Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55903
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

Summary

التطورات الحديثة في القدرة على التلاعب وراثيا خطوط الخلايا الجسدية تنطوي على إمكانات كبيرة للبحوث الأساسية والتطبيقية. هنا، نقدم نهجين ل كريسبر / Cas9 ولدت إنتاج خروج المغلوب وفحص في خطوط الخلايا الثدييات، مع وبدون استخدام علامات للاختيار.

Abstract

وقد أحدث نظام هندسة الجينوم كريسبر / Cas9 ثورة في علم الأحياء من خلال السماح بالتحرير الدقيق للجينوم مع القليل من الجهد. يسترشد دليل واحد الحمض النووي الريبي (سغرنا) التي تمنح خصوصية، البروتين Cas9 ينسج كلا من خيوط الحمض النووي في المكان المستهدف. يمكن أن يؤدي دنا كسر إما غير متماثلة نهاية الانضمام (نهيج) أو التماثل الموجهة إصلاح (هر). يمكن أن نيج إدخال الحذف الصغيرة أو الإدراج التي تؤدي إلى الطفرات التحول الإطار، في حين أن تقرير التنمية البشرية يسمح للاضطرابات أكبر وأكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد خطوط الخلايا خروج المغلوب من خلال اقتران أسس أساليب كريسبر / Cas9 مع خيارين لاختيار / المصب المصب. نهج نهيج يستخدم واحد سغرنا قطع الموقع واختيار مستقل الفرز، حيث يتم تقييم إنتاج البروتين من قبل نقطة إمونوبلوت بطريقة عالية الإنتاجية. يستخدم نهج تقرير التنمية البشرية اثنين من المواقع سغرنا قطع التي تمتد الجين من الفائدة. جنبا إلى جنب مع قالب هر المتاحة، يمكن لهذه الطريقة تحقيق الحذفمن عشرات كيلو بايت، بمساعدة من علامة المقاومة للاختيار المدرجة. وتناقش التطبيقات والمزايا المناسبة لكل طريقة.

Introduction

وتوفر التعديلات الوراثية المستقرة ميزة على الطرق العابرة للاضطرابات الخلوية، التي يمكن أن تكون متغيرة في كفاءتها ومدتها. أصبح التحرير الجينومي شائعا على نحو متزايد في السنوات الأخيرة بسبب تطور نوكليسيس محددة الهدف، مثل نوكليسيس الزنك الاصبع 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، النسخ المنشط مثل نوكليسيس المستجيب (تالينس) 6 ، 7 ، 8 ، 9 و نوكليسيس الموجهة من الحمض النووي الريبي المستمدة من متفاوتة، متداخلة بانتظام يتكرر متناوب قصيرة (كريسبر) النظام 10 .

يتم تعديل آلات التحرير كريسبر / Cas9 من جهاز المناعة التي البكتيريا واستخدام الحفريات للدفاع ضد العدوى الفيروسيةأس = "كريف"> 11 ، 12 ، 13 . في هذه العملية، يتم دمج قصيرة، 20-30 نت أجزاء من تسلسل الفيروسية الغازية في مكان الجينومية كما "الفواصل" يحيط بها وحدات تكرار 14 ، 15 . النسخ اللاحق وتجهيز الحمض النووي الريبي يولد الرنا الصغيرة المرتبطة كريسبر 16 (كرناس) أنه، جنبا إلى جنب مع الحمض الريبي النووي النقال عبر تفعيل 17 (تراكرنا)، والتجمع مع المستجيب إندوسلياز كاس 9. وبالتالي فإن الحمض الريبي النووي النووي توفر خصوصية لاستهداف Cas9، وتوجيه المجمع لتسلسل تسلسل الحمض النووي الفيروسي التكميلي ومنع المزيد من الإصابات 18 ، 19 . أي تسلسل "بروتسباسر" في الحمض النووي المستهدف يمكن أن تكون بمثابة مصدر للحمض الريبي النووي الذواب، طالما أنها مباشرة 5 'إلى بروتسباسر قصيرة عزر المجاورة (بام)، نغ في حالة S. القيثريات Cas9 21 .

عند التعبير عن Cas9 و سغرنا في خلايا حقيقيات النواة، البروتين Cas9 ينسج كلا من خيوط الحمض النووي في الموضع المستهدف. في غياب منطقة مناسبة من تسلسل مثلي، الخلية بإصلاح هذا كسر عبر غير متماثلة نهاية الانضمام (نهيج) 22 ، 23 ، 24 ، والتي عادة ما يقدم الحذف الصغيرة أو، نادرا، والإدراج. عند استهداف فتحإطار القراءة، والإصلاح المرجح أن يؤدي إلى فرامشيفت متعدية التي تنتج منتج البروتين غير وظيفية. في المقابل، عندما قدمت مع قالب خارجي مع مناطق واسعة من التماثل، والخلية قد إصلاح كسر مزدوج حبلا عن طريق التماثل الموجه إصلاح 25 ، 26 . هذا الطريق يسمح لحذف دقيقة أكبر، واستبدال أو الإدراج في الجينوم، إلى جانب إدخال علامات اختيار قابلة للإعجاب 27 .

هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد خطوط الخلايا خروج المغلوب من قبل أي من هذين الأسلوبين كريسبر / Cas9 ( الشكل 1A ). نهج نهيج يستخدم واحد سغرنا قطع الموقع واختيار الاختيار المستقل، وبالتالي يتطلب إعداد مقدما قليلا. عند استخدام هذا الأسلوب، دليل رنا مكملة ل إكسونس بالقرب من نهاية 5 'من النص، والتي من المرجح أن تنتج خروج المغلوب، يجب أن تصمم. منذ موديفيكاتالأيونات إلى الجينوم في هذه الحالة هي صغيرة، ويستند فحص لاستنساخ خروج المغلوب على البقع نقطة، حيث يتم تقييم المنتج البروتين بطريقة عالية الإنتاجية. نحن نستخدم الجيل من 1-بروتين (ELAVL1) خطوط خروج المغلوب إيلاف كمثال على ذلك. النهج الثاني يعتمد على التماثل الموجه إصلاح (هر) ويستخدم اثنين من سغرنا قطع المواقع التي تمتد الجين أو المنطقة من الفائدة، مما يسمح لحذف عشرات من كيلو بايت. A البلازميد مع منطقتين من التماثل التي تحيط مواقع الانقسام يوفر قالب بديل ( الشكل 1B )، وإدخال علامة المقاومة للاختيار الذي يزيد من كفاءة توليد خروج المغلوب. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لإدخال تعديلات الجينات مع الأسلحة التماثل مصممة بشكل صحيح. في هذه الحالة، ودمج جزء جديد من الحمض النووي يسمح لفحص ير القائم ( الشكل 1C ). هنا، ونحن نستخدم جيل من أفراد الأسرة بميليو رنا ملزمة ملزمة 2 (PUM2) خطوط خروج المغلوب كمثال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد مناطق التماثل حول الحذف المطلوب

ملاحظة: ضروري فقط في حالة استخدام التحرير القائم على التحديد.

  1. حدد منطقتين، في البداية 1.5-2 كيلو بايت، على جانبي المكان الحذف المطلوب، والتي سوف تكون بمثابة الأسلحة التماثل في قالب هر ( الشكل 1A ). تحديد المناطق التي تفتقر بسيي مواقع الاعتراف على أي من حبلا (غتكتك) لتسهيل الاستنساخ. إذا كانت مواقع بساي لا مفر منها، استخدم نوع انزيم مقيد من نوع بديل (بسمبي، سابي، ببسي) وعدل المواقع المقابلة في البلازميد المستلم (pUC19-بساي)، بلاسميد المانح للعلامة المقاومة (بولدن-نيو أو بولدن-هيغرو)، و التماثل الذراع ير المنتج يتدلى.

2. جيل من Cas9-سغرنا التعبير البلازميدات

  1. تحديد موقع (مواقع) الاستهداف للطفرات. لطريقة قطع واحدة، وخالية من الاختيار، الهدف 5 'إكسونس الترميز القريبة لزيادة احتمال عدم فوطفرة وظيفية. بالنسبة لطريقة قطعتين، حدد اثنين من المواقع التي تمتد على قدر كبير من الجين حسب الضرورة.
    ملاحظة: في تجربتنا، يتم إنشاء حذف ما يصل إلى 53 كيلو بايت بكفاءة.
  2. المدخلات 200 إلى 300 نقطة أساس من تسلسل المنطقة المستهدفة في أداة تصميم crispr.mit.edu. للاستنساخ القائم على الاختيار، واستخدام 200-300 نقطة أساس من مناطق التماثل التي تم تحديدها القريبة من لوكوس الحذف ( الشكل 1A ). حدد 2-3 من سغرناس أعلى مرتبة في المنطقة المستهدفة لحساب الاختلافات في نشاطهم، وعزل الحيوانات المستنسخة مستقلة التي لا تشترك في نفس الآثار المحتملة خارج الهدف.
  3. لتصميم أوليغونوكلأوتيدس دوبلكس مع المتراكمة المناسبة لإدراج في البلازميد التعبير، حذف تسلسل بام نهاية (نغ) وإلحاق 5-كاسك المتراكمة تليها G إلى الأعلى حبلا أوليغو. بالنسبة للحصان السفلي قليلا، إلحاق 5-آاك المتراكمة إلى تسلسل الهدف تكملة العكسي، تليها 3'-C، كما إيلمرهف أدناه:
    تسلسل 1
  4. إدراج أوليغونوكلأوتيدس الاصطناعية المقابلة ل سغرناس في البلازميد pSpCas9 (بب) باستخدام غولدن غيت الاستنساخ 28 كما هو موضح في بروتوكول مختبر تشانغ 29 .

3. الجيل من قالب إصلاح التماثل الموجهة البلازميدات

ملاحظة: ضروري فقط في حالة استخدام التحرير القائم على التحديد. يتكون قالب إصلاح التماثل الموجهة البلازميد من كاسيت المقاومة للأدوية يحيط بها منطقتين التي هي مكملة للجينوم خارج المواقع المستهدفة اثنين سغرنا ( الشكل 1B ).

