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Genetics

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55903
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

Summary

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Abstract

O sistema de engenharia do genoma CRISPR / Cas9 revolucionou a biologia ao permitir uma edição precisa do genoma com pouco esforço. Guiado por um único guia de RNA (sgRNA) que confere especificidade, a proteína Cas9 cliva ambas as cadeias de DNA no locus alvo. A ruptura do DNA pode desencadear união final não homóloga (NHEJ) ou reparação direcionada a homologia (HDR). O NHEJ pode introduzir pequenas deleções ou inserções que levam a mutações de mudança de quadro, enquanto o HDR permite perturbações maiores e mais precisas. Aqui, apresentamos protocolos para geração de linhas celulares knockout através do acoplamento de métodos CRISPR / Cas9 estabelecidos com duas opções para seleção / rastreio a jusante. A abordagem NHEJ usa um único local de corte de sgRNA e rastreio independente de seleção, onde a produção de proteína é avaliada por imunotransferência ponto de uma maneira de alto rendimento. A abordagem HDR usa dois sites de corte de sgRNA que abrangem o gene de interesse. Juntamente com um modelo de HDR fornecido, esse método pode ser excluídoDe dezenas de kb, auxiliado pelo marcador de resistência selecionado inserido. São discutidas as aplicações e vantagens apropriadas de cada método.

Introduction

Alterações genéticas estáveis ​​oferecem uma vantagem sobre os métodos transitórios de perturbação celular, que podem ser variáveis ​​em sua eficiência e duração. A edição genômica tornou-se cada vez mais comum nos últimos anos devido ao desenvolvimento de nucleases específicas do alvo, como as nucleases de zinco-dedo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , as nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 E nucleases guiadas por RNA derivadas do sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas, regularmente intercaladas (CRISPR) 10 .

A maquinaria de edição CRISPR / Cas9 é adaptada de um sistema imunológico que bactérias e archaea usam para se defender contra infecções viraisAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . Neste processo, fragmentos curtos de 20-30 nt de sequência viral invasora são incorporados em um locus genômico como "espaçadores" flanqueados por unidades repetitivas 14 , 15 . A transcrição subsequente e o processamento de RNA geram pequenos RNAs 16 (CRRNAs) associados ao CRISPR que, juntamente com um CRRNA 17 (traRRNA) trans-ativador, se reúnem com a endonuclease efectora Cas9. Os crRNAs proporcionam assim especificidade ao alvo de Cas9, guiando o complexo para separar sequências de DNA viral complementares e prevenir novas infecções 18 , 19 . Qualquer sequência de "protospacer" no DNA alvo pode servir como fonte do crRNA, desde que seja diretamente 5 'para um motivo adjacente prótespacer curto (PAM), NGG no caso de S. pyogenes Cas9 21 .

Após a expressão de Cas9 e um sgRNA em células eucarióticas, a proteína Cas9 corta as duas cadeias de DNA no locus alvo. Na ausência de uma região adequada de sequência homóloga, a célula corrige esta ruptura através de união final não homóloga (NHEJ) 22 , 23 , 24 , que tipicamente introduz pequenas deleções ou, raramente, inserções. Ao segmentar umQuadro de leitura, o reparo provavelmente leva a um quadro de translação que produz um produto proteico não funcional. Em contraste, quando fornecido com um modelo exógeno com grandes regiões de homologia, a célula pode corrigir a ruptura de duas vertentes por reparo direcionado por homologia 25 , 26 . Esta rota permite exclusões, substituições ou inserções precisas maiores no genoma, juntamente com a introdução de marcadores de seleção excisáveis 27 .

