Summary
Недавние достижения в способности генетически манипулировать соматическими клеточными линиями имеют большой потенциал для фундаментальных и прикладных исследований. Здесь мы представляем два подхода для производства и скрининга генерируемых нокаутом CRISPR / Cas9 в клеточных линиях млекопитающих с использованием и без использования селективных маркеров.
Abstract
Инженерная система генома CRISPR / Cas9 произвела революцию в области биологии, позволив без особого труда точно редактировать геном. Управляемый одной направляющей РНК (sgRNA), которая придает специфичность, белок Cas9 расщепляет обе линии ДНК в целевом локусе. Разрыв ДНК может вызывать либо не гомологичное концевое соединение (NHEJ), либо гомологичный направленный ремонт (HDR). NHEJ может вводить небольшие делеции или вставки, которые приводят к мутациям смены кадров, тогда как HDR допускает большие и более точные возмущения. Здесь мы представляем протоколы для генерации клеточных линий нокаута путем связывания установленных методов CRISPR / Cas9 с двумя вариантами выбора / скрининга ниже по течению. Подход NHEJ использует единый сайт расщепления sgRNA и независимый от отбора скрининг, где производство белка оценивается точным иммуноблотом с высокой пропускной способностью. В методе HDR используются два сайта, разрезающих sgRNA, которые охватывают интересующий ген. Вместе с предоставленным шаблоном HDR этот метод может обеспечить удалениеИз десятков kb, чему способствует вставленный селективный маркер сопротивления. Обсуждаются соответствующие приложения и преимущества каждого метода.
Introduction
Стабильные генетические изменения обеспечивают преимущество перед переходными методами клеточного возмущения, которые могут быть переменными по эффективности и продолжительности. Геномное редактирование становится все более распространенным в последние годы из-за развития целевых специфических нуклеаз, таких как нуклеазы цинка-пальца 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 И RNA-направленные нуклеазы, полученные из кластеризованной, регулярно интерполированной системы коротких палиндромных повторов (CRISPR) 10 .
Механизм редактирования CRISPR / Cas9 адаптирован из иммунной системы, которую используют бактерии и археи для защиты от вирусных инфекцийAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . В этом процессе короткие, 20-30 н.т. фрагменты инвазионной вирусной последовательности включены в геномный локус в виде «спейсеров», фланкированных повторяющимися звеньями 14 , 15 . Последующая транскрипция и обработка РНК генерируют небольшие CRISPR-ассоциированные РНК 16 (crRNAs), которые вместе с транс-активирующей кРНК 17 (tracrRNA) собираются с эффекторной эндонуклеазой Cas9. Таким образом, кРНК обладают специфичностью к таргетированию каз9, направляя комплекс для расщепления комплементарных последовательностей вирусных ДНК и предотвращения дальнейших инфекций 18 , 19 . Любая последовательность «protospacer» в целевой ДНК может служить источником crRNA, если она непосредственно 5 'к короткому протоспасферу, смежному мотиву (PAM), NGG в случае S. pyogenes Cas9 21 .
При экспрессии Cas9 и sgRNA в эукариотических клетках белок Cas9 расщепляет обе линии ДНК в целевом локусе. В отсутствие подходящей области гомологичной последовательности клетка фиксирует этот разрыв через не гомологичное концевое соединение (NHEJ) 22 , 23 , 24 , которое обычно вводит небольшие делеции или, реже, вставки. При таргетинге на открытыйРамка считывания, ремонт, вероятно, приводит к поступательному сдвигу кадров, который создает нефункциональный белковый продукт. Напротив, при наличии экзогенной матрицы с большими областями гомологии клетка может фиксировать разрыв двух нитей с помощью гомологичного направленного ремонта 25 , 26 . Этот маршрут допускает более крупные точные удаления, замены или вставки в геноме в сочетании с введением маркеров подакцизного выделения 27 .