  1. من مناطق التماثل الأوسع المحددة في الخطوة 1.1، حدد 800-1،000 بب 26 لا أكثر من 5-10 نقطة أساس بعيدا عن مواقع قطع Cas9 تصميم، لتكون بمثابة الأسلحة التماثل ( الشكل 1A ). تأكد من عدم تضمين سغرناموقع الهدف و بام في الأسلحة التماثل، وهذا سوف يسبب كريسبر / Cas9 الانقسام من البلازميد قالب نفسها. إذا كانت الأسلحة التماثل لا تحتوي على مواقع بسي الداخلي، واستخدام مواقع سغرنا بديلة.
  2. ير تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي الجيني باستخدام عالية الدقة الحمض النووي البلمرة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وذلك باستخدام الاشعال إلى الأمام وعكس مع 5 'تسلسل إضافي الذي يدخل مواقع بسي (غتكتك) وتجاوز فريدة من نوعها على طرفي منطقة التماثل. يجب أن تحتوي على متراكب تسلسل المناسبة لتوليد الصحيح ترتيب التجميع والتوجه، كما هو موضح أدناه ( الشكل 1B ):
    اليسار التماثل الذراع فب المتراكمة: 5 'غتكتكا غك
    اليسار الذراع التناظرية رب رباط: 5 'غتكتكت كاسغ
    ذراع التماثل الأيمن فب المتراكمة: 5 'غتكتكا غك
    ذراع التماثل الأيمن رب يتدلى: 5 'غتكتكت كاك
  3. تحقق الأسلحة التماثل ل أمبليف المناسبةعن طريق الهلام الكهربائي قبل المضي قدما.
  4. تجميع اليمين واليسار منطقة التماثل الذراع مع كاسيت المقاومة في قالب البلازمايد هر من قبل غولدن غيت الاستنساخ 28 . استخدام بولدن-نيو أو بولدن-هيغرو البلازميدات 30 كمصدر لأشرطة المقاومة لوكسب-فلانكيد (لوكسب-بك-نيو-با-لوكسب أو لوكسب-بك-هيغ-با-لوكسب). استخدام pUC19-بساي، وتعديل pUC19 مع مواقع بسي في منطقة الاستنساخ متعددة والقضاء على مواقع بسي في أماكن أخرى، والمتجه المتلقي (المتاحة عند الطلب). استخدم نسبة 1: 1: 1: 1 للإدراج الثلاثة والمتجهات.
    1. إعداد خليط التفاعل التالي 30 :
      حق التماثل الذراع ير المنتج 0.06 بمول (30-40ng)
      اليسار التماثل الذراع ير المنتج 0.06 بمول (30-40ng)
      بولدمن-نيو البلازميد (100 نانوغرام / ميكرولتر) 1 &# 181؛ L
      pUC19-بساي البلازميد (100 نانوغرام / ميكرولتر) 1 ميكرولتر
      2X T7 الحمض النووي ليغاز العازلة 5 ميكرولتر
      بساي (10 U / ميكرولتر) 0.75 ميكرولتر
      T7 الحمض النووي ليغاز (3000 U / ميكرولتر) 0.25 ميكرولتر
      ماء تصل إلى 10 ميكرولتر
    2. استخدام المعلمات ثيرمويكلر التالية: 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كرر لمدة 30 دورات.
    3. علاج المنتج الاستنساخ مع إكليوكلياز لكل تعليمات الشركة المصنعة لهضم بعيدا أي الحمض النووي الخطي المتبقية.
    4. تحويل خليط التفاعل إلى سلالة E. القولونية المختصة وفقا للبروتوكول الموردة مع الخلايا، لوحة على الأطباق التي تحتوي على الأمبيسلين.
  5. لتحديد الحيوانات المستنسخة مع التجمع القالب الصحيح، تنفيذ البكتيرياالمستعمرة ير لتضخيم المناطق الفرعية الذراع التماثل من إدراج تجميعها (كما إدراج كله قد تكون كبيرة جدا لتضخيم موثوق بها). استخدام التلميع التمهيدي واحد إلى تسلسل البلازميد المرافقة والتمهيدي الثاني مكمل لحافة كاسيت المقاومة ( الشكل 1B ، تسلسل شائع لكل من نيو و هيغرو إدراج)، وتوليد منتج تعتمد على الجمعية التي هي ما يقرب من 200 نقطة أساس أطول من ذراع التماثل الوارد:
    pUC19-بصال-ليفت: 5 'غكتغتاتغتغغاتغتاغ
    المقاومة-اليسار: 5 'آاغكتكتكاك
    pUC19-بساي-رايت: 5 'غكتاتكاغكتغغا
    المقاومة-اليمين: 5 'آغاكاتاغاغكاتغغ
    1. اختيار المستعمرات البكتيرية مع المسواك العقيمة وتعليق البكتيريا في 20 ميكرولتر المياه. الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتدور باستمرار في الطرد المركزي على الطاولة في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق. مكان فورا على الجليد.
    2. إعداد خليط ير التالية 31 </ سوب>:
      تمييع قالب المستعمرة 1.25 ميكرولتر
      10X العازلة رد فعل طق 1.25 ميكرولتر
      20mM دنتبس 0.25 ميكرولتر
      10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 0.25 ميكرولتر
      10 ميكرومتر عكس التمهيدي 0.25 ميكرولتر
      طاق البلمرة 0.25 ميكرولتر
      ماء 9 ميكرولتر
    3. استخدام المعلمات ثيرمويكلر التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (95 درجة مئوية 30 ثانية، 61 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة / كيلو بايت)، كرر لمدة 25 دورات، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    4. تحقق المنتج ير لحجم أمبليكون الصحيح من قبل الاغاروز الكهربائي هلام.
    5. اختياريا، مينيبريب الحمض النووي البلازميد من المستعمرات الفردية مع الصحيح إدراج حجم وتسلسل ثه المناطق تسلسل بواسطة سانجر التسلسل مع الاشعال التضخيم المذكورة أعلاه.