Aqui, apresentamos protocolos para gerar linhas celulares knockout por qualquer um desses dois métodos CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). A abordagem do NHEJ usa um único site de corte de sgRNA e rastreio independente de seleção e, portanto, requer pouca preparação antecipada. Ao usar este método, os RNAs de guia complementares aos exons próximos ao final 5 'da transcrição, que são mais propensos a produzir um knockout, devem ser projetados. Desde o modificatOs íons para o genoma neste caso são pequenos, a triagem para clones knockout baseia-se em manchas de ponto, onde o produto proteico é avaliado de forma eficiente. Utilizamos a geração de linhas knockout de proteína ELAV-like 1 (ELAVL1) como exemplo. A segunda abordagem baseia-se na reparação direta de homologia (HDR) e usa dois sites de corte de sgRNA que abrangem o gene ou região de interesse, permitindo deleções de dezenas de kb. Um plasmídeo com duas regiões de homologia que flanqueiam os sites de clivagem fornece um modelo de substituição ( Figura 1B ), introduzindo um marcador de resistência selecionável que aumenta a eficiência da geração de nocaute. Este método também pode ser adaptado para introduzir modificações de genes com armas de homologia devidamente projetadas. Neste caso, a integração de um novo fragmento de DNA permite a triagem baseada em PCR ( Figura 1C ). Aqui, usamos a geração de linhas knockout do membro da família Pumilio RNA vinculativo 2 (PUM2) como exemplo.

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Protocol

1. Identificação de regiões de homologia em torno da eliminação desejada

NOTA: necessário somente se estiver usando a edição baseada em seleção.

  1. Selecione duas regiões, inicialmente 1,5-2 kb, em ambos os lados do locus de exclusão desejado, que servirá como braços de homologia no modelo HDR ( Figura 1A ). Identifique as regiões que carecem de sites de reconhecimento BsaI em ambos os lados (GGTCTC) para facilitar a clonagem. Se os sítios BsaI forem inevitáveis, use uma enzima de restrição tipo II diferente (BsmBI, SapI, BbsI) e modifique os locais correspondentes no plasmídeo receptor (pUC19-BsaI), plasmídeo doador marcador de resistência (pGolden-Neo ou pGolden-Hygro) e Saliência de produtos de PCR do grupo de homologia.

2. Geração de Plasmídeos de Expressão Cas9-SgRNA

  1. Defina o (s) site (s) de segmentação para mutagênese. Para o método de corte único, sem seleção, exões de codificação proximal de 5 'para aumentar a probabilidade de um não-fuMutação nacional. Para o método de corte duplo, selecione dois sites que ocupam a maior parte do gene conforme necessário.
    NOTA: Em nossa experiência, as exclusões de até 53 kb são criadas eficientemente.
  2. Entre 200 a 300 pb da sequência de região alvo na ferramenta de design crispr.mit.edu. Para a clonagem baseada em seleção, use 200-300 pb das regiões de homologia identificadas que são proximais ao locus de exclusão ( Figura 1A ). Selecione 2-3 dos sgRNAs de maior classificação por região segmentada para explicar as diferenças em suas atividades e isolar clones independentes que não compartilham os mesmos efeitos fora do alvo.
  3. Para projetar oligonucleótidos duplexados com saliências apropriadas para inserção no plasmídeo de expressão, omita a sequência PAM final (NGG) e adicione uma saliência 5 '-CACC seguida de um G no oligo superior. Para o oligo de vertente inferior, adicione uma saliência de 5 a AAAC à sequência alvo complementada inversa, seguida de um 3'-C, como ilIlustrado abaixo:
    Seqüência 1
  4. Insira oligonucleótidos sintéticos correspondentes aos sgRNAs no plasmídeo pSpCas9 (BB) usando a clonagem Golden Gate 28 como descrito no protocolo de laboratório Zhang 29 .

3. Geração de Plasmídeos de Modelo de Reparo Dirigidos por Homologia

NOTA: necessário somente se estiver usando a edição baseada em seleção. O plasmídeo modelo de reparação dirigido por homologia consiste em uma cassete de resistência a fármacos flanqueada por duas regiões que são complementares do genoma, apenas fora dos dois sites alvo de sgRNA ( Figura 1B ).

  1. Das regiões de homologia mais amplas identificadas no passo 1.1, selecione 800-1,000 bp 26 não mais de 5-10 pb dos locais de corte Cas9 projetados, para servir como os braços de homologia ( Figura 1A ). Certifique-se de não incluir o sgRNASite alvo e seu PAM nos braços de homologia, pois isso causará clivagem CRISPR / Cas9 do próprio plasmídeo modelo. Se os braços de homologia contêm sites BsaI internos, use sites de sgRNA alternativos.
  2. A amplificação por PCR amplifica os braços de homologia a partir de DNA genômico usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade, de acordo com as instruções do fabricante, utilizando iniciadores diretos e reversos com sequência adicional de 5 'que introduz sites BsaI (GGTCTC) e saliências únicas em qualquer extremidade da região de homologia. Os saliências devem conter sequências adequadas para gerar ordem e orientação de montagem corretas, conforme descrito abaixo ( Figura 1B ):
    Braço de homologia esquerdo FP overhang: 5 'GGGTCTCA GGCC
    Braço de homologia esquerdo RP overhang: 5 'GGGTCTCT CACG
    Braço de homologia direito FP overhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
    Direito braço de homologia RP overhang: 5 'GGGTCTCT CCAC
  3. Verifique os braços de homologia para amplificação apropriadaAtravés de eletroforese em gel antes de prosseguir.
  4. Monte as regiões do braço de homologia direita e esquerda com a cassete de resistência em um plasmídeo modelo HDR pela clonagem 28 de Golden Gate. Use os plasmídeos pGolden-Neo ou pGolden-Hygro 30 como fonte de cassetes de resistência flangeadas loxP (loxP-PGK-Neo-pA-loxP ou loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Use pUC19-BsaI, uma pUC19 modificada com sites BsaI na região de clonagem múltipla e eliminou sites BsaI em outros lugares, como o vetor destinatário (disponível mediante solicitação). Use uma proporção de 1: 1: 1: 1 para as três inserções e vetor.
    1. Preparar a seguinte mistura de reacção 30 :
      Produto de PCR do direito da homologia 0,06 pmol (30-40ng)
      Produto de PCR do braço de homologia esquerdo 0,06 pmol (30-40ng)
      Plasmídeo pGolden-Neo (100 ng / μL) 1 &# 181, L
      Plasmídeo pUC19-BsaI (100 ng / μL) 1 μL
      2x T7 DNA ligase buffer 5 μL
      BsaI (10 U / μL) 0,75 μL
      T7 ADN ligase (3000 U / μL) 0,25 μL
      agua Até 10 μL
    2. Use os seguintes parâmetros do termociclador: 37 ° C durante 5 min, 20 ° C durante 5 min. Repita durante 30 ciclos.
    3. Trate o produto de clonagem com uma exonuclease por instruções do fabricante para digerir qualquer DNA linear remanescente.
    4. Transforme a mistura de reação em uma estirpe competente de E. coli de acordo com o protocolo fornecido com as células e placa sobre pratos contendo ampicilina.
  5. Para identificar clones com a montagem de modelo correta, execute bactériasPCR de colônia para amplificar as sub-regiões do braço de homologia da inserção montada (como a inserção inteira pode ser muito grande para amplificar de forma confiável). Use um recozimento de iniciador para a sequência do plasmídeo flanqueador e um segundo primário complementar à borda da cassete de resistência ( Figura 1B , a sequência é comum aos insertos Neo e Hygro), gerando um produto dependente da montagem que é aproximadamente 200 pb maior que O braço de homologia contido:
    PUC19-Bsal-Left: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
    Resistência à esquerda: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
    PUC19-BsaI-Right: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
    Resistência à direita: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
    1. Escolha colônias bacterianas com palitos de palito estéril e suspenda as bactérias em 20 μL de água. Aqueça a 95 ° C durante 15 min e gire para baixo numa centrífuga de mesa à velocidade máxima durante 5 min. Coloque imediatamente sobre gelo.
    2. Preparar a seguinte mistura de PCR 31 </ Sup>:
      Diluir modelo de colônia 1,25 μL
      10 x tampão de reação Taq 1,25 μL
      DNTPs de 20mM 0,25 μL
      Iniciador direto de 10 μM 0,25 μL
      Primer iniciador reverso de 10 μM 0,25 μL
      Taq Polymerase 0,25 μL
      agua 9 μL
    3. Use os seguintes parâmetros do termociclador: 95 ° C durante 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min / kb), repita durante 25 ciclos, 72 ° C durante 2 min.
    4. Verifique o produto de PCR para o tamanho correto do amplicão por eletroforese em gel de agarose.
    5. Opcionalmente, o DNA de plasmídeo de miniprep de colônias individuais com tamanho de inserção correto e sequência thE regiões de braços de homologia pela seqüência de Sanger com os iniciadores de amplificação mencionados acima.

4. Transfecção de componentes CRISPR em células cultivadas

  1. Antes da transfecção: cultivar células T-REx293 em meio DMEM suplementado com 10% de FBS a 37 ° C e 5% de CO 2 .
  2. Coloque as células em placas de 6 poços e cresça até cerca de 70% de confluência. Inclua um poço para um controle não-transfectado.
  3. Células transfectadas com 2,5 μg de plasmídeo total utilizando um protocolo de transfecção comercial. Em paralelo, mantenha o controle não transfectado.
    NOTA: O método de transfeção e a eficiência variam dependendo do tipo de célula. Determine o método de transfecção apropriado para o sistema antes da experiência.
    1. Para a transfecção de células com seleção, use 0,75 μg de Cas9-sgRNA 1 (corte esquerdo), 0,75 μg de Cas9-sgRNA 2 (corte direito) e 1,0 μg de modelo de recombinação homóloga.
    2. Para transfectiNas células sem seleção, use 2,5 μg de plasmídeo Cas9-sgRNA.

5. Seleção de medicamentos

  1. 48 h após a transfecção, tratar as células com o fármaco apropriado (Neomicina / Higromicina). Execute a seleção até que todas as células no controle não transfectado morram (geralmente 3-5 dias para Neo, 7-14 dias para Hygro).
    NOTA: Use concentrações de 500 μg / mL e 10 μg / mL para Neomycin e Hygromycin, respectivamente para células T-REx293. Para outros tipos de células, pode ser útil realizar uma titulação prévia de fármaco em células não transfectadas para determinar a concentração efetiva.

6. Isolamento de populações clonais

  1. Crescer as células para 100% de confluência no poço original após a seleção. Células de semente em placas de 96 poços a uma densidade de 0,33 células por poço.
    NOTA: Semear três placas de 96 poços é um bom ponto de partida para garantir o isolamento de mais de um clone correto, mas pode ser necessário mais ou menos depTerminando em sgRNA e HDR eficiências.
  2. Observe as colônias durante um período de 2-4 semanas, até que as colônias estejam visíveis aos olhos. Escolha as colônias visíveis com uma ponta de pipeta esterilizada e volte a colocar em novos poços para incentivar o crescimento de monocamadas. Ao usar células em suspensão, podem ser utilizadas densidades de semeadura mais baixas para garantir uma maior proporção de poços de colônia única.

