Summary
I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.
Abstract
Il sistema di ingegneria del genoma CRISPR / Cas9 ha rivoluzionato la biologia permettendo di modificare il genoma in modo preciso e con poco sforzo. Guidato da una singola guida RNA (sgRNA) che conferisce specificità, la proteina Cas9 ferma entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. La rottura del DNA può scatenare un collegamento non terminale (NHEJ) o una riparazione diretta (HDR) omologica. NHEJ può introdurre piccole delezioni o inserzioni che portano a mutazioni di fotogrammi, mentre HDR consente perturbazioni più grandi e più precise. Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout accoppiando i metodi CRISPR / Cas9 stabiliti con due opzioni per la selezione / screening a valle. L'approccio NHEJ utilizza un singolo sito di taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, in cui la produzione di proteine viene valutata mediante immunoblot dot in modo ad alto rendimento. L'approccio HDR utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano sul gene di interesse. Insieme a un modello HDR fornito, questo metodo può raggiungere la cancellazioneDi decine di kb, aiutato dal marker di resistenza selezionabile inserito. Vengono discusse le opportune applicazioni ei vantaggi di ciascun metodo.
Introduction
Le alterazioni genetiche stabili offrono un vantaggio rispetto ai metodi transitori di perturbazione cellulare, che possono essere variabili nella loro efficienza e durata. L'editing genomico è diventato sempre più comune negli ultimi anni a causa dello sviluppo di nucleasi specifiche di target, quali le nucleasi di zinco-dito , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , nucleasi efficace (TALEN) simili all'attivatore di trascrizione 6 , 7 , 8 , 9 E nucleasi guidate da RNA derivate dal sistema di ripetizioni palindromiche corte (CRISPR) regolarmente interspaziate in cluster 10 .
La macchina di montaggio CRISPR / Cas9 è adattata da un sistema immunitario che batteri e archea usano per difendersi dalle infezioni viraliAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In questo processo, brevi, 20-30 nt frammenti di sequenza virale invasiva sono incorporati in un locus genomico come "distanziatori" fiancheggiati da unità ripetitive 14 , 15 . La successiva trascrizione e l'elaborazione di RNA generano piccoli RNA 16 associati a CRISPR (crRNAs) che, insieme a un crRNA trans-attivante 17 (tracrRNA), si riuniscono con l'endonucleasi efficace Cas9. I crRNA forniscono quindi la specificità per il targeting di Cas9, guidando il complesso per sequestrare sequenze DNA complementari virali e prevenire ulteriori infezioni 18 , 19 . Ogni sequenza "protospacer" nel DNA mirato può servire come fonte del CRRNA, purché sia direttamente 5 'a un breve motivo adiacente protospacer (PAM), NGG nel caso di S. pyogenes Cas9 21 .
Dopo l'espressione di Cas9 e di un sgRNA nelle cellule eucariotiche, la proteina Cas9 elimina entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. In assenza di una regione adatta di sequenza omologa, la cella risolve questa rottura mediante l'adesione finale non omologica (NHEJ) 22 , 23 , 24 , che presenta tipicamente piccole delezioni o, raramente, inserzioni. Quando si punta ad un apertoLa riparazione probabilmente porta ad un frameshift traslatorio che produce un prodotto proteico non funzionale. Al contrario, quando è dotato di un modello esogeno con grandi regioni di omologia, la cellula può fissare la rottura a doppio filamento con la riparazione diretta dell'omologia 25 , 26 . Questo percorso consente di eliminazioni, sostituzioni o inserzioni nel genoma più precise, accoppiato con l'introduzione di marcatori di selezione accisa 27 .
Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout mediante uno di questi due metodi CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). L'approccio NHEJ utilizza un unico sito taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, e quindi richiede una piccola preparazione anticipata. Quando si utilizza questo metodo, devono essere progettati i RNA complementari agli esoni prossimi all'estremità 5 della trascrizione, che sono più probabili a produrre un eliminazione. Dal momento che il modificatoGli ioni al genoma in questo caso sono piccoli, lo screening per i cloni di knockout si basa su macchie dot, dove il prodotto proteico viene valutato in modo ad alto rendimento. Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di ELAV come proteine 1 (ELAVL1). Il secondo approccio si basa sulla riparazione diretta dell'omologia (HDR) e utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano il gene o regione di interesse, consentendo la cancellazione di decine di kb. Un plasmide con due regioni di omologia che fiancheggiano i siti di scissione fornisce un modello di sostituzione ( Figura 1B ), introducendo un marker di resistenza selezionabile che aumenta l'efficienza della generazione di eliminazione. Questo metodo può anche essere adattato per introdurre modifiche geniche con armi di omologia adeguatamente progettate. In questo caso, l'integrazione di un nuovo frammento di DNA consente di effettuare uno screening basato su PCR ( Figura 1C ). Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di Pumilio RNA 2 (PUM2).
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Protocol
1. Identificazione delle regioni di omologia intorno alla desinenza desiderata
NOTA: necessaria solo se si utilizza la modifica basata su selezione.
- Selezionare due regioni, inizialmente 1.5-2 kb, da entrambi i lati del locus di deselezione desiderato, che servirà come armi di omologia nel modello HDR ( Figura 1A ). Identificare le regioni che non dispongono di siti di riconoscimento BsaI su uno strato (GGTCTC) per facilitare la clonazione. Se i siti BsaI sono inevitabili, utilizzare un enzima di restriction di tipo IIs (BsmBI, SapI, BbsI) e modificare i siti corrispondenti nel plasmide destinatario (pUC19-BsaI), plasmide donatore di marker di resistenza (pGolden-Neo o pGolden-Hygro) e Sbalzi del prodotto PCR del braccio di omologia.
2. Generazione di Plasmidi Espressivi Cas9-sgRNA
- Definire i siti di targeting per la mutagenesi. Per il metodo a singolo taglio, senza selezione, gli esoni codificanti prossimali 5 'per aumentare la probabilità di un non-fuMutazione nzione. Per il metodo a due tagli, selezionare due siti che coprono gran parte del gene come necessario.
NOTA: nella nostra esperienza, le eliminazioni fino a 53 kb sono create in modo efficiente. - Inserisci 200-300 bp della sequenza di regione mirata nello strumento di progettazione crispr.mit.edu. Per la clonazione basata sulla selezione, utilizzare 200-300 bp delle regioni di omologia identificate che sono prossime al luogo di eliminazione ( Figura 1A ). Selezionare 2-3 dei sgRNA più alti per regione mirata per tenere conto delle differenze nella loro attività e isolare cloni indipendenti che non condividono gli stessi potenziali effetti off-target.
- Per progettare oligonucleotidi duplexati con opportuni sporgenze per l'inserimento nel plasmide di espressione, omettere la sequenza finale di PAM (NGG) e appendere uno sbalzo di 5'-CACC seguita da un G al oligo di filo superiore. Per l'oligo di fondo filo, aggiungere un 5'-AAAC overhang alla sequenza bersaglio inversa-complementata, seguita da un 3'-C, come ilLustrato sotto:
- Inserire oligonucleotidi sintetici corrispondenti agli sgRNA nel plasmide pSpCas9 (BB) utilizzando la clonazione Golden Gate 28 come descritto nel protocollo Zhang Lab 29 .
3. Generazione di Plasmidi di Riparazione di Homologia-Directed
NOTA: necessaria solo se si utilizza la modifica basata su selezione. Il plasmide del modello di riparazione rivolto ad omologia è costituito da un cassetto di resistenza alla droga affiancato da due regioni che sono complementari al genoma appena al di fuori dei due siti di sgRNA ( Figura 1B ).
- Dalle regioni di omologia più ampie individuate nel punto 1.1, selezionare 800-1.000 bp 26 non più di 5-10 bp distanti dai siti di taglio Cas9 progettati per servire come armi di omologia ( Figura 1A ). Assicurarsi di non includere il sgRNAIl sito di destinazione e il suo PAM nelle armi di omologia, in quanto ciò causerà la scissione di CRISPR / Cas9 del plasmide del template stesso. Se le armi di omologia contengono siti BsaI interni, utilizzare sgRNA alternative.