4. ترنسفكأيشن من مكونات كريسبر في الخلايا المستزرعة

  1. قبل ترنسفكأيشن: ثقافة خلايا T-REx293 في وسائل الاعلام دمم تستكمل مع فبس 10٪ عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
  2. الخلايا لوحة على 6 لوحات جيدا وتنمو إلى ما يقرب من 70٪ كونفلنسي. قم بتضمين بئر للتحكم غير المصرح به.
  3. خلايا ترانسفيكت مع 2.5 ميكروغرام البلازميد الكلي باستخدام بروتوكول ترنسفكأيشن التجارية. في موازاة ذلك، والحفاظ على السيطرة غير مترجمة.
    ملاحظة: طريقة ترنسفكأيشن والكفاءة تختلف تبعا لنوع الخلية. تحديد طريقة ترنسفكأيشن المناسبة للنظام قبل التجربة.
    1. ل ترنسفكأيشن من الخلايا مع التحديد، واستخدام 0.75 ميكروغرام Cas9-سغرنا 1 (قطع اليسار)، 0.75 ميكروغرام Cas9-سغرنا 2 (قطع الحق)، و 1.0 ميكروغرام قالب إعادة التركيب مثلي.
    2. ل ترانسفكتيعلى الخلايا دون اختيار، واستخدام 2.5 ميكروغرام Cas9-سغرنا البلازميد.

5. اختيار المخدرات

  1. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وعلاج الخلايا مع الدواء المناسب (نيوميسين / هيغروميسين). إجراء اختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة غير مترجمة يموت (عادة 3-5 أيام للنيو، 7-14 يوما ل هيغرو).
    ملاحظة: استخدام تركيزات 500 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل لنيوميسين و هيغروميسين، على التوالي ل T-REx293 الخلايا. بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى، قد يكون من المفيد إجراء المعايرة السابقة للدواء على الخلايا غير المصابة لتحديد التركيز الفعال.

6. عزل السكان كلونية

  1. تنمو الخلايا إلى 100٪ كونفلنسي في البئر الأصلي بعد الاختيار. خلايا البذور إلى 96 لوحات جيدا في كثافة 0.33 خلايا لكل بئر.
    ملاحظة: البذر ثلاث لوحات 96 جيدا هو نقطة انطلاق جيدة لضمان عزل أكثر من استنساخ واحد صحيح، ولكن قد تكون هناك حاجة أكثر أو أقل ديبتنتهي على سغرنا وكفاءة هر.
  2. مراقبة المستعمرات على مدى 2-4 أسابيع، حتى المستعمرات مرئية للعين. اختيار المستعمرات مرئية مع طرف ماصة معقمة والبذور في الآبار الجديدة لتشجيع النمو أحادي الطبقة. عند استخدام خلايا التعليق، يمكن استخدام أقل كثافة البذر حتى لضمان نسبة أكبر من آبار مستعمرة واحدة.