7. Candidatos de triagem

  1. Seleção de candidatos sem a seleção: dot blot
    1. Cresça clones individuais a 50-100% de confluência. Desliga a monocamada de células por pipetagem dentro do poço.
    2. Alíquota 90 μL do volume total de 100 μL para um tubo de microcentrífuga limpo. Girando a 6000 rpm durante 5 min, retire o meio e lie o sedimento de células em 10 μL de 1x Lysis Buffer ou 1x tampão de carga de SDS (5x: Tris-Cl 250 mM pH 6,8, SDS a 8%, azul de bromofenol a 0,1%, 40% Glicerol, 100 mM de DTT). Adicione 90 μL de novas mídias ao restante das células no bemL para continuar propagando.
    3. Pipetar 1 μL de lisado celular sobre uma membrana de nitrocelulose seca para formar um ponto. Bloqueie cada amostra duas vezes em duas membranas separadas, criando dois padrões idênticos de amostras.
    4. Bloquear as membranas em 5% de leite em TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3 g de base de Tris, até 1 L de água destilada, pH 7,4) 31 durante 1 h à temperatura ambiente ( Com balanço, aqui e durante o procedimento).
    5. Bloquear usando o anticorpo primário contra a proteína alvo em uma membrana e o anticorpo primário para uma proteína de controle (tubulina, GAPDH ou qualquer outra proteína que não se espera que mude) no outro. Use a diluição recomendada de anticorpos primários (0,2 μg / mL para ELAVL1 e 0,1 μg / mL para Pum2 neste caso) em TBST + 5% de leite. Incubar 1 h à temperatura ambiente.
    6. Lavar 3 vezes com TBST por 5 min.
    7. Incubar cada membrana com anticorpo secundário adequado conjugado com HRP em TBST + 5% de leite durante 1 h à temperatura ambiente.
    8. Lavar 3 vezes com TBST por 5 min.
    9. Aplicar solução de substrato de quimioluminiscência (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante e imagem da membrana manchada em uma imagem digital de quimioluminiscência.
    10. Quantifique intensidades de ponto para o alvo e controle proteínas usando o software apropriado.
    11. Elimine os candidatos com sinal de proteína de controle baixo e calcule os índices subtraídos de fundo do alvo para controlar as intensidades de proteína para os restantes candidatos. Selecione os candidatos com os índices mais baixos para a passagem e posterior validação pelo western blot.
  2. Candidatos de seleção com o uso da seleção: PCR de colônia
    1. Coletar lisado celular usando um kit de preparação de DNA (ver Tabela de Materiais ).
      1. Duplique colônias individuais em um novo 96 poços e cresça até 100% de confluência.
      2. Remova a mídia de um conjunto de clones, umE ressuspender células em 30 μL de tampão de extração do kit. Transfira para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
      3. Aqueça a solução a 96 ° C durante 15 minutos e deixe arrefecer até à temperatura ambiente.
      4. Adicione 30 μL de tampão de estabilização do kit. Misture bem.
    2. Identificar linhas mutantes de tipo selvagem e monoalquilo / bialélico por PCR de colônia.
      1. Desenhe dois conjuntos separados de iniciadores de PCR (para o lado esquerdo e direito do locus alvo) para amplificar as regiões ao redor dos braços de homologia com base na integração bem sucedida ou mal sucedida da cassete de resistência ( Figura 2C ). Em cada lado, use um primário comum (vermelho) que recobre fora do braço de homologia. Use-o com um iniciador emparelhado correspondente que seja complementar à seqüência endógena, abrangendo a região de homologia (azul), para testar o alelo de tipo selvagem. Use outro iniciador emparelhado, complementar a cassete de resistência inserida (veja os iniciadores na seção2.3), para testar a mutação desejada.
      2. (Recomendado) Valide os conjuntos de iniciadores usando o lisado celular da população celular original selecionada, uma vez que conterá uma mistura de ambos os alelos WT e mutantes ( Figura 2D ).
      3. Preparar a seguinte mistura reaccional:
        Lisado celular 0,5 μL
        10x buffer de KOD 1,25 μL
        MgSO4 25 mM 0,75 μL
        DNTPs 2 mM 1,25 μL
        Iniciador direto de 10 μM 0,375 μL
        Primer iniciador reverso de 10 μM 0,375 μL
        KOD polimerase 0,25 μL
        agua 7,75 μL
      4. Use as seguintes condições de termociclador: 95 ° C durante 2 minutos, (95 ° C por 20 s, Primer Tm durante 10 s, 70 ° C durante 20 s / kb), repita durante 25 ciclos.
      5. Visualize o produto de PCR por eletroforese em gel de agarose.
    3. Repita o teste de PCR da colônia para cada lado da integração prevista. Selecione e expanda candidatos que mostram presença de integração e nenhum produto de seqüência endógena para a região excluída.
    4. Valide candidatos positivos por western blot e / ou RT-qPCR.

8. Verifique a Mutação Genômica por Seqüenciamento

  1. Isolar DNA genômico a partir de linhas de células mutantes por extração de fenol clorofórmio 31 .
  2. A amplificação por PCR da região alvo de sgRNA, usando primers com 5 'overhangs que adicionam os locais de restrição BsaI para cada extremidade.
    NOTA: Para clones editados com HDR, onde ambos os alelos podem ser idênticos, o produto de PCR pode ser sequenciado diretamente.
  3. Clonar a região ampliada em pUC19-BsaI pela clonagem Golden Gate.
  4. Transforme a mistura de reação em uma estirpe competente de E. coli .
  5. ADN do plasmídeo Miniprep de 6 a 10 colônias individuais e sequencia a região clonada pela seqüência de Sanger.