Здесь мы представляем протоколы для генерации клеточных линий нокаута одним из этих двух методов CRISPR / Cas9 ( рисунок 1A ). Подход NHEJ использует единый сайт расщепления sgRNA и независимый от отбора скрининг и, следовательно, требует небольшой предварительной подготовки. При использовании этого метода необходимо разработать направляющие РНК, дополняющие экзоны около 5'-конца транскрипта, которые, скорее всего, будут производить нокаут. Поскольку modificatИонов в этом геноме мало, скрининг на клоны для нокаутов основан на дот-блотах, где белковый продукт оценивается с высокой пропускной способностью. В качестве примера мы используем выработку линий выведения ELAV-like 1 (ELAVL1). Второй подход основан на восстановлении гомологии (HDR) и использует два сайта среза sgRNA, которые охватывают ген или область интереса, что позволяет удалять десятки килобайт. Плазмида с двумя регионами гомологии, которые расположены по участкам расщепления, обеспечивает шаблон замены ( фиг. 1B ), вводя селективный маркер сопротивления, который повышает эффективность генерации нокаута. Этот метод также может быть адаптирован для введения модификаций генов с правильно разработанными головками гомологии. В этом случае интеграция нового фрагмента ДНК позволяет проводить скрининг на основе ПЦР ( рис. 1С ). Здесь мы используем в качестве примера создание линий нокаута 2-го члена семейства Pumilio RNA (PUM2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Идентификация областей гомологии вокруг желаемого удаления
ПРИМЕЧАНИЕ. Необходимо только при использовании редактирования на основе выбора.
- Выберите две области, первоначально 1,5-2 kb, по обе стороны от желаемого локуса для удаления, которые будут служить в качестве гомологического оружия в шаблоне HDR ( рис. 1A ). Определите регионы, в которых отсутствуют сайты распознавания BsaI ни на одной из сторон (GGTCTC), чтобы облегчить клонирование. Если сайты BsaI неизбежны, используйте альтернативный рестрикционный фермент IIs (BsmBI, SapI, BbsI) и модифицируйте соответствующие сайты в реципиентной плазмиде (pUC19-BsaI), резистентную маркерную донорную плазмиду (pGolden-Neo или pGolden-Hygro) и Плечи продукта PCR с гомологией.
2. Генерация плазмид экспрессии каз9-sgРНК
- Определите сайт (ы) для таргетинга для мутагенеза. Для метода однократной, без выбора, целевого 5 'проксимального кодирования экзонов для увеличения вероятности не-fuМутацией. Для метода двух разрезов выберите два сайта, которые по мере необходимости занимают столько же гена.
ПРИМЕЧАНИЕ. По нашему опыту эффективно удаляются до 53 кб. - Введите 200-300 бит целевой последовательности областей в инструмент проектирования crispr.mit.edu. Для клонирования на основе выбора используйте 200-300 пар оснований идентифицированных областей гомологии, которые расположены ближе к локусу для удаления ( рисунок 1A ). Выберите 2-3 из наиболее ранжированных sgRNAs для каждого целевого региона, чтобы учесть различия в их активности, и изолировать независимые клоны, которые не имеют одинаковых потенциальных побочных эффектов.
- Для создания дуплексных олигонуклеотидов с соответствующими выступами для введения в плазмиду экспрессии опустить конечную последовательность PAM (NGG) и добавить 5'-CACC-высадку, а затем G на олигонуклеотид верхней нити. Для олигонуклеотидов нижней нити добавьте 5'-AAAC навес к последовательности с обратной добавленной мишенью, за которой следует 3'-C, так как ilНиже:
- Вставьте синтетические олигонуклеотиды, соответствующие sgRNAs в плазмиду pSpCas9 (BB) с использованием клонирования Golden Gate 28, как описано в лабораторном протоколе Zhang 29 .
3. Генерация гомологично-ориентированных шаблонов восстановления шаблонов
ПРИМЕЧАНИЕ. Необходимо только при использовании редактирования на основе выбора. Гомологически ориентированная восстанавливающая шаблонная плазмида состоит из кассеты с лекарственной устойчивостью, фланкированной двумя регионами, которые комплементарны геному, расположенному за пределами двух целевых сайтов sgRNA ( фиг. 1В ).