7. فحص المرشحين

  1. فحص المرشحين دون استخدام اختيار: نقطة وصمة عار
    1. تنمو الحيوانات المستنسخة الفردية إلى 50-100٪ كونفلنسي. طرد أحادي الطبقة من الخلايا عن طريق بيبتينغ داخل البئر.
    2. قسامة 90 ميكرولتر من إجمالي 100 ميكرولتر الحجم إلى أنبوب ميكروسنتريفوج نظيفة. تدور أسفل في 6000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وإزالة وسائل الإعلام، ويليه خلية بيليه في 10 ميكرولتر من 1X تحلل العازلة أو 1X سدز تحميل العازلة (5X: 250 ملي تريس كل درجة الحموضة 6.8، 8٪ سدز، 0.1٪ بروموفينول الأزرق، 40٪ الجلسرين، 100 ملي دت). إضافة 90 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة إلى ما تبقى من الخلايا في ويلل مواصلة الانتشار.
    3. ماصة 1 ميكرولتر من المحللة الخلية على غشاء نيتروسليلوز الجافة لتشكيل نقطة. لطخة كل عينة مرتين على اثنين من الأغشية منفصلة، ​​وخلق اثنين من أنماط متطابقة من العينات.
    4. منع الأغشية في الحليب 5٪ في تبست (تريس مخزنة المالحة + 0.01٪ توين 20: 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 جرام بوكل، 3 جرام قاعدة تريس، ما يصل إلى 1 لتر الماء المقطر، ودرجة الحموضة 7.4) 31 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ( مع هزاز، هنا وطوال الإجراء).
    5. لطخة باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين المستهدف على غشاء واحد، والجسم المضاد الأساسي لبروتين السيطرة (توبولين، غابد، أو أي بروتين آخر لا يتوقع أن تتغير) من جهة أخرى. استخدام التخفيف الأساسي الأجسام المضادة الأولية (0.2 ميكروغرام / مل ل ELAVL1 و 0.1 ميكروغرام / مل ل Pum2 في هذه الحالة) في تبست + 5٪ الحليب. احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. يغسل 3 مرات مع تبست لمدة 5 دقائق.
    7. احتضان كل غشاء مع الأجسام المضادة الثانوية هرب مترافق المناسب في Tبست + 5٪ حليب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    8. يغسل 3 مرات مع تبست لمدة 5 دقائق.
    9. تطبيق حل الركيزة التوهج (انظر الجدول المواد) التالية تعليمات الشركة المصنعة وصورة الغشاء النشاف على تصوير كيميائي الرقمية.
    10. تحديد كثافة شدة لبروتينات الهدف والسيطرة باستخدام البرنامج المناسب.
    11. القضاء على المرشحين مع انخفاض إشارة البروتين السيطرة، وحساب نسب تطرح الخلفية من الهدف للسيطرة على شدة البروتين للمرشحين المتبقية. حدد المرشحين مع أدنى نسب للمرور ومزيد من التحقق من صحة من قبل لطخة غربية.
  2. فرز المرشحين مع استخدام اختيار: مستعمرة ير
    1. جمع الخلية المحللة باستخدام مجموعة الإعدادية دنا (انظر الجدول المواد ).
      1. تكرار المستعمرات الفردية في 96 بئر جديدة وتنمو حتى 100٪ كونفلنسي.
      2. إزالة وسائل الإعلام من مجموعة واحدة من الحيوانات المستنسخة، أو ريسوسبيند الخلايا في 30 ميكرولتر من العازلة استخراج من عدة. نقل إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل نظيفة.
      3. تسخين الحل إلى 96 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
      4. إضافة 30 ميكرولتر من العازلة الاستقرار من عدة. اخلط جيدا.
    2. تحديد ويلديب و مونوالليك / بياليليك خطوط متحولة من قبل مستعمرة ير.
      1. تصميم مجموعتين منفصلتين من الاشعال ير (للجانب الأيسر والأيمن من الموضع المستهدف) لتضخيم المناطق حول الأسلحة التماثل على أساس إما ناجحة أو غير ناجحة التكامل كاسيت المقاومة ( الشكل 2C ). على كل جانب، استخدم التمهيدي المشترك (الأحمر) أن يلد خارج ذراع التماثل. استخدامه مع التمهيدي اقتران المقابلة التي هي مكملة للتسلسل الذاتية، التي تمتد منطقة التماثل (الأزرق)، لاختبار أليل من نوع البرية. استخدام التمهيدي اقتران آخر، مكملة ل كاسيت المقاومة إدراج (انظر الاشعال في القسم2.3)، لاختبار الطفرة المطلوبة.
      2. (مستحسن) التحقق من صحة مجموعات التمهيدي باستخدام المحللة الخلية من السكان الخلية السائبة اختيار الأصلي، لأنها سوف تحتوي على خليط من كلا وت الأليلات متحولة ( الشكل 2D ).
      3. إعداد خليط التفاعل التالي:
        خلية المحللة 0.5 ميكرولتر
        10x كود العازلة 1.25 ميكرولتر
        25mM MgSO4 0.75 ميكرولتر
        2 مل دنتبس 1.25 ميكرولتر
        10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 0.375 ميكرولتر
        10 ميكرومتر عكس التمهيدي 0.375 ميكرولتر
        البلمرة كود 0.25 ميكرولتر
        ماء 7.75 ميكرولتر
      4. استخدام الظروف ثيرمويكلر التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، (95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، تم التمهيدي لمدة 10 ثانية، 70 درجة مئوية لمدة 20 ثانية / كيلو بايت) كرر لمدة 25 دورات.
      5. تصور المنتج ير من قبل الاغاروز الكهربائي هلام.
    3. كرر اختبار ير مستعمرة لكل جانب من التكامل المتوقع. تحديد وتوسيع المرشحين التي تظهر وجود التكامل وليس منتج تسلسل الذاتية للمنطقة المحذوفة.
    4. التحقق من صحة المرشحين إيجابية من قبل لطخة غربية و / أو رت-قر.