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Representative Results

Para a geração de linhas knockout ELAVL1, um anticorpo robusto estava disponível, então a edição usando sgRNAs simples ( Figura 1A , esquerda) foi realizada, seguida de imunotransferência por pontos. Três sgRNAs foram transfectados de forma independente para comparar eficiências e descartar os efeitos alvo nos clones resultantes. Após a coleta e mancha de lisados ​​celulares de populações clonais em duas membranas de nitrocelulose, as manchas foram testadas para ELAVL1 e PUM2 (como controle de normalização) ( Figura 2A ). A proporção quantificada do sinal ELAVL1 para PUM2 demonstrou uma faixa muito ampla,> 10 4 vezes entre as linhas isoladas ( Figura 2B ). Usando essa relação como um critério de seleção, nós validamos uma série de linhas usando ELAVL1 western blots ( Figura 3A ). Na maioria dos casos, populações clonais com o sinal ELAVL1 relativo mais baixo foramIdentificados corretamente como knockouts ( Figura 2B ), confirmando o poder preditivo dessa quantificação (apesar da variabilidade considerável no sinal de controle, que provavelmente surgiu de diferentes quantidades de células coletadas). Por outro lado, a maioria dos clones com relações intermediárias exibiu o sinal ELAVL1 após a validação, representando potencialmente eventos de exclusão monoaleica. No entanto, não foi observado nenhum grau geral das proporções em pools WT, monoalcano e mutante completo (bialélico), e até mesmo os clones positivos de ELAVL1 apresentaram uma ampla e contínua gama de níveis, provavelmente devido à variabilidade clonal da expressão. A eficácia global da geração knockout ELAVL1 usando este método variou de 6 a 36% entre os sgRNAs.

Para outros alvos de genes (como PUM2), a qualidade dos anticorpos disponíveis evita o rastreio preciso de clones candidatos por ponto blot devido ao alto nível de fundo de reação cruzadaVidade. Além disso, a eficiência de segmentação de alguns loci genômicos pode ser substancialmente menor devido à acessibilidade da cromatina. Nesses casos, um método dependente da seleção é apropriado para aumentar a eficiência. Dois sgRNAs visando regiões de codificação precoce e tardia de PUM2 foram cotransfectados com um modelo de reparo homologicamente direcionado, de modo a excisar 45 kb de DNA genômico e substituí-lo por uma cassete de resistência à neomicina ( Figura 1A , à direita). O conjunto do modelo de homologia está ilustrado na Figura 1B . Os iniciadores de PCR foram projetados para amplificar regiões ao redor dos braços de homologia com base na integração bem sucedida ou sem sucesso da cassete de resistência ( Figura 2C ), e foram testados em células não transfectadas e as células selecionadas em massa (painel esquerdo). Como esperado, em células não transfectadas, apenas um amplicão correspondente ao estado endógeno (superior) foi observado, enquanto as células selecionadas em massa apresentaram amplicões de ambosAlelos de tipo selvagem e mutantes. Os lisados ​​celulares dos candidatos clonais gerados foram recolhidos e testados quanto à presença de ambas as sequências endógenas e da cassete de resistência. Os knockouts do candidato foram identificados pela presença do amplicão da cassete de resistência sozinho, indicando a exclusão / integração bialélica ( Figura 2D , estrelas). Também foram observados clones com inserções monocelulares e eram bastante comuns, uma vez que tais populações também podem sobreviver ao processo de seleção. Estes clones foram indicados pela presença da sequência endógena e da cassete de resistência. Em alguns casos, também foram observados tipos selvagens clonais no locus testado, sugerindo que a integração genômica aleatória, não-sgRNA do modelo de reparo direcionado à homologia, ocorre em baixa freqüência. As linhas mutantes bialélicas foram ainda validadas por western blot ( Figura 3B ). A eficiência geral da geração de nocaute usando o procedimento HDR foi de 33%.

figura 1
Figura 1: Um fluxo de trabalho para geração de knockouts mediados por CRISPR em linhas celulares de mamíferos. ( A ) Eventos de edição do genoma produzidos pela clivagem CRISPR / Cas9 e NHEJ (esquerda) ou HDR (direita). O site da clivagem Cas9 é denotado por uma linha vertical branca. ( B ) Componentes e montagem do plasmídeo modelo HDR. As enzimas de restrição de tipo II usadas na clonagem de Golden Gate, como BsaI, reconhecem uma sequência de DNA assimétrica e deixam um corte escalonado fora da seqüência de reconhecimento, permitindo a concepção de segmentos de sobreposição arbitrários para montagem (foto). As setas indicam as posições do iniciador para verificar a montagem corretiva do plasmídeo. ( C ) Fluxo de trabalho: após transfecção (e seleção de drogas, se aplicável), as células são plaqueadas em diluições limitantes em placas de 96 poços. Populações clonaisSão selecionados por imunotransferência de ponto (seleção-independente, NHEJ) ou PCR de colônia (dependente da seleção, HDR). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Triagem de linhas knockout candidatas por transferência de ponto ou PCR de colônia. ( A ) Dot immunoblot de clones isolados ELAVL1 com anticorpo ELAVL1 (à esquerda), e separadamente com um anticorpo para uma proteína de controle, Pum2 (à direita). Os clones que apresentaram pouco sinal de controle, provavelmente devido a baixas quantidades de proteínas de entrada, são marcados com um X e excluídos de uma análise posterior. Os clones com baixo sinal de ELAVL1 (círculos) foram testados por western blots que confirmaram (verde) ou invalidaram (cinza) os candidatos. ( B ) Quantificação de KO cAndidates de dot blot. Razões de ELAVL1 para controlar o sinal de proteína na mancha de ponto mostrada em A, em ordem crescente. ( C ) Projeto de iniciador para teste knockout / inserção via PCR de colônia. Um iniciador complementar ao locus genômico fora da região do braço de homologia (vermelho) é emparelhado com um iniciador complementar à seqüência endógena (azul) ou à cassete de resistência (verde), sondando o estado não editado ou um evento de exclusão / inserção , Respectivamente. Os pares de iniciadores separados são projetados para testar ambos os lados da integração. ( D ) Exemplo de gel de agarose de resultados de PCR de colônia utilizando iniciadores que abrangem a junção de integração a montante usando iniciadores internos endógenos (topo) e knockout dentro dos primers (parte inferior). Os primers são primeiro validados em células T-REx293 parentais e células selecionadas em massa (esquerda). Clones de candidatos individuais (meio) e os padrões de banda esperados para clones WT, KO e exclusão monoalelic (WT / KO) (à direita). Clones knockout bialélicos são indicadosD por uma estrela. Os produtos de amplificação corretos são indicados por setas negras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Validação de candidatos knockout por Western blot. ( A ) Western blot para ELAVL1 (topo) de um subconjunto de clones identificados por ponto blot. O PUM2 foi apagado na mesma membrana que um controle de carga (inferior). ( B ) Western blot para PUM2 (topo) de um subconjunto de clones identificados por PCR de colônia. GAPDH foi apagado na mesma membrana que um controle de carga (parte inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O sistema CRISPR / Cas9 permitiu uma geração eficiente de modificações genômicas estáveis, que proporcionam uma alternativa mais consistente a outros métodos de manipulação transitória. Aqui, apresentamos dois métodos para identificação rápida de knockouts de genes CRISPR / Cas9 em linhas celulares de mamíferos. Ambos os métodos requerem pouco material celular, pelo que o teste pode ser feito em estágios iniciais da cultura clonal, economizando tempo e reagentes. Para aumentar a eficiência de ambos os métodos, recomendamos testar sgRNAs múltiplos, uma vez que as eficiências variam dependendo da sequência e da localização genômica. Além disso, o uso de sgRNAs múltiplos é útil na identificação de efeitos fora do alvo ao detectar fenótipos atípicos como resultado de mutações em genes não-direcionados. A transfecção efetiva e a clivagem Cas9 aumentarão significativamente as chances de gerar nocaute. Alternativamente, transfectando as células diretamente com complexos de ribonucleoproteína sgRNA / Cas9 de origem comercial 32 ,33 podem acelerar o protocolo e reduzir os efeitos do alvo.

As manchas de pontos são bem adequadas para avaliar os knockouts de proteínas causados ​​pelas pequenas alterações genômicas devidas ao NHEJ. Uma vez que apenas uma única construção de sgRNA / Cas9 é necessária, essa abordagem pode ser mais rápida na obtenção de linhas nulas, e o procedimento de manobra contorna etapas adicionais, agilizando a triagem. O sinal normalizado de proteína de imunotransferência serve como um preditor confiável de validação bem sucedida ( Figura 2B ). Este protocolo é ideal para a geração de knockouts com uma perturbação genômica mínima. Alternativamente, este método de rastreio pode ser adaptado para sonda para adição ou modificação de proteínas, tais como proteínas transgénicas ou etiquetas de proteínas. No entanto, este método de rastreio requer um anticorpo com alta especificidade para a proteína de interesse, uma vez que a reactividade cruzada leva a um fundo alto em manchas de ponto. Este método é naturalmente limitado às mutações visandoRegiões codificadoras de proteínas, uma vez que a produção final depende da presença / ausência de um produto protéico. É importante também notar que as mutações causadas pelo NHEJ podem levar a uma variedade de resultados de proteínas, incluindo uma proteína com função constitutivamente ativa, parcial ou dominante negativa, ou uma proteína funcional que não possui o epítopo de anticorpo de detecção. Para minimizar esses problemas, é útil segmentar o Cas9 cortado o mais cedo possível na região de codificação, a fim de aumentar as chances de gerar uma proteína totalmente não funcional. Além disso, direcionar as regiões genômicas que são menos acessíveis à maquinaria Cas9 podem produzir baixos rendimentos de exclusão na ausência de seleção. Finalmente, os knockouts que conferem uma desvantagem seletiva podem ser difíceis de obter por este método por razões semelhantes.

O uso de mecanismos de reparação direcionados à homologia juntamente com a clivagem CRISPR / Cas9 permite manipulações genômicas muito maiores e mais específicas, que podem incluir tanto aEliminação de escala rge (delineada por duas clivagens de sgRNA) e inserções. Uma vez que dois eventos de clivagem e um processo de reparo preciso precisam ocorrer, a integração de um marcador de resistência a medicamentos aumenta substancialmente os rendimentos knockout usando este método. Embora a detecção de ponto-mancha também possa ser usada, o rastreio por PCR de colônia é mais geralmente aplicável para detectar com precisão a integração correta / candidatos knockout com grandes perturbações genômicas. Além disso, o teste por PCR permite a identificação de clones com integrações imperfeitas e incompletas, que podem fornecer informações sobre a extensão e natureza do próprio processo HDR. Além disso, o marcador introduzido pode ser subsequentemente removido (por expressão transitória de Cre ou adição em forma permeável à membrana), deixando uma cicatriz de exclusão mínima de 34 pb (local loxP) e permitindo a reutilização futura do marcador de seleção. A flexibilidade desta abordagem aumenta com o uso de marcadores de resistência múltipla, permitindo a geração de múltiplos acumuladosKnockouts de proteína lativa. É importante ao aplicar este método que a ausência de produto é ainda validada, por exemplo, por RT-qPCR da transcrição esperada. Uma vez que esta tela pode ser independente de anticorpos, este método é facilmente aplicado a knockouts de proteínas sem um anticorpo robusto, bem como para detectar mudanças que não caem em genes de codificação de proteínas.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer Gissell Sanchez, Megan Lee e Jason Estep para assistência experimental, e Weifeng Gu e Xuemei Chen por compartilhar reagentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1x SDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

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Genética edição 124 CRISPR / Cas9 reparação homóloga junção final não homóloga mancha de ponto seleção clonal triagem
Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos
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Sternburg, E. L., Dias, K. C.,… More

Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

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