- Из более широких областей гомологий, определенных на шаге 1.1, выберите 800-1000 bp 26 не более чем на 5-10 б.п. от разработанных участков среза Cas9, чтобы служить в качестве оружия гомологии ( рис. 1A ). Не включайте sgRNAЦелевого сайта и его PAM в руках гомологии, поскольку это приведет к расщеплению CRISPR / Cas9 самой плазменной плазмы. Если в слоях гомологии имеются внутренние сайты BsaI, используйте альтернативные сайты sgRNA.
- ПЦР усиливают руки гомологии из геномной ДНК с использованием высоконадежной ДНК-полимеразы в соответствии с инструкциями производителя, используя прямые и обратные праймеры с дополнительной 5'-последовательностью, которая вводит сайты BsaI (GGTCTC) и уникальные выступы на обоих концах области гомологии. Выступы должны содержать правильные последовательности для формирования правильного порядка сборки и ориентации, как описано ниже ( рисунок 1B ):
Левая рука гомологии FP свеса: 5 'GGGTCTCA GGCC
Левый гомологический рычаг RP свес: 5 'GGGTCTCT CACG
Правый гомологический рычаг FP overhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
Правый гомологический рычаг RP свес: 5 'GGGTCTCT CCAC - Проверьте оружие гомологии для соответствующего амплифаС помощью гель-электрофореза перед продолжением вперед.
- Соберите правую и левую области горизонтальной гомологии с помощью кассеты сопротивления в плазмиду шаблона HDR с помощью клонирования Golden Gate 28 . Используйте плазмиды pGolden-Neo или pGolden-Hygro 30 в качестве источника кассет сопротивления loxP-фланкированных (loxP-PGK-Neo-pA-loxP или loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Используйте pUC19-BsaI, модифицированный pUC19 с сайтами BsaI в области множественного клонирования и удалил сайты BsaI в другом месте, в качестве вектора-получателя (доступно по запросу). Используйте соотношение 1: 1: 1: 1 для трех вставок и вектора.
- Подготовьте следующую реакционную смесь 30 :
Правый гомологический рука PCR-продукт 0,06 пмоль (30-40 нг) Левый гомологический рука PCR-продукт 0,06 пмоль (30-40 нг) Плазмида pGolden-Neo (100 нг / мкл) 1 &# 181; L Плазмиду pUC19-BsaI (100 нг / мкл) 1 мкл 2x T7 ДНК-лигазный буфер 5 мкл BsaI (10 U / мкл) 0,75 мкл ДНК-лигазу T7 (3000 U / мкл) 0,25 мкл вода До 10 мкл - Используйте следующие параметры термоциклера: 37 ° С в течение 5 мин, 20 ° С в течение 5 мин. Повторите операцию на 30 циклов.
- Обработайте клонирующий продукт экзонуклеазой по инструкциям производителя, чтобы переварить оставшуюся линеаризованную ДНК.
- Превращают реакционную смесь в компетентный штамм E.coli в соответствии с протоколом, поставляемым с клетками, и планшет на ампициллинсодержащих чашках.
- Подготовьте следующую реакционную смесь 30 :
- Чтобы идентифицировать клоны с помощью правильной сборки шаблона, выполнитеЧтобы амплифицировать подошвы подгонки гомологии собранной вставки (поскольку вся вставка может быть слишком большой для надежного усиления). Используйте один отжиг праймера к фланкирующей последовательности плазмиды и второй праймер, дополняющий кромку кассеты с сопротивлением ( фиг. 1В , эта последовательность является общей как для вкладышей Neo, так и Hygro), генерируя зависимый от сборки продукт, который приблизительно на 200 б.п. больше, чем Содержащаяся гомология:
PUC19-Bsal-Left: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Сопротивление слева: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-Right: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Сопротивление справа: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Выбирайте колонии бактерий со стерильными зубочистками и суспендируйте бактерии в 20 мкл воды. Нагреть при 95 ° С в течение 15 мин и открутить в столешнице центрифугу при максимальной скорости в течение 5 мин. Поместите сразу на лед.