8. تحقق من طفرة الجينوم بواسطة التسلسل

  1. عزل الحمض النووي الجيني من خطوط الخلايا متحولة عن طريق الفينول استخراج الكلوروفورم 31 .
  2. ير تضخيم المنطقة المستهدفة سغرنا، وذلك باستخدام الاشعال مع 5 'المتراكمة التي تضيف بساي تقييد المواقع إلى كل نهاية.
    ملاحظة: بالنسبة لاستنساخ تحريرها مع تقرير التنمية البشرية، حيث كلا الأليلات قد تكون متطابقة، يمكن تسلسل ير المنتج مباشرة.
  3. استنساخ المنطقة تضخيمها في pUC19-بساي بواسطة الاستنساخ غولدن غيت.
  4. تحويل خليط التفاعل إلى سلالة E. القولونية المختصة.
  5. مينيبريب دنا البلازميد من 6-10 المستعمرات الفردية وتسلسل المنطقة المستنسخة من قبل سانجر التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوليد خطوط خروج المغلوب ELAVL1، كان الأجسام المضادة قوية المتاحة، لذلك تم إجراء تحرير باستخدام سغرناس واحد ( الشكل 1A ، يسار)، تليها نقطة إمونوبلوت. تم ترانزفكتد ثلاث سغرناس بشكل مستقل لمقارنة الكفاءة واستبعاد الآثار المستهدفة في الحيوانات المستنسخة الناتجة. بعد جمع ونشاف الليسيات الخلية من السكان النسيلي على اثنين من الأغشية النتروسليلوز، تم البحث عن البقع لكلا ELAVL1 و PUM2 (كتحكم التطبيع) ( الشكل 2A ). أظهرت نسبة كميا من ELAVL1 إلى PUM2 إشارة واسعة جدا،> 10 4- أضعاف مجموعة بين خطوط معزولة ( الشكل 2B ). باستخدام هذه النسبة كمعيار الاختيار، ونحن التحقق من صحة عدد من الخطوط باستخدام ELAVL1 البقع الغربية ( الشكل 3A ). في معظم الحالات، كان السكان نسلي مع أدنى إشارة ELAVL1 النسبية( الشكل 2B )، مما يؤكد القدرة التنبؤية لهذا الكمي (على الرغم من التباين الكبير في إشارة التحكم، والتي من المحتمل أن تنشأ من اختلاف أعداد الخلايا التي تم جمعها). على العكس من ذلك، فإن معظم الحيوانات المستنسخة مع نسب وسيطة عرضت إشارة ELAVL1 على التحقق من الصحة، وربما تمثل أحداث الحذف مونوالليك. ومع ذلك، لم يلاحظ أي مستويات عامة من النسب إلى وت، مونوالليك والكامل (بياليليك) برك متحولة، وحتى استنساخ ELAVL1 إيجابية عرض مجموعة واسعة ومستمرة من المستويات، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تقلب نسلي التعبير. وقد تراوحت فعالية الشاملة للجيل خروج المغلوب ELAVL1 باستخدام هذه الطريقة من 6 إلى 36٪ بين سغرناس.

لأهداف الجينات الأخرى (مثل PUM2)، ونوعية الأجسام المضادة المتاحة يمنع فحص دقيق من استنساخ المرشحة من قبل نقطة لطخة بسبب خلفية عالية من عبر رد الفعلvity. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة استهداف بعض المواقع الجينومية قد تكون أقل بكثير بسبب الوصول الكروماتين. وفي مثل هذه الحالات، تكون الطريقة المعتمدة على الاختيار مناسبة لزيادة الكفاءة. اثنين من سغرناس استهداف مناطق الترميز في وقت مبكر وأواخر من PUM2 كوترانزفكتد مع قالب إصلاح الموجهة تناظرية من أجل استئصال 45 كيلو بايت من الحمض النووي الجيني واستبدالها مع كاسيت المقاومة النيوميسين ( الشكل 1A ، والحق). ويوضح الجمعية من قالب التماثل في الشكل 1B . تم تصميم الاشعال ير لتضخيم المناطق حول الأسلحة التماثل على أساس إما ناجحة أو غير ناجحة التكامل كاسيت المقاومة ( الشكل 2C )، وتم اختبارها على ونترانسفكتد والخلايا المختارة الأكبر (اللوحة اليسرى). كما هو متوقع، في الخلايا غير مترجمة، لوحظ فقط أمبليكون المقابلة للدولة الذاتية (أعلى)، في حين أن الخلايا المختارة الأكبر أظهرت أمبليكونس من كل منالبرية من نوع والأليلات متحولة. تم جمع الخلايا المحللة من المرشحين نسلي ولدت وفحصها لوجود كل من تسلسل الذاتية ومقاومة كاسيت. تم التعرف على خروج المغلوب المرشحين من خلال وجود أمبليكون كاسيت المقاومة وحدها، مشيرا إلى بياليليك الحذف / التكامل ( الشكل 2D ، والنجوم). وقد لوحظ أيضا استنساخ مع الإدراج مونوالليك، وكانت شائعة إلى حد ما، لأن هؤلاء السكان يمكن أيضا البقاء على قيد الحياة عملية الاختيار. وقد أشارت هذه الحيوانات المستنسخة من قبل وجود كل من تسلسل الذاتية ومقاومة كاسيت. في حالات قليلة، لوحظت ويلديبيس نسلي في موضع اختبار أيضا، مما يشير إلى أن التكامل الجينومي غير سغرنا بمساعدة عشوائية من قالب إصلاح الموجهة تناظر يحدث في تردد منخفض. تم التحقق من صحة خطوط متحولة بياليليك من قبل لطخة غربية ( الشكل 3B ). وكانت الكفاءة الكلية لتوليد خروج المغلوب باستخدام الإجراء هر 33٪.