- PCR amplifica le armi di omologia da un DNA genomico utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà, secondo le istruzioni del produttore, utilizzando primer avanti e invertiti con una sequenza aggiuntiva di 5 'che introduce siti di BsaI (GGTCTC) e sovrapposizioni uniche su entrambe le estremità della regione di omologia. Le sommità devono contenere sequenze appropriate per generare l'ordine e l'orientamento correttamente assemblati, come descritto di seguito ( Figura 1B ):
Braccio omologo sinistro FP sbalzo: 5 'GGGTCTCA GGCC
Braccio omologo sinistro RP sbalzo: 5 'GGGTCTCT CACG
Braccio omologo destro Busto FP: 5 'GGGTCTCA GTCC
Braccio omologo destro RP sbalzo: 5 'GGGTCTCT CCAC - Controllare le braccia di omologia per un appropriato amplifZione mediante elettroforesi a gel prima di procedere in avanti.
- Montare le regioni di braccio dell'omologia destra e sinistra con la cassetta di resistenza in un plasmide di template HDR mediante la clonazione di Golden Gate 28 . Utilizzare plasmidi pGolden-Neo o pGolden-Hygro 30 come fonte di cassette di resistenza loxP-flanked (loxP-PGK-Neo-pA-loxP o loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Utilizzare pUC19-BsaI, un pUC19 modificato con i siti BsaI nella regione multipla di clonazione e eliminare i siti BsaI altrove, come vettore destinatario (disponibile su richiesta). Utilizzare un rapporto di 1: 1: 1: 1 per i tre inserti e il vettore.
- Preparare la seguente miscela di reazione 30 :
Prodotto PCR braccio omologo destro 0,06 pmol (30-40 ug) Prodotto PCR braccio omologo sinistro 0,06 pmol (30-40 ug) Plasmid pGolden-Neo (100 ng / μL) 1 &# 181; L Plasmid pUC19-BsaI (100 ng / μL) 1 μL 2x T7 DNA ligase buffer 5 μL BsaI (10 U / μL) 0,75 μL T ligando del DNA (3000 U / μL) 0,25 μL acqua Fino a 10 μL - Utilizzare i seguenti parametri del termociclatore: 37 ° C per 5 min, 20 ° C per 5 min. Ripetere per 30 cicli.
- Trattare il prodotto di clonazione con un'esonucleasi secondo le istruzioni del produttore per digerire via qualsiasi DNA DNA ancora linearizzato.
- Trasformare la miscela di reazione in un ceppo E. coli competente secondo il protocollo fornito con le cellule e piastra su piatti contenenti ampicillina.
- Preparare la seguente miscela di reazione 30 :
- Per identificare i cloni con l'assembly corretto del template, eseguire batteriAl colonia PCR per amplificare le subregioni del braccio di omologia dell'inserto assemblato (in quanto l'intero inserto può essere troppo grande per amplificare in modo affidabile). Utilizzare un primer annealing alla sequenza plasmidiana affiancata e un secondo primer complementare al bordo della cassetta di resistenza ( figura 1B , la sequenza è comune a entrambi gli inserti Neo e Hygro), generando un prodotto dipendente dall'assieme che è di circa 200 bp più di Il braccio omologato contenuto:
PUC19-Bsal-Left: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Resistenza a sinistra: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-Destra: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Resistenza destra: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Selezionare le colonie batteriche con stuzzicadenti sterili e sospendere i batteri in 20 μL di acqua. Riscaldare a 95 ° C per 15 minuti e scendere in una centrifuga a tavola a velocità massima per 5 min. Posizionare immediatamente sul ghiaccio.
- Preparare la seguente miscela PCR 31 </ Sup>:
Modello diluito colonia 1,25 μL Tampone di reazione Taq 10x 1,25 μL 20mM dNTPs 0,25 μL 10 μM Primer avanti 0,25 μL 10 μM primer inverso 0,25 μL Taq Polymerase 0,25 μL acqua 9 μL - Utilizzare i seguenti parametri del termociclatore: 95 ° C per 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min / kb), ripetere per 25 cicli, 72 ° C per 2 minuti.
- Controllare il prodotto PCR per una dimensione corretta dell'amplicone mediante elettroforesi del gel agarosico.
- Facoltativamente, il miniprep plasmide DNA da singole colonie con corretto inserimento dimensioni e sequenza thE regioni di braccio di omologia mediante sequenziamento di Sanger con i primer di amplificazione sopra menzionati.
4. Trasfezione dei componenti CRISPR nelle cellule coltivate
- Prima della trasfezione: le cellule di coltura T-REx293 in supporti DMEM completati con il 10% di FBS a 37 ° C e il 5% di CO 2 .
- Le cellule di piastre su piastre a 6 pozzetti e crescono fino a circa il 70% di confluenza. Includere un pozzo per un controllo non trasfettato.
- Cellule transfettate con plasmide totali di 2,5 μg usando un protocollo di transfection commerciale. Parallelamente, mantenere il controllo non trascurato.
NOTA: Il metodo e l'efficienza della trasfezione variano a seconda del tipo di cellula. Determinare il metodo appropriato di trasfusione del sistema prima dell'esperimento.- Per la trasfezione delle cellule con selezione, utilizzare 0,75 μg di Cas9-sgRNA 1 (taglio sinistro), 0,75 μg di Cas9-sgRNA 2 (taglio destro) e 1,0 μg di template di ricombinazione omologa.
- Per transfectiSu cellule senza selezione, utilizzare 2,5 μg di Cas9-sgRNA plasmide.
5. Selezione dei farmaci
- 48 h dopo la trasfezione, trattare le cellule con il farmaco appropriato (Neomycin / Hygromycin). Effettuare la selezione fino a quando tutte le cellule del controllo non transfettato muoiono (tipicamente 3-5 giorni per Neo, 7-14 giorni per Hygro).
NOTA: Utilizzare concentrazioni di 500 μg / mL e 10 μg / mL per Neomycin e Hygromycin rispettivamente per le cellule T-REx293. Per altri tipi di cellule, può essere utile effettuare una precedente titolazione di farmaci sulle cellule non trasfettate per determinare la concentrazione effettiva.
6. Isolamento delle popolazioni clonali
- Crescere le cellule al 100% di confluenza nel pozzo originale dopo la selezione. Le cellule di semi in 96 pozzetti a densità di 0,33 cellule per pozzetto.
NOTA: Seeding tre piatti da 96 pozzetti è un buon punto di partenza per assicurare l'isolamento di più di un clone corretto, ma più o meno può essere necessario depTerminando sull'efficienza di sgRNA e HDR. - Osservate le colonie durante un periodo di 2-4 settimane, fino a quando le colonie non sono visibili all'occhio. Scegli le colonie visibili con una punta pipetta sterile e un reseed in nuovi pozzetti per favorire la crescita monostrato. Quando si utilizzano cellule di sospensione, possono essere utilizzate anche densità di semina inferiori per garantire una maggiore percentuale di pozzetti singoli.
7. Screening candidati
- Screening candidati senza l'uso della selezione: macchia dot
- Crescere cloni individuali a confluenza 50-100%. Dislodge il monostrato delle cellule pipettando all'interno del pozzo.
- Aliquota 90 μL del volume totale di 100 μL in un tubo di microcentrifuga pulito. Spin giù a 6000 giri / min per 5 min, rimuova i supporti e lascia il pellet di cellule in 10 μL di 1x lysis buffer o 1x buffer di carico SDS (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, SDS 8%, blu bromofenolo 0,1% Glicerolo, 100 mM DTT). Aggiungere 90 μL di nuovi media al resto delle cellule del welPer continuare a propagare.
- Pipettare 1 μL di lisato cellulare su una membrana nitrocellulosa secca per formare un punto. Blot ogni campione due volte su due membrane separate, creando due modelli identici di campioni.
- Bloccare le membrane in 5% di latte in TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g di base Tris, fino a 1 L di acqua distillata, pH 7,4) 31 per 1 h a temperatura ambiente Con il dondolo, qui e durante la procedura).
- Blot utilizzando l'anticorpo primario contro la proteina bersaglio su una membrana e l'anticorpo primario per una proteina di controllo (tubulina, GAPDH o qualsiasi altra proteina che non si prevede di cambiare) dall'altro. Utilizzare la diluizione anticorpo primaria raccomandata (0,2 μg / mL per ELAVL1 e 0,1 μg / mL per Pum2 in questo caso) in TBST + 5% di latte. Incubare 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
- Incubare ogni membrana con appropriato anticorpo secondario coniugato HRP in TBST + 5% di latte per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
- Applicare la soluzione di substrato di chemiluminescenza (vedi tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore e imagine la membrana blottata su un imager digitale di chemiluminescenza.
- Quantificare le intensità dei punti per le proteine di destinazione e di controllo utilizzando il software appropriato.
- Eliminare i candidati con basso segnale di proteina di controllo e calcolare i rapporti sottostrati in background per controllare le intensità proteiche per i rimanenti candidati. Seleziona i candidati con i rapporti più bassi per il passaggio e l'ulteriore validazione con la macchia western.
- Screening candidati con l'uso della selezione: colonia PCR
- Raccogliere il lisato cellulare utilizzando un kit di preparazione del DNA (vedi tabella dei materiali ).
- Duplicare singole colonie in un nuovo pozzetto 96 e crescere fino al confluenza del 100%.
- Rimuovere i supporti da un insieme dei cloni, aNd risospendere le cellule in 30 μL di tampone di estrazione dal kit. Trasferire in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml pulito.
- Scaldare la soluzione a 96 ° C per 15 minuti e lasciar raffreddare a temperatura ambiente.
- Aggiungere 30 μL di buffer di stabilizzazione dal kit. Mescolare bene.
- Identificare le linee mutanti di wildtype e monoalettico / biallelico mediante colonia PCR.
- Progettare due set separati di primer PCR (per il lato sinistro e destro del locus mirato) per amplificare le regioni attorno alle armi di omologia in base all'integrazione riuscita o non riuscita della cassetta di resistenza ( Figura 2C ). Su ciascun lato, utilizzare un primer comune (rosso) che annee fuori del braccio di omologia. Usalo con un corrispondente primer accoppiato che è complementare alla sequenza endogena, che attraversa la regione di omologia (blu), per testare l'allele selvatico. Utilizzare un altro primer accoppiato, complementare alla cassetta di resistenza inserita (vedere primer nella sezione2.3), per verificare la mutazione desiderata.
- (Consigliato) Convalida i set di primer utilizzando lysate di cella dalla popolazione di celle di massa bulgara selezionata, poiché contengono una miscela sia di WT che di alleli mutanti ( Figura 2D ).
- Preparare la seguente miscela di reazione:
Lysato cellulare 0,5 μL Buffer 10x KOD 1,25 μL 25 mM di MgSO4 0,75 μL 2 mM dNTPs 1,25 μL 10 μM Primer avanti 0,375 μL 10 μM primer inverso 0,375 μL KOD polimerasi 0,25 μL acqua 7,75 μL - Utilizzare le seguenti condizioni del termociclista: 95 ° C per 2 minuti, (95 ° C per 20 s, Primer Tm per 10 s, 70 ° C per 20 s / kb) ripetere per 25 cicli.
- Visualizzare il prodotto PCR mediante elettroforesi a base di agarosio.
- Ripetere il collaudo PCR per ciascun lato dell'integrazione prevista. Selezionare ed espandere i candidati che mostrano la presenza di integrazione e nessun prodotto di sequenza endogeno per la regione eliminata.
- Validare i candidati positivi con blot western e / o RT-qPCR.
- Raccogliere il lisato cellulare utilizzando un kit di preparazione del DNA (vedi tabella dei materiali ).
8. Verificare la mutazione genomica mediante sequenziamento
- Isolare il DNA genomico dalle linee cellulari mutanti mediante estrazione di cloroformio fenolico 31 .
- PCR amplificare la regione target sgRNA, utilizzando primer con overhangs da 5 'che aggiungono siti di restrizione BsaI ad ogni estremità.
NOTA: Per i cloni modificati con HDR, dove entrambi gli alleli possono essere identici, il prodotto PCR può essere sequenziato direttamente. - Clonare la regione amplificata in pUC19-BsaI mediante clonazione Golden Gate.
- Trasformare la miscela di reazione in un ceppo E. coli competente.
- Miniprep plasmide DNA da 6-10 singole colonie e sequenza della regione clonata mediante sequenziamento di Sanger.
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Representative Results
Per la generazione di linee di eliminazione ELAVL1, è stato disponibile un anticorpo robusto, in modo da eseguire la modifica usando sgRNA singoli ( figura 1A , sinistra), seguita da immunoblot dot. Tre sgRNAs sono stati trasfettati in modo indipendente per confrontare efficienze e per escludere gli effetti target nei cloni risultanti. Dopo aver raccolto e blottato i lisati delle cellule dalle popolazioni clonali su due membrane di nitrocellulosa, le macchie sono state analizzate sia per ELAVL1 che PUM2 (come controllo di normalizzazione) ( Figura 2A ). Il rapporto quantificato del segnale ELAVL1 al PUM2 ha dimostrato un intervallo molto ampio,> 10 4, tra le righe isolate ( figura 2B ). Utilizzando questo rapporto come criterio di selezione, abbiamo convalidato una serie di righe usando blot western ELAVL1 ( Figura 3A ). Nella maggior parte dei casi, le popolazioni clonali con il relativo segnale ELAVL1 più basso eranoCorrettamente identificati come sconfitte ( Figura 2B ), confermando la potenza predittiva di questa quantificazione (nonostante la notevole variabilità del segnale di controllo, probabilmente causata da diversi numeri di cellule raccolte). Al contrario, la maggior parte dei cloni con proporzioni intermedie ha mostrato il segnale ELAVL1 dopo la convalida, potenzialmente rappresentando eventi di eliminazione monoalchilari. Tuttavia, non è stata osservata alcuna classificazione generale dei rapporti in WT, monoalettico e pieno (biallelico) mutanti, e anche i cloni ELAVL1-positivi hanno mostrato un'ampia gamma di livelli continui, probabilmente dovuti alla variabilità clonale dell'espressione. L'efficacia complessiva della generazione di knockout ELAVL1 utilizzando questo metodo variava dal 6 al 36% tra i sgRNAs.
Per altri obiettivi genetici (come PUM2), la qualità degli anticorpi disponibili impedisce una precisa screening dei cloni candidati mediante macchia a punti a causa di un elevato background di cross-reactiVITY. Inoltre, l'efficacia del targeting di alcuni loci genomici può essere sostanzialmente inferiore a causa dell'accessibilità della cromatina. In questi casi, un metodo dipendente dalla selezione è appropriato per aumentare l'efficienza. Due sgRNAs che mirano a regioni di codifica precoce e tardiva di PUM2 sono state co-trasfettate con un template di riparazione diretto da omologia per accise 45 kb del DNA genomico e sostituirlo con una cassetta di resistenza alla neomicina ( Figura 1A , a destra). L'assemblaggio del modello di omologia è illustrato nella figura 1B . I primer PCR sono stati progettati per amplificare le regioni attorno alle armi di omologia in base all'integrazione di successo della cassetta di resistenza ( fig. 2C ) oa successo ( Figura 2C ) e sono state testate sulle cellule selezionate e non selezionate (pannello sinistro). Come previsto, in cellule non trasfettate, solo un amplicon corrispondente allo stato endogeno (top) è stato osservato, mentre le celle selezionate di massa mostravano ampliconi da entrambiSelvatici e allele mutanti. I lisati delle cellule dai candidati clonal generati sono stati raccolti e sottoposti a screening per la presenza sia della sequenza endogena che della cassetta di resistenza. I colpi candidati sono stati identificati dalla presenza dell'amplicone della cassetta di resistenza da solo, indicando la delezione / integrazione bialettica ( figura 2D , stelle). Sono stati osservati anche cloni con inserti monoalcani e sono stati abbastanza comuni, in quanto tali popolazioni possono sopravvivere anche al processo di selezione. Questi cloni sono stati indicati dalla presenza sia della sequenza endogena che della cassetta di resistenza. In alcuni casi, sono stati osservati anche wildtypes clonali presso il locus sperimentato, suggerendo che l'integrazione genomica casuale, non sgRNA, del template di riparazione diretta da omologia si verifica a bassa frequenza. Le linee mutanti bialleliche sono state ulteriormente convalidate da una macchia Western ( Figura 3B ). L'efficienza complessiva della generazione di knockout usando la procedura HDR era 33%.
Figura 1: Un flusso di lavoro per la generazione di bersagli mediati da CRISPR nelle linee cellulari di mammiferi. ( A ) Gli eventi di editing genomico prodotti dalla scissione CRISPR / Cas9 e NHEJ (a sinistra) o HDR (destra). Il sito della scissione di Cas9 è indicato da una linea bianca verticale. ( B ) Componenti e montaggio del plasmide del modello HDR. Gli enzimi di restrizione di tipo II utilizzati nella clonazione di Golden Gate, come BsaI, riconoscono una sequenza asimmetrica del DNA e lasciano un taglio sfalsato all'esterno della sequenza di riconoscimento, consentendo la progettazione di segmenti sovrapposti arbitrari per l'assemblaggio (nella foto). Le frecce indicano le posizioni del primer per controllare il corretto montaggio del plasmide. ( C ) Flusso di lavoro: dopo la trasfezione (e la selezione di farmaci, se applicabile), le cellule vengono placcate a diluizioni limitanti in piastre a 96 pozzetti. Popolazioni clonaliSono sottoposti a screening mediante immunoblot dot (indipendente dalla selezione, NHEJ) o colonia PCR (dipendente dalla selezione, HDR). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Linee di eliminazione dei candidati di screening da macchie dot o PCR colonia. ( A ) Dot immunoblot di cloni ELAVL1 mirati con ELAVL1 anticorpo (a sinistra) e separatamente con un anticorpo per una proteina di controllo Pum2 (a destra). I cloni che hanno mostrato un piccolo segnale di controllo, probabilmente dovuti a basse quantità di proteine di ingresso, sono contrassegnate da una X e escluse dall'analisi ulteriore. I cloni con basso segnale ELAVL1 (cerchi) sono stati ulteriormente testati da blot western che ha confermato (verde) o invalidato (grigio) i candidati. ( B ) Quantificazione di KO cAndidates da macchia dot. Rapporti di ELAVL1 per controllare il segnale proteico nella macchia puntale mostrata in A, in ordine crescente. ( C ) Design primer per test di eliminazione / inserimento tramite colonia PCR. Un primer complementare alla locomina genomica al di fuori della regione del braccio di omologia (rosso) è abbinato a un primer complementare alla sequenza endogena (blu) o alla cassetta di resistenza (verde), sondando lo stato non modificato o un evento di eliminazione / inserimento , Rispettivamente. Le coppie di primer separate sono progettate per testare entrambi i lati dell'integrazione. ( D ) Esempio di gel agarosico dei risultati della PCR colonia usando primers che attraversano la giunzione di integrazione a monte utilizzando primer interni endogeni (top) e knockout all'interno dei primer (in basso). I primer vengono prima convalidati sia nelle cellule parentali T-REx293 che nelle celle selezionate in massa (a sinistra). Cloni candidati individuali (medio) e modelli di banda previsti per cloni WT, KO e delezione monoalchilica (WT / KO) (a destra). Sono indicati i cloni bi-elicoticiD di una stella. I prodotti di amplificazione corretti sono indicati da frecce nere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Validazione dei candidati di eliminazione da parte di Western blot. ( A ) Western blot per ELAVL1 (superiore) di un sottoinsieme di cloni identificati con macchia dot. PUM2 è stato blottato sulla stessa membrana come un controllo di carico (in basso). ( B ) Western blot per PUM2 (top) di un sottoinsieme di cloni identificati da colonia PCR. GAPDH è stato blottato sulla stessa membrana come un controllo del carico (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il sistema CRISPR / Cas9 ha permesso un'efficace generazione di modifiche genomiche stabili, che forniscono un'alternativa più coerente ad altri metodi di manipolazione transitoria. Ecco, abbiamo presentato due metodi per la rapida identificazione dei colpi di origine CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari di mammiferi. Entrambi i metodi richiedono un piccolo materiale cellulare, pertanto i test possono essere eseguiti nelle fasi iniziali della coltura clonale, risparmiando tempo e reagenti. Per aumentare l'efficienza di entrambi i metodi, si consiglia di testare più sgRNA, poiché le efficienze variano a seconda della sequenza e della posizione genomica. Inoltre, l'utilizzo di più sgRNA è utile per identificare gli effetti off-target rilevando fenotipi outlier come risultato di mutazioni nei geni non mirati. La transfezione efficace e la scissione di Cas9 aumentano notevolmente le probabilità di generare bocce. In alternativa, trasfettare le cellule direttamente con i complessi di ribonucleoproteina sgRNA / Cas9 ricavati in commercio 32 ,33 può accelerare il protocollo e ridurre gli effetti fuori bersaglio.
Le macchie di punti sono adatte per valutare i colpi di proteine causati dalle piccole alterazioni genomiche dovute a NHEJ. Poiché è necessario un solo costrutto sgRNA / Cas9, questo approccio può essere il più veloce nell'ottenimento di linee nullo e la procedura di blottatura evita ulteriori passi, accelerando lo screening. Il segnale di proteine immunoblot normalizzato serve come predittivo affidabile della validazione di successo ( Figura 2B ). Questo protocollo è ideale per la generazione di eliminazioni con minima perturbazione genomica. In alternativa, questo metodo di screening può essere adattato alla sonda per l'aggiunta o la modifica di proteine, ad esempio proteine transgeniche o tag proteine. Tuttavia, questo metodo di screening richiede un anticorpo con elevata specificità alla proteina di interesse, in quanto la reattività trasversale porta ad alto livello di sfondo nelle macchie dot. Questo metodo è naturalmente limitato a targeting delle mutazioniRegioni di codifica delle proteine, in quanto l'output finale dipende dalla presenza / assenza di un prodotto proteico. È importante notare anche che le mutazioni causate da NHEJ possono portare a una varietà di risultati proteici, tra cui una proteina con funzione negativa costitutivamente attiva, parziale o dominante o una proteina funzionale priva dell'epidoto anticorpale. Per ridurre al minimo questi problemi, è utile posizionare il taglio Cas9 prima possibile nella regione di codifica, per aumentare le probabilità di generare una proteina completamente non funzionale. Inoltre, il targeting di regioni genomiche meno accessibili ai macchinari Cas9 può produrre scarse rese di delezione in assenza di selezione. Infine, i calcoli che conferiscono uno svantaggio selettivo possono essere difficili da ottenere con questo metodo per ragioni analoghe.
L'utilizzo di meccanismi di riparazione orientati all'omologia e la scissione CRISPR / Cas9 consentono manipolazioni genomiche molto più grandi e più specifiche, che possono includere sia laDelimitazioni di scala rge (delineate da due scissioni di sgRNA) e inserzioni. Dal momento che due eventi di scissione e un preciso processo di riparazione devono avvenire, l'integrazione di un marcatore di resistenza al farmaco aumenta notevolmente i rendimenti di eliminazione mediante questo metodo. Sebbene possa essere utilizzato anche il rilevamento di macchie a macchia, la screening con colonia PCR è più generalmente applicabile per accertare con precisione i candidati di integrazione / eliminazione corretti con tali perturbazioni genomiche di grandi dimensioni. Inoltre, la sperimentazione mediante PCR permette l'identificazione di cloni con integrazioni imperfette e incomplete, che possono fornire informazioni sulla portata e la natura del processo HDR stesso. Inoltre, il marcatore introdotto può essere successivamente rimosso (mediante espressione transiente di Cre o aggiunta in forma permeabile a membrana), lasciando una minima scaricazione 34 bp (sito loxP) e consentendo il futuro riutilizzo del marcatore di selezione. La flessibilità di questo approccio aumenta con l'uso di marcatori di resistenza multipli, consentendo la generazione di più cumuProteine di proteine lative. È importante quando si applica questo metodo che l'assenza di prodotto viene ulteriormente convalidata, ad esempio da RT-qPCR della trascrizione prevista. Poiché questa schermata può essere indipendente da anticorpi, questo metodo è facilmente applicato alle proteine senza un anticorpo robusto, oltre che per individuare i cambiamenti che non cadono nei geni di codifica delle proteine.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere Gissell Sanchez, Megan Lee e Jason Estep per l'assistenza sperimentale, e Weifeng Gu e Xuemei Chen per la condivisione di reagenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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