- Подготовьте следующую смесь ПЦР 31 </ SUP>:
Развернуть шаблон колонии 1,25 мкл 10x реакционный буфер Taq 1,25 мкл 20 мМ dNTP 0,25 мкл 10 мкМ Прямой праймер 0,25 мкл 10 мкМ Обратный праймер 0,25 мкл Taq-полимераза 0,25 мкл вода 9 мкл - Используйте следующие параметры термоциклера: 95 ° C в течение 30 с (95 ° C 30 с, 61 ° C в течение 30 с, 72 ° C в течение 1 мин / кб), повторите в течение 25 циклов, 72 ° C в течение 2 мин.
- Проверьте продукт ПЦР на правильный размер ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле.
- По желанию, минипреп-плазмидная ДНК из отдельных колоний с правильными размерами вставки и последовательностьюE гомологичных областей секреции Sanger с упомянутыми выше усилительными праймерами.
4. Трансфекция компонентов CRISPR в культивируемые клетки
- До трансфекции: клетки культуры T-REx293 в среде DMEM, дополненные 10% FBS при 37 ° C и 5% CO 2 .
- Плиты клеток на 6-луночные планшеты и растут примерно до 70% слияния. Включите колодец для нетрансфекционного контроля.
- Трансфектные клетки с общей плазмидой 2,5 мкг с использованием протокола коммерческой трансфекции. Параллельно поддерживайте нетрансфицированный контроль.
ПРИМЕЧАНИЕ. Метод трансфекции и эффективность варьируются в зависимости от типа ячейки. Определите подходящий метод трансфекции для системы перед экспериментом.- Для трансфекции клеток с селекцией используйте 0,75 мкг Cas9-sgRNA 1 (левый срез), 0,75 мкг Cas9-sgRNA 2 (правый разрез) и образец гомологичной рекомбинации 1,0 мкг.
- Для трансфекцииНа клетках без отбора, используйте 2,5 мкг плазмиды Cas9-sgRNA.
5. Выбор лекарств
- Через 48 ч после трансфекции обрабатывают клетки соответствующим препаратом (неомицин / гигромицин). Выполните выбор до тех пор, пока все клетки в нетрансфицированном контрольном штампе (обычно 3-5 дней для Нео, 7-14 дней для Hygro).
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте концентрации 500 мкг / мл и 10 мкг / мл для неомицина и гигромицина соответственно для клеток T-REx293. Для других типов клеток может быть полезно провести предварительное титрование лекарственного средства на нетрансфицированных клетках для определения эффективной концентрации.
6. Изоляция клональных групп населения
- Выращивайте клетки до 100% слияния в исходном колоде после отбора. Высевают клетки в 96-луночные планшеты с плотностью 0,33 клеток на лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поселение трех 96-луночных планшетов является хорошей отправной точкой для обеспечения изоляции более чем одного правильного клона, но может потребоваться более или менееЗаканчивая эффективностью sgRNA и HDR. - Наблюдайте за колониями в течение 2-4 недель, пока колонии не будут видны глазу. Выбирайте видимые колонии со стерильным наконечником пипетки и подавайте в новые лунки, чтобы стимулировать рост монослоев. При использовании суспензионных клеток даже более низкая плотность посева может быть использована для обеспечения большей доли колоний с колониями.
7. Кандидаты на скрининг
- Отбор кандидатов без использования выбора: дот-блот
- Растут отдельные клоны до 50-100% слияния. Выдвиньте монослой клеток путем пипетирования внутри колодца.
- Аликвоту 90 мкл общего объема 100 мкл в чистую микроцентрифужную пробирку. Скручивают при 6000 об / мин в течение 5 мин, удаляют среду и осаждают лизис клеток в 10 мкл 1x буфера для лизиса или 1x буфера для загрузки SDS (5x: 250 мМ Tris-Cl, pH 6,8, 8% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 40% Глицерин, 100 мМ DTT). Добавьте 90 мкл новых носителей в оставшуюся часть клеток вL продолжить распространение.
- Внесите 1 мкл клеточного лизата на сухую нитроцеллюлозную мембрану, чтобы сформировать точку. Промойте каждый образец дважды на две отдельные мембраны, создавая две идентичные образцы образцов.
- Блокировать мембраны в 5% молоке в TBST (Трис-буферный солевой раствор + 0,01% Твин 20: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 3 г Трис-основания, до 1 л дистиллированной воды, pH 7,4) 31 в течение 1 часа при комнатной температуре ( С качанием, здесь и на протяжении всей процедуры).
- Блот с использованием первичного антитела против целевого белка на одной мембране и первичное антитело для контрольного белка (тубулин, GAPDH или любой другой белок, который, как ожидается, не изменится), с другой. Используйте рекомендуемое первичное разведение антител (0,2 мкг / мл для ELAVL1 и 0,1 мкг / мл для Pum2 в этом случае) в TBST + 5% молока. Инкубируйте 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза TBST в течение 5 мин.
- Инкубируйте каждую мембрану с соответствующим HRP-конъюгированным вторичным антителом в TBST + 5% молока в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза TBST в течение 5 мин.
- Примените раствор хемилюминесцентного субстрата (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя и изобразите сфотографированную мембрану на цифровом хемилюминесцентном изображении.
- Определите количественные значения интенсивностей точек для целевого и контрольного белков с использованием соответствующего программного обеспечения.
- Исключить кандидатов с низким сигналом контрольного белка и рассчитать фоновые вычитаемые отношения мишени для контроля интенсивности белка для остальных кандидатов. Выберите кандидатов с самыми низкими коэффициентами для прохода и дальнейшей проверки с помощью вестерн-блоттинга.
- Скрининг кандидатов с использованием селекции: колония PCR
- Собирайте лизат клеток с помощью набора для подготовки ДНК (см. Таблицу материалов ).
- Дублируйте отдельные колонии в новом 96-луночном колоде и произрастайте до 100% слияния.
- Удалите носитель из одного набора клонов,N ресуспендируют клетки в 30 мкл экстракционного буфера из набора. Перенесите в чистую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку.
- Нагреть раствор до 96 ° С в течение 15 мин и дать охладиться до комнатной температуры.
- Добавьте 30 мкл стабилизирующего буфера из набора. Хорошо перемешать.
- Определите дикого типа и моноаллельные / биаллельные мутантные линии методом колонии PCR.
- Разработайте два отдельных набора ПЦР-праймеров (для левой и правой стороны целевого локуса), чтобы усилить области вокруг рук гомологии на основе успешной или неудачной интеграции резистивной кассеты ( рисунок 2C ). С каждой стороны используйте общий праймер (красный), который отжигает вне руки гомологии. Используйте его с соответствующим парным праймером, который дополняет эндогенную последовательность, охватывая область гомологии (синий), для проверки аллеля дикого типа. Используйте другой парный праймер, дополняющий вставленную резистентную кассету (см. Праймеры в разделе2.3), чтобы проверить желаемую мутацию.
- (Рекомендуется) Проверьте набор праймеров с использованием клеточного лизата из исходной выбранной популяции массивных клеток, так как он будет содержать смесь как WT, так и мутантных аллелей ( рисунок 2D ).
- Подготовьте следующую реакционную смесь:
Клеточный лизат 0,5 мкл Буфер 10x KOD 1,25 мкл 25 мМ MgSO4 0,75 мкл 2 мМ dNTP 1,25 мкл 10 мкМ Прямой праймер 0,375 мкл 10 мкМ Обратный праймер 0,375 мкл Полимераза KOD 0,25 мкл вода 7,75 мкл - Используйте следующие условия термоциклов: 95 ° C в течение 2 минут (95 ° C в течение 20 с, Primer Tm в течение 10 с, 70 ° C в течение 20 с / кб) повторите в течение 25 циклов.
- Визуализируйте продукт ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
- Повторите тестирование ПЦР колонии для каждой стороны прогнозируемой интеграции. Выбирайте и расширяйте кандидатов, которые показывают наличие интеграции и отсутствие продукта эндогенной последовательности для удаленной области.
- Подтвердите позитивные кандидаты вестерн-блот и / или RT-qPCR.
- Собирайте лизат клеток с помощью набора для подготовки ДНК (см. Таблицу материалов ).
8. Проверьте геномную мутацию путем секвенирования
- Выделение геномной ДНК из мутантных клеточных линий путем экстракции фенольным хлороформом 31 .
- ПЦР амплифицируют целевую область sgRNA, используя праймеры с 5'-выступами, которые добавляют сайты рестрикции BsaI к каждому концу.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для клонов, отредактированных с помощью HDR, где оба аллеля могут быть идентичными, продукт ПЦР можно секвенировать напрямую, - Клонировать амплифицированную область в pUC19-BsaI путем клонирования Golden Gate.
- Превратите реакционную смесь в компетентный штамм E.coli .
- ДНК плазмиды Miniprep из 6-10 отдельных колоний и последовательность клонированной области с помощью секвенирования Сангера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для генерации линий нокаута ELAVL1 было доступно надежное антитело, поэтому было выполнено редактирование с использованием одиночных sgRNAs ( рис. 1A , слева), а затем точечный иммуноблот. Три sgRNAs трансфицировали независимо, чтобы сравнить эффективность и исключить целевые эффекты в полученных клонах. После сбора и промокания клеточных лизатов из клональных популяций на две нитроцеллюлозные мембраны, пятна были исследованы как для ELAVL1, так и для PUM2 (как контроль нормализации) ( рисунок 2A ). Количественное отношение сигнала ELAVL1 к PUM2 продемонстрировало очень широкий диапазон> 10 4 -кратный среди изолированных линий ( рис. 2B ). Используя это соотношение в качестве критерия выбора, мы проверили несколько строк, используя вестерн-блоты ELAVL1 ( рисунок 3A ). В большинстве случаев клональные популяции с самым низким относительным сигналом ELAVL1 былиПравильно идентифицированных как нокауты ( рисунок 2B ), подтверждающие прогностическую способность этой количественной оценки (несмотря на значительную изменчивость в контрольном сигнале, который, вероятно, возникал из-за различного количества собранных клеток). Напротив, большинство клонов с промежуточными отношениями отображали сигнал ELAVL1 после проверки, потенциально представляя события моноаллельного удаления. Однако не наблюдалось общего уровня отношения к WT, моноаллельным и полным (биаллельным) пулам мутантов, и даже ELAVL1-положительные клоны демонстрировали широкий и непрерывный диапазон уровней, вероятно, из-за клональной изменчивости экспрессии. Общая эффективность генерации нокаута ELAVL1 с использованием этого метода составляла от 6 до 36% среди sgRNA.
Для других генных мишеней (таких как PUM2) качество доступных антител предотвращает точный скрининг клонов-кандидатов с помощью дот-блоттинга из-за высокого фона из кросс-реактивовVity. Кроме того, эффективность нацеливания на некоторые геномные локусы может быть значительно ниже из-за доступности хроматина. В таких случаях подход, зависящий от выбора, подходит для повышения эффективности. Две sgRNAs, нацеленные на ранние и поздние кодирующие области PUM2, были подвергнуты трансплантации с помощью гомологического шаблона восстановления, чтобы вырезать 45 кб геномной ДНК и заменить ее на кассету резистентности к неомицину ( рис. 1A , справа). Сборка шаблона гомологии проиллюстрирована на рисунке 1B . ПЦР-праймеры были сконструированы для усиления областей вокруг рук гомологии на основе успешной или неудачной интеграции резистентной кассеты ( рис. 2C ) и были протестированы на нетрансфецированных и выделенных клетках (слева). Как и ожидалось, в нетрансфицированных клетках наблюдался только ампликон, соответствующий эндогенному состоянию (верхний), тогда как в объемных отобранных клетках наблюдались ампликоны из обоихДикого типа и мутантных аллелей. Лизаты клеток из сгенерированных клональных кандидатов собирали и подвергали скринингу на присутствие как эндогенной последовательности, так и резистентной кассеты. Кандидаты нокаутов были идентифицированы наличием только одного усилителя кассеты сопротивления, что указывает на двуаллельную делецию / интеграцию ( рис. 2D , звезды). Также наблюдались клоны с моноаллельными вставками и были довольно распространены, поскольку такие популяции также могут выжить в процессе отбора. Эти клоны были обозначены наличием как эндогенной последовательности, так и резистентной кассеты. В некоторых случаях наблюдались также клональные дикие типы в тестируемом локусе, предполагая, что случайная, не связанная с sgRNA геномная интеграция шаблона восстановления, направленного на гомологию, происходит с низкой частотой. Биаллельные мутантные линии были дополнительно подтверждены вестерн-блоттингом ( фиг. 3В ). Общая эффективность генерации нокаута с использованием процедуры HDR составляла 33%.
Рисунок 1: Рабочий процесс для генерирования CRISPR-опосредованных нокаутов в клеточных линиях млекопитающих. ( A ) События редактирования генома, полученные расщеплением CRISPR / Cas9, и NHEJ (слева) или HDR (справа). Участок расщепления Cas9 обозначается белой вертикальной линией. ( B ) Компоненты и сборка плазмиды шаблона HDR. Рестрикционные ферменты типа II, используемые в клонировании Golden Gate, такие как BsaI, распознают асимметричную последовательность ДНК и оставляют ступенчатый разрез вне последовательности распознавания, что позволяет создавать произвольные перекрывающиеся сегменты для сборки (на фото). Стрелки указывают положение праймера, чтобы проверить правильность сборки плазмиды. ( C ) Рабочий процесс: после трансфекции (и при выборе лекарственного средства, если применимо) клетки высевают при предельных разведениях в 96-луночных планшетах. Клональные популяцииЭкранируются либо точечным иммуноблоттом (независимым от выбора, NHEJ), либо PCN колонии (зависит от выбора, HDR). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Скрининг кандидатов на выбивание линий с помощью точечных блоков или колонии PCR. ( A ) Точечный иммуноблот из изолированных ELAVL1-нацеленных клонов с ELAVL1-антителом (слева) и отдельно с антителом для контрольного белка Pum2 (справа). Клоны, которые отображают мало управляющего сигнала, вероятно, из-за низких количеств входного белка, отмечены X и исключены из дальнейшего анализа. Клоны с низким сигналом ELAVL1 (круги) дополнительно тестировали вестерн-блотами, которые подтверждали (зеленые) или недействительные (серые) кандидаты. ( B ) Количественная оценка KO cAndidates от дот-блоттинга. Соотношения ELAVL1 для контроля белка в дот-блоттинге, показанного в A, в порядке возрастания. ( C ) Конструкция праймера для тестирования нокаута / вставки через колониевую ПЦР. Праймер, комплементарный геномному локусу вне области области гомологии (красный), соединен с праймером, дополняющим эндогенную последовательность (синий) или к резистентной кассете (зеленый), зондированию для неотредактированного состояния или событию удаления / вставки , Соответственно. Отдельные пары праймеров предназначены для проверки обеих сторон интеграции. ( D ) Пример агарозного геля результатов ПЦР колонии с использованием праймеров, охватывающих восходящее интегральное соединение, с использованием эндогенных внутренних праймеров (сверху) и выбивания внутри праймеров (снизу). Грунты сначала проверяются как в родительских клетках T-REx293, так и в выделенных клетках (слева). Индивидуальные клон-кандидаты (средний) и ожидаемые полосовые схемы для клонов WT, KO и моноаллельной делеции (WT / KO) (справа). Клонки с нокаутом Biallelic указываютD звездой. Правильные продукты амплификации обозначены черными стрелками. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Проверка кандидатов с нокаутом по Вестерн-блоту. ( A ) Вестерн-блот для ELAVL1 (верхний) поднабора клонов, идентифицированных с помощью точечного блоттинга. PUM2 был промокали на той же мембране, что и контроль загрузки (снизу). ( B ) Вестерн-блоттинг для PUM2 (вверху) подмножества клонов, идентифицированных колониевой ПЦР. GAPDH удаляли на той же мембране, что и контроль загрузки (снизу). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Система CRISPR / Cas9 позволила обеспечить эффективную генерацию стабильных геномных модификаций, которые обеспечивают более последовательную альтернативу другим способам временного манипулирования. Здесь мы представили два метода быстрой идентификации нокаутов гена CRISPR / Cas9 в клеточных линиях млекопитающих. Оба метода требуют небольшого клеточного материала, поэтому тестирование может быть выполнено на ранних стадиях клоновой культуры, экономя время и реактивы. Чтобы повысить эффективность обоих методов, мы рекомендуем тестировать несколько sgRNAs, так как эффективность варьируется в зависимости от последовательности и геномного положения. Кроме того, использование множественных sgRNAs полезно для выявления внецелевых эффектов путем обнаружения фенотипов выброса в результате мутаций в нецелевых генах. Эффективная трансфекция и расщепление Cas9 значительно повысят шансы на создание нокаутов. Альтернативно, трансфекцию клеток непосредственно с помощью коммерчески источников sgRNA / Cas9 рибонуклеопротеиновых комплексов 32 ,33 может ускорить протокол и снизить эффекты вне цели.
Точечные пятна хорошо подходят для оценки выпадения белка, вызванного небольшими геномными изменениями из-за NHEJ. Так как требуется только одна конструкция sgRNA / Cas9, этот подход может быть самым быстрым в получении нулевых линий, а процедура блота обходит дополнительные шаги, ускоряя скрининг. Нормализованный сигнал белка иммуноблота служит надежным предиктором успешной проверки ( рисунок 2B ). Этот протокол идеально подходит для генерации нокаутов с минимальным геномным возмущением. Альтернативно, этот способ скрининга может быть адаптирован для зондирования для добавления или модификации белка, такого как трансгенные белки или теги белка. Однако для этого метода скрининга требуется антитело с высокой специфичностью к интересующему белку, поскольку перекрестная реактивность приводит к высокому фону в точечных блотах. Этот метод, естественно, ограничен мутациямиКодирующих белок, поскольку конечный выход зависит от наличия / отсутствия белкового продукта. Важно также отметить, что мутации, вызванные NHEJ, могут приводить к различным белкам, включая белок с конститутивно активной, частичной или доминирующей отрицательной функцией или функциональный белок, не содержащий эпитоп антитела обнаружения. Чтобы свести к минимуму эти проблемы, полезно как можно скорее нацелить срез Cas9 на раннюю стадию кодирования, чтобы увеличить шансы генерации полностью нефункционального белка. Кроме того, нацеливание на геномные области, которые менее доступны для механизма Cas9, может давать низкие результаты удаления при отсутствии селекции. Наконец, нокауты, которые придают избирательный недостаток, могут быть трудно получить по этому методу по аналогичным причинам.
Использование механизмов восстановления, связанных с гомологией, вместе с расщеплением CRISPR / Cas9 позволяет значительно увеличить и более специфичные геномные манипуляции, которые могут включать как laRge scale (выделены двумя расщеплениями sgRNA) и вставками. Поскольку необходимо провести два события расщепления и точный процесс ремонта, интеграция маркера лекарственной устойчивости существенно увеличивает выход нокаута с использованием этого метода. Несмотря на то, что детектирование точечного пятна также может быть использовано, скрининг с помощью ПЦР колонии в более общем случае применим для точного определения правильных кандидатов на интеграцию / выбивание с такими большими геномными нарушениями. Кроме того, тестирование с помощью ПЦР позволяет идентифицировать клоны с несовершенной и неполной интеграцией, которые могут дать представление о масштабах и характере самого процесса HDR. Кроме того, введенный маркер может быть впоследствии удален (путем кратковременной экспрессии Cre или добавления в мембранно-проницаемой форме), оставляя минимальный рубеж удаления 34 pp (сайт loxP) и позволяя повторное использование маркера выбора в будущем. Гибкость этого подхода возрастает с использованием нескольких маркеров сопротивления, позволяющих генерировать несколько кумуИшемического белка. При применении этого метода важно, чтобы отсутствие продукта было дополнительно подтверждено, например, RT-qPCR ожидаемого транскрипта. Поскольку этот экран может быть независимым от антитела, этот метод легко применяется к нокаутам белка без надежного антитела, а также для обнаружения изменений, которые не попадают в гены, кодирующие белок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Гисселу Санчесу, Меган Ли и Джейсону Эстепу за экспериментальную помощь, а также Вайфэн Гу и Сюэми Чэнь за обмен реагентами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