شكل 1
الشكل 1: سير العمل لتوليد كروسر بوساطة نوكوتس في خطوط الخلايا الثدييات. ( A ) الأحداث التحرير الجينوم التي تنتجها كريسبر / Cas9 الانقسام و نهيج (يسار) أو هر (يمين). يشار إلى موقع الانقسام Cas9 من قبل خط عمودي أبيض. ( B ) مكونات وتجميع البلازميد قالب هر. وتعرف الإنزيمات المقيدة من نوع إيس المستخدمة في الاستنساخ غولدن غيت، مثل بساي، على تسلسل الحمض النووي غير المتماثلة وترك قطع متداخلة خارج تسلسل الاعتراف، مما يسمح لتصميم شرائح متداخلة تعسفية للتجميع (في الصورة). السهام تشير إلى مواقف التمهيدي للتحقق من التجمع البلازميد الصحيح. ( C ) سير العمل: بعد ترنسفكأيشن (واختيار المخدرات إن وجدت)، يتم مطلي الخلايا في الحد من التخفيفات في لوحات 96-جيدا. السكان النسيلييتم فحص إما عن طريق نقطة إمونوبلوت (اختيار مستقل، نهيج) أو مستعمرة ير (تعتمد على الاختيار، تقرير التنمية البشرية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: فحص خطوط خروج المغلوب مرشح من قبل نقطة البقع أو مستعمرة ير. ( A ) نقطة إمونوبلوت من استنساخ ELAVL1 مستهدفة مع الأجسام المضادة ELAVL1 معزولة (يسار)، وبشكل منفصل مع الأجسام المضادة لبروتين السيطرة، Pum2 (يمين). المستنسخات التي تظهر إشارة التحكم قليلا، ويرجع ذلك على الأرجح إلى انخفاض كميات البروتينات المدخلات، يتم وضع علامة مع X واستبعادها من مزيد من التحليل. تم اختبار الحيوانات المستنسخة ذات إشارة ELAVL1 المنخفضة (الدوائر) بشكل أكبر من خلال البقع الغربية التي أكدت (الأخضر) أو إبطال (الرمادي) المرشحين. ( ب ) الكمي من كو cأنديديتس من نقطة لطخة. نسب ELAVL1 للسيطرة على إشارة البروتين في لطخة نقطة هو مبين في A، في زيادة النظام. ( C ) تصميم التمهيدي لاختبار خروج المغلوب / الإدراج عبر مستعمرة ير. يتم إقران التمهيدي المكمل للمكان الجيني خارج منطقة الذراع التماثل (الأحمر) مع التمهيدي مكمل للتسلسل الداخلي (الأزرق) أو كاسيت المقاومة (الأخضر)، التحقيق في حالة غير محررة، أو حدث الحذف / الإدراج ، على التوالي. تم تصميم أزواج التمهيدي منفصلة لاختبار كلا الجانبين من التكامل. ( D ) مثال أغاروس هلام مستعمرة نتائج ير باستخدام الاشعال التي تمتد تقاطع التكامل المنبع باستخدام الداخلية داخل الاشعال (أعلى) و خروج المغلوب داخل الاشعال (القاع). يتم التحقق من صحة الاشعال أولا في كل من الوالدين T-REx293 الخلايا والخلايا التي تم اختيارها السائبة (يسار). استنساخ مرشح الفردية (وسط) وأنماط الفرقة المتوقعة ل وت، كو وحذف مونوالليك (وت / كو) استنساخ (يمين). بيليليك استنساخ خروج المغلوب تشيرد من النجوم. يشار إلى منتجات التضخيم الصحيحة من قبل الأسهم السوداء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: التحقق من المرشحين خروج المغلوب من قبل لطخة غربية. ( A ) لطخة غربية ل ELAVL1 (أعلى) من مجموعة فرعية من الحيوانات المستنسخة التي تحددها لطخة نقطة. تم مسح PUM2 على نفس الغشاء كما تحكم التحميل (القاع). ( B ) لطخة غربية ل PUM2 (أعلى) من مجموعة فرعية من الحيوانات المستنسخة التي حددها ير مستعمرة. تم طمس غابد على نفس الغشاء والتحكم في التحميل (القاع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد سمح نظام كريسبر / Cas9 بتوليد كفاءة من التعديلات الجينومية المستقرة، التي توفر بديلا أكثر اتساقا لطرق التلاعب العابرة الأخرى. هنا، قدمنا ​​طريقتين لتحديد السريع من كريسر / Cas9 خروج المغلوب الجينات في خطوط الخلايا الثدييات. كلا الأسلوبين تتطلب القليل من المواد الخلوية، لذلك يمكن أن يتم الاختبار في المراحل المبكرة من الثقافة النسيلي، وتوفير الوقت والكواشف. لزيادة كفاءة كلتا الطريقتين، نوصي اختبار سغرناس متعددة، كما تختلف الكفاءة تبعا للتسلسل والموقع الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام سغرناس متعددة مفيد في تحديد الآثار خارج الهدف عن طريق الكشف عن الظواهر الظاهرة نتيجة لطفرات في الجينات غير المستهدفة. سوف ترنسفكأيشن فعالة وانقسام Cas9 تزيد كثيرا من فرص توليد خروج المغلوب. بدلا من ذلك، ترانسفكتينغ الخلايا مباشرة مع مصادر تجاريا سغرنا / Cas9 ريبونوكلوبروتين المجمعات 32 ،33 قد تسرع البروتوکول وتقلل الآثار خارج الھدف.

البقع نقطة هي مناسبة تماما لتقييم خروج المغلوب البروتين الناجمة عن التعديلات الجينومية الصغيرة بسبب نهيج. وبما أن بناء سغرنا / Cas9 واحد ضروري فقط، فإن هذا النهج قد يكون أسرع في الحصول على خطوط فارغة، وإجراءات طمس التحايل على خطوات إضافية، وتسريع الفحص. إن إشارة البروتين المناعية تطبيع بمثابة مؤشر موثوق بها للتحقق من صحة ناجحة ( الشكل 2B ). هذا البروتوكول هو المثالي لجيل من خروج المغلوب مع الحد الأدنى من الاضطرابات الجينومية. بدلا من ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة من الفرز للتحقيق في إضافة البروتين أو تعديل، مثل البروتينات المعدلة وراثيا أو علامات البروتين. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب الفرز الأجسام المضادة مع خصوصية عالية للبروتين من الفائدة، كما عبر التفاعل يؤدي إلى خلفية عالية في البقع نقطة. تقتصر هذه الطريقة بشكل طبيعي على استهداف الطفراتمناطق ترميز البروتين، حيث أن الناتج النهائي يعتمد على وجود / غياب منتج البروتين. من المهم أن نلاحظ أيضا أن الطفرات الناجمة عن نهيج يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من نتائج البروتين، بما في ذلك البروتين مع وظيفة سلبية نشطة أو جزئية أو المهيمنة، أو بروتين وظيفي تفتقر إلى حاتمة الأجسام المضادة الكشف. للحد من هذه القضايا، فمن المفيد لاستهداف قطع Cas9 في وقت مبكر في منطقة الترميز ممكن، من أجل زيادة فرص توليد البروتين غير وظيفية تماما. بالإضافة إلى ذلك، استهداف المناطق الجينومية التي هي أقل وصولا إلى آلات Cas9 يمكن أن تنتج غلة الحذف منخفضة في غياب الاختيار. وأخيرا، قد يكون من الصعب الحصول على خروج المغلوب التي تمنح عيب انتقائي من قبل هذه الطريقة لأسباب مماثلة.

باستخدام آليات إصلاح توجهات الموجهة جنبا إلى جنب مع كريسبر / Cas9 الانقسام يسمح للتلاعب الجينومية أكبر بكثير وأكثر تحديدا، والتي يمكن أن تشمل كلا لارج على نطاق الحذف (رسمها اثنين من الانقسام سغرنا) والإدراج. منذ اثنين من أحداث الانقسام وعملية إصلاح دقيقة تحتاج إلى أن تأخذ مكان، والتكامل من علامة مقاومة المخدرات زيادة كبيرة غلة خروج المغلوب باستخدام هذه الطريقة. على الرغم من أن الكشف عن البقعة نقطة يمكن أن تستخدم أيضا، والفحص من قبل مستعمرة ير هو أكثر قابلية للتطبيق بشكل عام للكشف بدقة المرشحين الاندماج / خروج المغلوب الصحيح مع مثل هذه الاضطرابات الجينية الكبيرة. وعلاوة على ذلك، والاختبار عن طريق ير يسمح لتحديد الحيوانات المستنسخة مع التكامل غير كاملة وغير كاملة، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة مدى وطبيعة عملية التنمية البشرية نفسها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة علامة عرض في وقت لاحق (عن طريق التعبير كري عابرة أو بالإضافة إلى ذلك في شكل غشاء نفاذية)، وترك الحد الأدنى، و 34 ندب حذف ندبة (موقع لوكسب) والسماح في المستقبل إعادة استخدام علامة الاختيار. مرونة هذا النهج يزيد مع استخدام علامات مقاومة متعددة، مما يسمح لتوليد متعددة كومولوت بروتين نوكوتس. ومن المهم عند تطبيق هذه الطريقة أن يتم التحقق من صحة المنتج أكثر من ذلك، على سبيل المثال من قبل رت-قر من النص المتوقع. وبما أن هذه الشاشة يمكن أن تكون الأجسام المضادة مستقلة، يتم تطبيق هذه الطريقة بسهولة إلى خروج المغلوب البروتين دون أجسام مضادة قوية، وكذلك للكشف عن التغييرات التي لا تقع في الجينات الترميز البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يعترفوا جيسيل سانشيز، ميغان لي، وجيسون إستيب للمساعدة التجريبية، و ويفنغ قو و شيمي تشن لتبادل الكواشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1x SDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  2. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  3. Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
  4. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  5. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
  6. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  7. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  8. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  9. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  10. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
  11. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  12. Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
  13. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  14. Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  15. Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
  16. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  17. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  18. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  19. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  20. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  21. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  22. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  23. Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
  24. Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
  25. Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
  26. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  28. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  29. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  30. Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
  31. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  32. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  33. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).

Tags

علم الوراثة، العدد 124، كريسبر / Cas9، إصلاح يحركها التناظر، غير متماثلة نهاية الانضمام، وصمة عار نقطة، واختيار النسيلي، والفحص
جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sternburg, E. L., Dias, K. C.,… More

Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter