור ELAVL1 נוקאאוט בשיטה זו נע בין 6 ל 36% בין sgRNAs.

עבור מטרות גנטיות אחרות (כגון PUM2), איכות הנוגדנים הקיימים מונעת סינון מדויק של שיבוטים מועמדים על ידי כתם נקודה בשל רקע גבוה מ cross-. בנוסף, היעילות של מיקוד חלק loci הגנומי עשוי להיות נמוך משמעותית בשל נגישות הכרומטין. במקרים כאלה, שיטה תלויית בחירה מתאימה להגברת היעילות. שני sgRNAs מיקוד מוקדם ומאוחר אזורי קידוד של PUM2 היו cotransfected עם התבנית הומולוגיה מכוונת לתקן על מנת לבלו 45 קילו של הדנ"א הגנומי ולהחליף אותו עם קלטת התנגדות neomycin ( איור 1 א , מימין). הרכבה של תבנית הומולוגיה מתואר באיור 1B . PCR primers נועדו להגביר אזורים סביב זרועות הומולוגיה מבוסס על שילוב מוצלח או לא מוצלח של קלטת התנגדות ( איור 2 ג ), ונבדקו על untransfected ותאי שנבחרו בתפזורת (פאנל שמאל). כצפוי, בתאי untransfected, רק amplicon המקביל למצב אנדוגני (למעלה) נצפתה, בעוד התאים שנבחרו בתפזורת הראו amplicons משניWild-type ו mutles אללים. תאים lysates מן המועמדים המשובטים שנוצר נאספו והוקרנו על נוכחות של שני רצף אנדוגני קלטת ההתנגדות. נוקאאוטס מועמדים זוהו על ידי נוכחות של amplicon קלטת התנגדות לבד, המציין מחיקת biallelic / אינטגרציה ( איור 2 ד , כוכבים). שיבוטים עם החדירות monoallelic נצפו גם, היו נפוצים למדי, שכן אוכלוסיות כאלה יכולים גם לשרוד את תהליך הבחירה. שיבוטים אלה היו מסומנים על ידי נוכחות של שני רצף אנדוגני קלטת ההתנגדות. במקרים ספורים, גם wildtypes המשובטים במיקומים שנבדקו נצפו, דבר המצביע על כך שאינטגרציה גנומית אקראית, לא- sgRNA בסיוע בתבנית תיקון המכוונת בהומולוגיה מתרחשת בתדירות נמוכה. Biallelic שורות מוטציה היו מאומתים נוספת על ידי כתם המערבי ( איור 3 ב ). היעילות הכוללת של הדור נוקאאוט באמצעות ההליך HDR היה 33%.

איור 1
איור 1: זרימת עבודה להפקת נוקאאוטות של CRISPR בתיווך בקווי תא יונקים. ( א ) עריכת אירועים הגנום המיוצרים על ידי CRISPR / Cas9 cleavage ו NHEJ (משמאל) או HDR (מימין). האתר של מחשוף Cas9 מסומן על ידי קו אנכי לבן. ( ב ) רכיבים הרכבה של HDR תבנית פלסמיד. אנזימי ההגבלות מטיפוס II המשמשים לשיבוט של שער הזהב, כגון BSAI, מזהים רצף DNA א-סימטרי ומשאירים חתך מתנדף מחוץ לרצף ההכרה, ומאפשרים תכנון של מקטעים חופפים שרירותיים להרכבה (בתמונה). חצים מצביעים על עמדות פריימר כדי לבדוק את הרכבה פלסמיד נכון. ( ג ) זרימת עבודה: לאחר transfection (ובחירת סמים אם רלוונטי), תאים מצופים על הגבלת דילולים 96 צלחות היטב. אוכלוסיות משובצותהם מוקרנים או על ידי נקודה immunoblot (בחירה עצמאית, NHEJ) או המושבה PCR (הבחירה תלוי, HDR). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הקרנת המועמד קווי נוקאאוט על ידי כתמים נקודה או מושבה PCR. ( A ) אימונובלוט נקודה של שיבוטים ממוקדים ELAVL1 מבודדים עם נוגדנים ELAVL1 (משמאל), בנפרד עם נוגדנים לחלבון שליטה, Pum2 (מימין). שיבוטים אשר הציגו אות שליטה קטנה, ככל הנראה בשל כמות חלבון נמוכה קלט, מסומנים עם X ו נשלל מניתוח נוסף. שיבוטים עם אות ELAVL1 נמוך (מעגלים) נבדקו עוד על ידי כתמים מערביים שאישר (ירוק) או פגום (אפור) המועמדים. ( ב ) כימות KO גואובדן של כתם נקודה. יחסים של ELAVL1 כדי לשלוט על אות חלבון כתם נקודה שמוצג ב, בסדר עולה. ( ג ) פריימר עיצוב עבור נוקאאוט / בדיקות ההכנסה דרך המושבה PCR. פריימר המשלים את האזור הגנומי מחוץ לאזור הזרוע ההומולוגית (אדום) מזווג עם פריימר המשלים את הרצף האנדוגני (כחול) או לקלטת ההתנגדות (ירוק), בודק את המצב הלא ערוך או אירוע מחיקה / החדרה , בהתאמה. זוגות פריימר נפרדים נועדו לבחון את שני הצדדים של האינטגרציה. ( ד ) דוגמה agarose ג'ל של מושבה תוצאות PCR באמצעות פריימרים פורש צומת אינטגרציה במעלה באמצעות פריימרים פנימי אנדוגני (למעלה) ו נוקאאוט בתוך primers (תחתית). Primers מאומתים הראשון בשני תאים T-Rex293 ההורים ותאים שנבחרו בתפזורת (משמאל). שיבוטים מועמד הפרט (באמצע) ואת דפוסי הלהקה הצפויה עבור WT, KO ו monoallelic המחיקה (WT / KO) שיבוטים (מימין). שיכורים ביאליקיים נוקאאוט מצביעD על ידי כוכב. מוצרי הגברה נכונה מסומנים על ידי החצים השחורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: אימות של מועמדים נוקאאוט על ידי כתם המערבי. ( A ) כתם המערבי עבור ELAVL1 (העליונה) של תת קבוצה של שיבוטים שזוהו על ידי כתם נקודה. PUM2 היה כתם על אותו קרום כמו בקרת הטעינה (התחתון). ( B ) כתם המערבי עבור PUM2 (למעלה) של תת קבוצה של שיבוטים שזוהו על ידי המושבה PCR. GAPDH היה כתם על אותו קרום כמו בקרת הטעינה (התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת CRISPR / Cas9 אפשרה ייצור יעיל של שינויים גנומיים יציבים, המספקים חלופה עקבית יותר לשיטות מניפולציה אחרות. הנה, הצגנו שתי שיטות לזיהוי מהיר של CRISPR / Cas9 גן knockouts בקווים תא יונקים. שתי השיטות דורשות חומר סלולרי קטן, ולכן הבדיקה יכולה להתבצע בשלבים המוקדמים של התרבות המשובצת, חיסכון בזמן ריאגנטים. כדי להגביר את היעילות של שתי השיטות, אנו ממליצים לבדוק sgRNAs מרובים, כמו יעילות להשתנות בהתאם רצף מיקום הגנום. בנוסף, שימוש sgRNAs מרובים הוא שימושי בזיהוי השפעות מחוץ היעד על ידי גילוי פנוטיפים outlier כתוצאה של מוטציות בגנים שאינם ממוקדים. Transfection יעיל Casvage Cas9 יגדיל מאוד את הסיכויים ליצירת נוקאאוט. לחלופין, transfecting התאים ישירות עם sorced sorced מסחרי / Cas9 ribonucleoprotein קומפלקסים 32 ,33 עשוי לזרז את הפרוטוקול ואת ההשפעות מחוץ היעד.

כתמים נקודה מתאימים היטב להעריך נוקאאוט חלבון שנגרם על ידי שינויים גנומיים קטנים עקב NHEJ. מאז רק אחד sgRNA / Cas9 לבנות יש צורך, גישה זו עשויה להיות המהירה ביותר בקבלת שורות null, ואת הליך כתם עוקף צעדים נוספים, להאיץ את ההקרנה. את האות מנורמל immunoblot מנורמל משמש מנבא אמין של אימות מוצלח ( איור 2 ב ). פרוטוקול זה אידיאלי עבור הדור של knockouts עם הפרעות גנומי מינימלי. לחלופין, שיטה זו של ההקרנה ניתן להתאים בדיקה עבור תוספת חלבון או שינוי, כגון חלבונים מהונדס או תגי חלבון. עם זאת, שיטה זו ההקרנה דורש נוגדנים עם סגוליות גבוהה לחלבון של עניין, כמו צולבות תגובת מובילה לרקע גבוה כתמים נקודה. שיטה זו מוגבלת באופן טבעי למיקוד מוטציותחלבון אזורים, כמו התפוקה הסופית תלוי נוכחות / היעדרות של מוצר חלבון. חשוב גם לציין כי מוטציות שנגרמו על ידי NHEJ יכול להוביל מגוון של תוצאות חלבון, כולל חלבון עם תפקוד שלילי פעיל, חלקי או דומיננטי שלילי, או חלבון פונקציונלי חסר epitope נוגדן זיהוי. כדי למזער בעיות אלה, זה עוזר למקד את CAS9 לחתוך מוקדם ככל האפשר לאזור קידוד, על מנת להגדיל את הסיכויים לייצר חלבון שאינו פונקציונלי לחלוטין. בנוסף, מיקוד אזורים גנומיים כי הם פחות נגישים מכונות CAS9 יכול לייצר תשואות מחיקה נמוכה בהעדר בחירה. לבסוף, נוקאאוט המעניקים חסרון סלקטיבי עשוי להיות קשה להשיג בשיטה זו מסיבות דומות.

באמצעות מנגנונים תיקון מכוונת הומולוגיה יחד עם crispr / cas9 cleavage מאפשר מניפולציות גנומי הרבה יותר ספציפי ספציפי יותר, אשר יכול לכלול הן laRge בקנה מידה מחיקות (מסומן על ידי שני clevages sgRNA) והכנסות. מאז שני אירועים מחשוף תהליך תיקון מדויק צריך להתקיים, שילוב של סמן עמידות התרופה מגדיל משמעותית תשואות נוקאאוט בשיטה זו. למרות איתור כתם נקודה יכול לשמש גם, ההקרנה על ידי המושבה PCR הוא יותר ישים באופן כללי כדי לזהות במדויק נכון / אינטגרטיבי נכונות נוקאאוט עם הפרעות גנומי גדול כזה. יתר על כן, בדיקה על ידי PCR מאפשר זיהוי של שיבוטים עם אינטגרטיבים שלם ואינו שלם, אשר יכול לספק תובנה לגבי היקף ואופי של תהליך HDR עצמו. בנוסף, הסמן המוצג ניתן להסיר לאחר מכן (על ידי ביטוי Cre חולף או תוספת בצורת קרום חדיר), משאיר צלקת מינימלית, 34 מחיקת BP (אתר loxp) ומאפשר שימוש חוזר בעתיד של סמן הבחירה. הגמישות של גישה זו מגדילה את השימוש של סמנים התנגדות מרובים, המאפשרים את הדור של cumu מרוביםחלבון. חשוב בעת החלת שיטה זו כי העדר של מוצר הוא תוקף נוסף, למשל על ידי RT-qPCR של תמליל צפוי. מאז המסך הזה יכול להיות נוגדנים עצמאית, שיטה זו מוחלת בקלות על נוקאאוט חלבון ללא נוגדנים חזקים, כמו גם כדי לזהות שינויים שאינם נופלים חלבון קידוד גנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים היו רוצים להודות Gissell Sanchez, מייגן לי, וג 'ייסון Estep לסיוע ניסיוני, וייפנג גו ו Xuemei חן על שיתוף ריאגנטים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1x SDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  2. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  3. Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
  4. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  5. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
  6. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  7. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  8. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  9. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  10. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
  11. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  12. Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
  13. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  14. Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  15. Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
  16. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  17. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  18. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  19. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  20. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  21. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  22. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  23. Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
  24. Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
  25. Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
  26. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  28. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  29. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  30. Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
  31. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  32. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  33. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 124 CRISPR / Cas9 תיקון הומולוגיה מונע לא הומולוגיים סוף הצטרפות נקודה כתם מבחר משובטים הקרנה
הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sternburg, E. L., Dias, K. C.,… More

Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter