Summary
Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.
Abstract
Das CRISPR / Cas9 Genom Engineering System hat die Biologie revolutioniert, indem es genaue Genombearbeitung mit wenig Aufwand ermöglicht. Geleitet von einer einzigen Guide-RNA (sgRNA), die Spezifität verleiht, spaltet das Cas9-Protein beide DNA-Stränge am Zielort. Der DNA-Bruch kann entweder nicht-homologe Endverbindungen (NHEJ) oder Homologie gerichtete Reparatur (HDR) auslösen. NHEJ kann kleine Deletionen oder Insertionen einführen, die zu Frame-Shift-Mutationen führen, während HDR größere und präzisere Störungen ermöglicht. Hier präsentieren wir Protokolle zur Erzeugung von Knockout-Zelllinien durch Kopplung von etablierten CRISPR / Cas9-Methoden mit zwei Optionen für die nachgeschaltete Auswahl / Screening. Der NHEJ-Ansatz nutzt eine einzelne sgRNA-Cut-Stelle und selektionsunabhängiges Screening, bei der die Proteinproduktion durch Dot-Immunoblot in einer Hochdurchsatz-Weise beurteilt wird. Der HDR-Ansatz verwendet zwei sgRNA-Cut-Stellen, die das Gen von Interesse überspannen. Zusammen mit einer bereitgestellten HDR-Vorlage kann diese Methode eine Löschung erreichenVon zehn kb, unterstützt durch die eingefügte wählbare Widerstandsmarkierung. Die entsprechenden Anwendungen und Vorteile jeder Methode werden diskutiert.
Introduction
Stabile genetische Veränderungen bieten einen Vorteil gegenüber transienten Methoden der zellulären Störung, die in ihrer Effizienz und Dauer variabel sein können. Die genomische Bearbeitung ist in den letzten Jahren aufgrund der Entwicklung von zielspezifischen Nukleasen, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 immer häufiger geworden Und RNA-geführte Nukleasen, die aus dem geclusterten, regelmäßig verteilten kurzen palindromischen Wiederholungssystem (CRISPR) 10 gewonnen wurden .
Die CRISPR / Cas9-Bearbeitungsmaschinen werden von einem Immunsystem angepasst, das Bakterien und Archaea zur Verteidigung gegen Virusinfektionen verwendenAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In diesem Prozess werden kurze, 20-30 nt-Fragmente der eindringenden Virussequenz in einen genomischen Locus als "Spacer" eingebaut, die von den Wiederholungseinheiten 14 , 15 flankiert sind. Nachfolgende Transkriptions- und RNA-Verarbeitung erzeugt kleine CRISPR-assoziierte RNAs 16 (crRNAs), die zusammen mit einer transaktivierenden crRNA 17 (tracrRNA) mit der Effektor-Cas9-Endonuklease zusammensetzen. Die crRNAs bieten somit eine Spezifität für das Cas9-Targeting, die den Komplex leitet, um komplementäre virale DNA-Sequenzen zu spalten und weitere Infektionen zu verhindern 18 , 19 . Jede "Protospacer" -Sequenz in der Ziel-DNA kann als Quelle der crRNA dienen, solange sie direkt 5 'zu einem kurzen Protospacer benachbarten Motiv (PAM), NGG im Fall von S. pyogenes Cas9 ist 21 geladen wurde.
Bei der Expression von Cas9 und einer sgRNA in eukaryotischen Zellen spaltet das Cas9-Protein beide DNA-Stränge am Zielort. In Abwesenheit einer geeigneten Region der homologen Sequenz fixiert die Zelle diesen Bruch über eine nicht homologe Endverbindung (NHEJ) 22 , 23 , 24 , die typischerweise kleine Deletionen oder selten Insertionen einführt. Bei der Ausrichtung auf eine offeneLeserahmen, führt die Reparatur wahrscheinlich zu einer translationalen Frameshift, die ein nicht-funktionelles Proteinprodukt produziert. Im Gegensatz dazu kann die Zelle, wenn sie mit einer exogenen Schablone mit großen Regionen der Homologie versehen ist, die doppelsträngige Pause durch homologisch gerichtete Reparatur 25 , 26 fixieren. Dieser Weg ermöglicht größere präzise Deletionen, Ersetzungen oder Insertionen im Genom, gepaart mit der Einführung von ausfahrbaren Selektionsmarkern 27 .
Hier stellen wir Protokolle zur Erzeugung von Knockout-Zelllinien durch eine dieser beiden CRISPR / Cas9-Verfahren vor (Abbildung 1A ). Der NHEJ-Ansatz nutzt eine einzelne sgRNA-Cut-Site und selektionsunabhängiges Screening und erfordert daher eine geringe Vorwärtspräparation. Bei der Verwendung dieser Methode müssen RNAs, die komplementär zu Exons in der Nähe des 5'-Endes des Transkripts sind, die am ehesten ein Knockout produzieren, entworfen werden. Seit dem modifikatIonen zum Genom in diesem Fall sind klein, das Screening auf Knockout-Klone basiert auf Punkt-Blots, wo das Protein-Produkt in einer Hochdurchsatz-Weise beurteilt wird. Wir verwenden die Generation von ELAV-ähnlichen 1 Protein (ELAVL1) Knockout Linien als Beispiel. Der zweite Ansatz beruht auf homologisch gerichteter Reparatur (HDR) und verwendet zwei sgRNA-Cut-Stellen, die das Gen oder die Region von Interesse überspannen, was eine Deletionen von zehn kb ermöglicht. Ein Plasmid mit zwei Regionen der Homologie, die die Spaltstellen flankieren, liefert eine Ersatzschablone (Abbildung 1B ), die einen wählbaren Resistenzmarker einführt, der die Effizienz der Knockout-Erzeugung erhöht. Diese Methode kann auch angepasst werden, um Genmodifikationen mit richtig entworfenen Homologiearmen einzuführen. In diesem Fall ermöglicht die Integration eines neuen DNA-Fragments ein PCR-basiertes Screening (Abbildung 1C ). Hier verwenden wir die Generierung von Pumilio RNA Bindung Familienmitglied 2 (PUM2) Knockout Linien als Beispiel.
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Protocol
1. Identifizierung von Homologieregionen um die gewünschte Löschung
HINWEIS: Nur bei selektionsbasierter Bearbeitung erforderlich.
- Wähle zwei Regionen, anfänglich 1,5-2 kb, auf beiden Seiten des gewünschten Löschorts, die als Homologiearme in der HDR-Schablone dienen (Abbildung 1A ). Identifizieren Sie Regionen, die BsaI-Erkennungsstellen auf beiden Strang (GGTCTC) fehlen, um das Klonen zu erleichtern. Wenn BsaI-Stellen unvermeidbar sind, verwenden Sie ein alternatives IIs-Restriktionsenzym (BsmBI, SapI, BbsI) und modifizieren die entsprechenden Stellen im Empfängerplasmid (pUC19-BsaI), Resistenzmarker-Donor-Plasmid (pGolden-Neo oder pGolden-Hygro) und Homologie Arm PCR Produkt Überhänge.
2. Erzeugung von Cas9-sgRNA-Expressionsplasmiden
- Definiere die Zielstelle (n) für die Mutagenese. Für die Single-Cut, Selektions-freie Methode, Ziel 5 'proximale Codierung Exons, um die Wahrscheinlichkeit einer Nicht-FU zu erhöhenNationale Mutation. Für die Zwei-Cut-Methode, wählen Sie zwei Standorte, die so viel von dem Gen wie nötig überspannen.
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung werden Löschungen bis zu 53 kb effizient erstellt. - Geben Sie 200 bis 300 bp der Ziel-Sequenz in das crispr.mit.edu-Design-Tool ein. Zur selektionsbasierten Klonierung verwenden Sie 200-300 bp der identifizierten Homologieregionen, die proximal zum Deletionsort sind (Abbildung 1A ). Wählen Sie 2-3 der höchstrangigen sgRNAs pro Zielregion aus, um Unterschiede in ihrer Aktivität zu berücksichtigen und unabhängige Klone zu isolieren, die nicht die gleichen potentiellen Off-Target-Effekte teilen.
- Um duplexierte Oligonukleotide mit geeigneten Überhängen für die Insertion in das Expressionsplasmid zu entwerfen, weglassen sie die endgültige PAM-Sequenz (NGG) und hängen einen 5'-CACC-Überhang an, gefolgt von einem G zum Top-Strang-Oligo. Für den unteren Strang-Oligo, hängen Sie einen 5'-AAAC-Überhang auf die umgekehrt-ergänzte Zielsequenz, gefolgt von einem 3'-C, als ilLustriert unten:
- Insert synthetische Oligonukleotide entsprechend den sgRNAs in das pSpCas9 (BB) Plasmid unter Verwendung der Golden Gate Klonierung 28, wie in dem Zhang Laborprotokoll 29 beschrieben.
3. Erzeugung von Homologie-gerichteten Reparatur-Template-Plasmiden
HINWEIS: Nur bei selektionsbasierter Bearbeitung erforderlich. Das homologiegesteuerte Reparaturschablonenplasmid besteht aus einer Arzneimittelresistenzkassette, die von zwei Regionen flankiert ist, die komplementär zum Genom gerade außerhalb der beiden sgRNA-Zielstellen sind ( 1B ).
- Aus den in Schritt 1.1 identifizierten breiteren Homologie-Regionen wählen Sie 800-1000 bp 26 nicht mehr als 5-10 bp weg von den entworfenen Cas9-Schnittorten, um als Homologie-Arme zu dienen (Abbildung 1A ). Achten Sie darauf, die sgRNA nicht einzuschließenZiel-Site und seine PAM in der Homologie Arme, da dies wird dazu führen, dass CRISPR / Cas9 Spaltung der Vorlage Plasmid selbst. Wenn die Homologiearme interne BsaI-Standorte enthalten, verwenden Sie alternative sgRNA-Stellen.
- PCR amplifiziert Homologiearme aus genomischer DNA unter Verwendung einer hochauflösenden DNA-Polymerase nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern mit einer zusätzlichen 5'-Sequenz, die BsaI-Stellen (GGTCTC) und einzigartige Überhänge an beiden Enden der Homologieregion einführt. Die Überhänge müssen korrekte Sequenzen enthalten, um eine korrekte Montageordnung und Orientierung zu erzeugen, wie unten beschrieben (Abbildung 1B ):
Linker Homologiearm FP-Überhang: 5 'GGGTCTCA GGCC
Linker Homologiearm RP-Überhang: 5 'GGGTCTCT CACG
Recht Homologie Arm FP Überhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
Recht Homologie Arm RP Überhang: 5 'GGGTCTCT CCAC - Überprüfen Sie die Homologiearme für den entsprechenden VerstärkerÜber die Gelelektrophorese vor dem Fortfahren.
- Montieren Sie die rechte und linke Homologiearmregionen mit der Resistenzkassette in ein HDR Template Plasmid von Golden Gate Cloning 28 . Verwenden Sie pGolden-Neo oder pGolden-Hygro-Plasmide 30 als Quelle für loxP-flankierte Resistenzkassetten (loxP-PGK-Neo-pA-loxP oder loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Verwenden Sie pUC19-BsaI, ein modifiziertes pUC19 mit BsaI-Stellen in der multiplen Klonierungsregion und eliminiert BsaI-Stellen an anderer Stelle als den Empfängervektor (auf Anfrage erhältlich). Verwenden Sie für die drei Einsätze und den Vektor ein Verhältnis von 1: 1: 1: 1.
- Vorbereitung der folgenden Reaktionsmischung 30 :
Richtige Homologie Arm PCR Produkt 0,06 pmol (30-40 ng) Linkes Homologiearm PCR Produkt 0,06 pmol (30-40 ng) PGolden-Neo-Plasmid (100 ng / & mgr; l) 1 &# 181; L PUC19-BsaI-Plasmid (100 ng / & mgr; l) 1 & mgr; l 2x T7 DNA-Ligasepuffer 5 & mgr; l BsaI (10 U / & mgr; l) 0,75 & mgr; l T7-DNA-Ligase (3000 U / & mgr; l) 0,25 & mgr; l Wasser Bis zu 10 μl - Verwenden Sie folgende Thermocycler-Parameter: 37 ° C für 5 min, 20 ° C für 5 min. Wiederholen Sie für 30 Zyklen.
- Behandeln Sie das Klonprodukt mit einer Exonuklease nach den Anweisungen des Herstellers, um jede verbleibende linearisierte DNA zu verdauen.
- Umwandlung der Reaktionsmischung in einen kompetenten E. coli- Stamm gemäß dem mit den Zellen gelieferten Protokoll und Platte auf Ampicillin-haltigen Schalen.
- Vorbereitung der folgenden Reaktionsmischung 30 :
- Um Klone mit der richtigen Schablonenanordnung zu identifizieren, Bakterien ausführenAl Kolonie PCR, um die Homologiearm-Teilbereiche des zusammengebauten Einsatzes zu verstärken (da der gesamte Einsatz zu groß sein kann, um zuverlässig zu verstärken). Verwenden Sie eine Primerglühung für die flankierende Plasmidsequenz und einen zweiten Primer, der komplementär zum Rand der Resistenzkassette ist (Abbildung 1B , die Sequenz ist sowohl für Neo- als auch Hygro-Insertionen üblich), wodurch ein assemblierungsabhängiges Produkt erzeugt wird, das etwa 200 bp länger ist als Der enthaltene Homologiearm:
PUC19-Bsal-Links: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Widerstand-Links: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-rechts: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Widerstands-rechts: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Pick-Bakterien-Kolonien mit sterilen Zahnstochern und suspendieren die Bakterien in 20 μl Wasser. Bei 95 ° C für 15 min erhitzen und in einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 5 min abreiben. Legen Sie sofort auf Eis.
- Vorbereitung der folgenden PCR-Mischung 31 </ Sup>:
Kolonievorlage verdünnen 1,25 & mgr; l 10x Taq-Reaktionspuffer 1,25 & mgr; l 20mM dNTPs 0,25 & mgr; l 10 μM Vorwärtsprimer 0,25 & mgr; l 10 μM Rückwärtsprimer 0,25 & mgr; l Taq-Polymerase 0,25 & mgr; l Wasser 9 & mgr; l - Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Parameter: 95 ° C für 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min / kb), wiederholen Sie für 25 Zyklen, 72 ° C für 2 min.
- Kontrollieren Sie das PCR-Produkt auf korrekte Amplikongröße durch Agarose-Gelelektrophorese.
- Optional können Miniprep-Plasmid-DNA aus einzelnen Kolonien mit korrekter Insert-Größe und Sequenz thE-Homologie-Armregionen durch Sanger-Sequenzierung mit den oben erwähnten Amplifikations-Primern.
4. Transfektion von CRISPR-Komponenten in kultivierte Zellen
- Vor der Transfektion: Kultur-T-REx293-Zellen in DMEM-Medien, ergänzt mit 10% FBS bei 37 ° C und 5% CO 2 .
- Tafeln Sie Zellen auf 6-Well-Platten und wachsen auf etwa 70% Konfluenz. Füge einen Brunnen für eine untransfizierte Kontrolle ein.
- Transfektion von Zellen mit 2,5 μg Gesamtplasmid unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsprotokolls. Parallel dazu die untransfizierte Kontrolle beibehalten.
HINWEIS: Transfektionsmethode und Effizienz variieren je nach Zelltyp. Bestimmen Sie die geeignete Transfektionsmethode für das System vor dem Experiment.- Für die Transfektion von Zellen mit Selektion verwenden Sie 0,75 μg Cas9-sgRNA 1 (links geschnitten), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (rechts geschnitten) und 1,0 μg homologe Rekombinationsschablone.
- Für transfectiVon Zellen ohne Selektion, verwenden Sie 2,5 μg Cas9-sgRNA Plasmid.
5. Drug Selection
- 48 h nach der Transfektion behandeln die Zellen mit dem entsprechenden Medikament (Neomycin / Hygromycin). Führen Sie die Selektion durch, bis alle Zellen in der nicht transfizierten Kontrolldüse (typischerweise 3-5 Tage für Neo, 7-14 Tage für Hygro).
HINWEIS: Verwenden Sie Konzentrationen von 500 μg / ml und 10 μg / ml für Neomycin bzw. Hygromycin für T-REx293-Zellen. Für andere Zelltypen kann es nützlich sein, eine vorherige Titration des Arzneimittels auf nicht transfizierten Zellen durchzuführen, um die wirksame Konzentration zu bestimmen.
6. Isolierung von Klonpopulationen
- Wachsen Sie Zellen zu 100% Konfluenz in der ursprünglichen gut nach Auswahl. Seed-Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 0,33 Zellen pro Vertiefung.
HINWEIS: Das Samen von drei Platten mit 96 Vertiefungen ist ein guter Ausgangspunkt, um die Isolierung von mehr als einem korrekten Klon zu gewährleisten, aber mehr oder weniger kann erforderlich seinEnden auf sgRNA und HDR effizienzen. - Beobachten Sie Kolonien über einen Zeitraum von 2-4 Wochen, bis Kolonien für das Auge sichtbar sind. Sehe sichtbare Kolonien mit einer sterilen Pipettenspitze auf und setze in neuen Brunnen ein, um das Monolayer-Wachstum zu fördern. Bei der Verwendung von Suspensionszellen können sogar niedrigere Saatdichten verwendet werden, um einen größeren Anteil an Einzelkolonien-Vertiefungen zu gewährleisten.
7. Screening Kandidaten
- Screening Kandidaten ohne die Verwendung von Auswahl: Dot Blot
- Wachsen Sie einzelne Klone zu 50-100% Konfluenz. Die Monoschicht der Zellen durch Pipettieren innerhalb des Brunnens auslöschen
- Aliquotieren Sie 90 μl des 100 μl Gesamtvolumens zu einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen. 5 Minuten lang bei 6000 U / min abspülen, Medium entfernen und Zellpellet in 10 μl 1x Lysepuffer oder 1x SDS-Beladungspuffer (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% Bromphenolblau, 40% Glycerin, 100 mM DTT). Fügen Sie 90 μl neue Medien in den Rest der Zellen in der welIch bleibe weiter fortpflanzen.
- 1 & mgr; l Zelllysat auf eine trockene Nitrozellulosemembran pipettieren, um einen Punkt zu bilden. Blot jede Probe zweimal auf zwei getrennten Membranen, die Schaffung von zwei identischen Muster von Proben.
- Blockieren Sie die Membranen in 5% Milch in TBST (Tris gepufferte Salzlösung + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris-Base, bis zu 1 l destilliertem Wasser, pH 7,4) 31 für 1 h bei Raumtemperatur ( Mit Schaukeln, hier und während des ganzen Verfahrens).
- Blot unter Verwendung des primären Antikörpers gegen das Zielprotein auf einer Membran und der primäre Antikörper für ein Kontrollprotein (Tubulin, GAPDH oder irgendein anderes Protein, das sich nicht ändern wird) auf der anderen Seite. Verwenden Sie die empfohlene primäre Antikörperverdünnung (0,2 μg / ml für ELAVL1 und 0,1 μg / ml für Pum2 in diesem Fall) in TBST + 5% Milch. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- 3 mal mit TBST für 5 min waschen.
- Inkubieren Sie jede Membran mit einem geeigneten HRP-konjugierten sekundären Antikörper in TBST + 5% Milch für 1 h bei Raumtemperatur.
- 3 mal mit TBST für 5 min waschen.
- Die Chemilumineszenz-Substratlösung (siehe Werkstofftabelle) nach den Anweisungen des Herstellers auftragen und die blotted Membran auf einen digitalen Chemilumineszenz-Imager auftragen.
- Quantifizierung der Punktintensitäten für die Ziel- und Kontrollproteine mit der entsprechenden Software.
- Eliminieren Sie Kandidaten mit niedrigem Kontrollproteinsignal und berechnen Sie Hintergrund-subtrahierte Verhältnisse von Ziel, um Proteinintensitäten für die verbleibenden Kandidaten zu kontrollieren. Wählen Sie die Kandidaten mit den niedrigsten Verhältnissen für Passage und weitere Validierung durch Western Blot.
- Screening Kandidaten mit der Verwendung von Auswahl: Kolonie PCR
- Sammle das Zelllysat unter Verwendung eines DNA- Präparats (siehe Materialtabelle ).
- Duplizieren Sie einzelne Kolonien in einem neuen 96 Brunnen und wachsen bis 100% Konfluenz.
- Medien aus einem Satz der Klone entfernen, aNd die Zellen in 30 μl Extraktionspuffer aus dem Kit resuspendieren. Überführung in ein sauberes 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Die Lösung 15 Minuten lang auf 96 ° C erhitzen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Füge 30 μl Stabilisierungspuffer aus dem Kit hinzu. Gut mischen.
- Identifizierung von Wildtyp- und Monoallelic / Biallelic-Mutantenlinien durch Kolonie-PCR.
- Entwerfen Sie zwei getrennte Sätze von PCR-Primern (für die linke und rechte Seite des Zielortes), um Regionen um die Homologiearme zu verstärken, die entweder auf einer erfolgreichen oder erfolglosen Integration der Widerstandskassette basieren (Abbildung 2C ). Auf jeder Seite eine gemeinsame Grundierung (rot) verwenden, die außerhalb des Homologiearms anhebt. Verwenden Sie es mit einem entsprechenden gepaarten Primer, der komplementär zur endogenen Sequenz ist, die den Homologiebereich (blau) überspannt, um das Wildtyp-Allel zu testen. Verwenden Sie einen anderen gepaarten Primer, komplementär zur eingesetzten Resistenzkassette (siehe Primer im Abschnitt2.3), um die gewünschte Mutation zu testen.
- (Empfohlen) Validieren der Primersätze unter Verwendung von Zelllysat aus der ursprünglichen ausgewählten Bulkzellpopulation, da sie eine Mischung aus sowohl WT als auch mutanten Allelen enthält (Abbildung 2D ).
- Vorbereitung der folgenden Reaktionsmischung:
Zelllysat 0,5 & mgr; l 10x KOD Puffer 1,25 & mgr; l 25mM MgSO4 0,75 & mgr; l 2 mM dNTPs 1,25 & mgr; l 10 μM Vorwärtsprimer 0,375 & mgr; l 10 μM Rückwärtsprimer 0,375 & mgr; l KOD-Polymerase 0,25 & mgr; l Wasser 7,75 & mgr; l - Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Bedingungen: 95 ° C für 2 min, (95 ° C für 20 s, Primer Tm für 10 s, 70 ° C für 20 s / kb) Wiederholen für 25 Zyklen.
- Das PCR-Produkt durch Agarose-Gelelektrophorese visualisieren.
- Wiederholen Sie die Kolonie-PCR-Tests für jede Seite der vorhergesagten Integration. Auswählen und Erweitern von Kandidaten, die Vorhandensein von Integration und kein endogenes Sequenzprodukt für die gelöschte Region zeigen.
- Validieren Sie positive Kandidaten durch Western-Blot und / oder RT-qPCR.
- Sammle das Zelllysat unter Verwendung eines DNA- Präparats (siehe Materialtabelle ).
8. Überprüfen Sie die genomische Mutation durch Sequenzierung
- Isolieren Sie genomische DNA aus mutanten Zelllinien durch Phenol-Chloroform-Extraktion 31 .
- PCR amplifizieren die sgRNA-Zielregion unter Verwendung von Primern mit 5'-Überhängen, die BsaI-Restriktionsstellen zu jedem Ende hinzufügen.
HINWEIS: Für Klone, die mit HDR bearbeitet wurden, wo beide Allele identisch sein können, kann das PCR-Produkt direkt sequenziert werden. - Klone die verstärkte Region in pUC19-BsaI durch Golden Gate Klonen.
- Umwandlung der Reaktionsmischung in einen kompetenten E. coli- Stamm.
- Miniprep-Plasmid-DNA aus 6-10 einzelnen Kolonien und Sequenz der klonierten Region durch Sanger-Sequenzierung.
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Representative Results
Für die Erzeugung von ELAVL1-Knockout-Linien war ein robuster Antikörper verfügbar, so dass die Bearbeitung mit einzelnen sgRNAs (Abbildung 1A , links) durchgeführt wurde, gefolgt von Punkt-Immunoblot. Drei sgRNAs wurden unabhängig transfiziert, um die Effizienz zu vergleichen und die Ziel-Effekte in den resultierenden Klonen auszuschließen. Nach dem Sammeln und Blotting von Zelllysaten aus klonalen Populationen auf zwei Nitrozellulosemembranen wurden die Blots sowohl für ELAVL1 als auch für PUM2 (als Normalisierungskontrolle) untersucht (Abbildung 2A ). Das quantifizierte Verhältnis von ELAVL1 zu PUM2-Signal zeigte einen sehr breiten,> 10-fachen Bereich zwischen den isolierten Linien (Abbildung 2B ). Wenn wir dieses Verhältnis als Auswahlkriterium verwenden, haben wir eine Reihe von Zeilen mit ELAVL1-Western-Blots validiert (Abbildung 3A ). In den meisten Fällen waren klonale Populationen mit dem niedrigsten relativen ELAVL1-SignalKorrekt als Knockouts identifiziert (Abbildung 2B ), die die Vorhersagekraft dieser Quantifizierung bestätigt (trotz erheblicher Variabilität des Steuersignals, die wahrscheinlich aus unterschiedlicher Anzahl gesammelter Zellen entstanden ist). Umgekehrt zeigten die meisten Klone mit Zwischenverhältnissen ein ELAVL1-Signal bei der Validierung, was möglicherweise monoallelische Deletionsereignisse darstellt. Jedoch wurde keine allgemeine Abstufung der Verhältnisse zu WT-, monoallelen und vollständigen (biallelic) mutanten Pools beobachtet, und selbst die ELAVL1-positiven Klone zeigten einen breiten und kontinuierlichen Bereich von Niveaus, wahrscheinlich aufgrund der klonalen Variabilität der Expression. Die Gesamteffektivität der ELAVL1-Knockout-Generation mit dieser Methode reichte von 6 bis 36% unter den sgRNAs.
Für andere Gen-Targets (wie PUM2) verhindert die Qualität der verfügbaren Antikörper ein genaues Screening von Kandidaten-Klonen durch Dot-Blot aufgrund eines hohen Hintergrunds von KreuzreaktionenVity Zusätzlich kann die Effizienz der Ausrichtung auf einige genomische Loci aufgrund der Chromatinzugänglichkeit wesentlich geringer sein. In solchen Fällen ist eine selektionsabhängige Methode geeignet, die Effizienz zu erhöhen. Zwei sgRNAs, die auf frühe und späte kodierende Regionen von PUM2 zielen, wurden mit einer homologiegesteuerten Reparaturvorlage cotransfiziert, um 45 kb genomische DNA zu exzimieren und durch eine Neomycinresistenzkassette zu ersetzen (Abbildung 1A rechts). Die Zusammenstellung der Homologievorlage ist in Fig. 1B dargestellt. PCR-Primer wurden entworfen, um Regionen um die Homologiearme zu verstärken, basierend auf entweder erfolgreichen oder erfolglosen Integration der Resistenzkassette ( 2C ) und wurden auf nicht transfizierten und die Bulk-ausgewählten Zellen (linke Tafel) getestet. Wie erwartet, wurde bei nichttransfizierten Zellen nur ein Amplikon, das dem endogenen Zustand (oben) entspricht, beobachtet, während die aus der Masse ausgewählten Zellen Amplikone von beiden zeigtenWildtyp und Mutanten Allele. Zelllysate aus erzeugten klonalen Kandidaten wurden gesammelt und auf das Vorhandensein sowohl der endogenen Sequenz als auch der Resistenzkassette untersucht. Kandidaten-Knockouts wurden durch das Vorhandensein des Resistenzkassetten-Amplicons allein identifiziert, was auf eine Biallel-Deletion / Integration hindeutet (Abbildung 2D , Sterne). Klone mit monoallelen Insertionen wurden ebenfalls beobachtet und waren ziemlich häufig, da solche Populationen auch den Selektionsprozess überleben können. Diese Klone wurden durch die Anwesenheit sowohl der endogenen Sequenz als auch der Resistenzkassette angezeigt. In einigen Fällen wurden auch klonale Wildtypen am getesteten Ort beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine zufällige, nicht-sgRNA-unterstützte genomische Integration der homologiegesteuerten Reparaturvorlage bei einer niedrigen Frequenz auftritt. Biallelic-Mutantenlinien wurden weiter durch Western-Blot validiert (Abbildung 3B ). Die Gesamteffizienz der Knockout-Generation nach dem HDR-Verfahren betrug 33%.
Abbildung 1: Ein Workflow zur Erzeugung von CRISPR-vermittelten Knockouts in Säugetierzelllinien. ( A ) Genombearbeitung von CRISPR / Cas9-Spaltung und NHEJ (links) oder HDR (rechts). Die Stelle der Cas9-Spaltung wird mit einer weißen vertikalen Linie bezeichnet. ( B ) Komponenten und Zusammenbau des HDR-Templatplasmids. Die in der Golden Gate-Klonierung verwendeten Typ-IIs-Restriktionsenzyme, wie BsaI, erkennen eine asymmetrische DNA-Sequenz und hinterlassen einen gestaffelten Schnitt außerhalb der Erkennungssequenz, was die Gestaltung von beliebigen überlappenden Segmenten für die Montage ermöglicht (dargestellt). Pfeile geben die Primerpositionen an, um auf korrekte Plasmidanordnung zu prüfen. ( C ) Arbeitsablauf: Nach der Transfektion (und gegebenenfalls der Arzneimittelauswahl) werden die Zellen bei begrenzenden Verdünnungen in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert. Klonale PopulationenWerden entweder durch Punkt-Immunoblot (selektionsunabhängig, NHEJ) oder Kolonie-PCR (selektionsabhängig, HDR) gescreent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Screening Kandidaten Knockout Linien von Dot Blots oder Kolonie PCR. ( A ) Dot-Immunoblot von isolierten ELAVL1-zielgerichteten Klonen mit ELAVL1-Antikörper (links) und getrennt mit einem Antikörper für ein Kontrollprotein, Pum2 (rechts). Klone, die wenig Steuersignal zeigten, wahrscheinlich aufgrund der niedrigen Input-Protein-Mengen, sind mit einem X markiert und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Klone mit niedrigem ELAVL1-Signal (Kreise) wurden weiter durch Western-Blots getestet, die (grün) oder ungültig (grau) die Kandidaten bestätigten. ( B ) Quantifizierung von KO cAndidates von dot blot Verhältnisse von ELAVL1 zur Kontrolle des Proteinsignals in dem in A gezeigten Punktblot in steigender Reihenfolge. ( C ) Primer Design für Knockout / Insertionstests über Kolonie PCR. Ein Primer, der komplementär zum genomischen Locus außerhalb des Homologiearmbereichs (rot) ist, ist mit einem Primer komplementär zur endogenen Sequenz (blau) oder der Resistenzkassette (grün), dem Sondieren des unedierten Zustands oder einem Deletions- / Insertionsereignis gepaart , beziehungsweise. Separate Primerpaare sind entworfen, um beide Seiten der Integration zu testen. ( D ) Beispiel-Agarose-Gel von Kolonie-PCR-Ergebnissen unter Verwendung von Primern, die den vorgeschalteten Integrationsübergang unter Verwendung von endogenen inneren Primern (oben) und knockout innerhalb Primern (unten) überspannen. Primer werden zuerst in beiden parentalen T-REx293-Zellen und Bulk-ausgewählten Zellen (links) validiert. Individuelle Kandidatenklone (Mitte) und die erwarteten Bandmuster für WT, KO und Monolettlic Deletion (WT / KO) Klone (rechts). Biallelic Knockout Klone sind anzugebenD von einem Stern. Die richtigen Verstärkungsprodukte sind durch schwarze Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Validierung von Knockout-Kandidaten durch Western-Blot. ( A ) Western-Blot für ELAVL1 (oben) einer Teilmenge von Klonen, die durch Dot-Blot identifiziert wurden. PUM2 wurde auf der gleichen Membran wie eine Ladesteuerung (unten) geblottet. ( B ) Western-Blot für PUM2 (oben) einer Untergruppe von Klonen, die durch Kolonie-PCR identifiziert wurden. GAPDH wurde auf der gleichen Membran wie eine Ladesteuerung (unten) geblottet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das CRISPR / Cas9-System ermöglicht eine effiziente Erzeugung stabiler genomischer Modifikationen, die eine konsistentere Alternative zu anderen transienten Manipulationsverfahren bieten. Hier haben wir zwei Methoden zur schnellen Identifizierung von CRISPR / Cas9-Gen-Knockouts in Säugetierzelllinien vorgestellt. Beide Methoden erfordern wenig zelluläres Material, so dass Tests in frühen Stadien der Klonalkultur durchgeführt werden können, spart Zeit und Reagenzien. Um die Effizienz beider Methoden zu erhöhen, empfehlen wir, mehrere sgRNAs zu testen, da die Effizienz je nach Sequenz und genomischer Position variiert. Darüber hinaus ist die Verwendung mehrerer sgRNAs bei der Identifizierung von Off-Target-Effekten durch die Erkennung von Ausreißer-Phänotypen als Ergebnis von Mutationen in nicht-zielgerichteten Genen nützlich. Effektive Transfektion und Cas9-Spaltung erhöhen die Chancen, Knockouts zu erzeugen. Alternativ können die Zellen direkt mit kommerziell hergestellten sgRNA / Cas9-Ribonukleoproteinkomplexen 32 ,33 kann das Protokoll beschleunigen und die off-target-Effekte senken.
Dot-Blots eignen sich gut, um Protein-Knockouts zu beurteilen, die durch die kleinen genomischen Veränderungen durch NHEJ verursacht wurden. Da nur ein einziges sgRNA / Cas9-Konstrukt notwendig ist, kann dieser Ansatz am schnellsten bei der Erlangung von Nulllinien sein, und das Blot-Verfahren umgibt zusätzliche Schritte, um das Screening zu beschleunigen. Das normalisierte Immunoblot-Proteinsignal dient als zuverlässiger Prädiktor für eine erfolgreiche Validierung (Abbildung 2B ). Dieses Protokoll ist ideal für die Erzeugung von Knockouts mit minimaler genomischer Störung. Alternativ kann dieses Verfahren des Screenings an die Sonde zur Proteinaddition oder -modifikation angepasst werden, wie z. B. transgene Proteine oder Proteinmarkierungen. Jedoch erfordert dieses Screening-Verfahren einen Antikörper mit hoher Spezifität für das Protein von Interesse, da die Kreuzreaktivität zu einem hohen Hintergrund in Dot-Blots führt. Diese Methode ist natürlich auf Mutationen ausgerichtetProtein-codierenden Regionen, da die endgültige Ausgabe von der Anwesenheit / Abwesenheit eines Proteinprodukts abhängt. Es ist wichtig, auch zu beachten, dass Mutationen, die durch NHEJ verursacht werden, zu einer Vielzahl von Protein-Ergebnissen führen können, einschließlich eines Proteins mit konstitutiv aktiver, partieller oder dominanter negativer Funktion oder eines funktionellen Proteins, dem das Detektionsantikörper-Epitop fehlt. Um diese Probleme zu minimieren, ist es hilfreich, den Cas9 so schnell wie möglich in den Coding-Bereich zu zielen, um die Chancen zu erhöhen, ein vollständig nicht-funktionelles Protein zu erzeugen. Darüber hinaus können zielgerichtete genomische Regionen, die für die Cas9-Maschinen weniger zugänglich sind, niedrige Deletionsausbeuten in Abwesenheit der Selektion erzeugen. Schließlich können Knockouts, die einen selektiven Nachteil verleihen, durch diese Methode aus ähnlichen Gründen schwer zu erlangen sein.
Die Verwendung von homologiegesteuerten Reparaturmechanismen zusammen mit der CRISPR / Cas9-Spaltung ermöglicht viel größere und spezifischere genomische Manipulationen, die sowohl laRge Skala Deletionen (abgegrenzt durch zwei sgRNA Spaltungen) und Insertionen. Da zwei Spaltungsereignisse und ein präziser Reparaturprozess stattfinden müssen, erhöht die Integration eines Arzneimittelwiderstandsmarkers die Knockout-Ausbeuten mit dieser Methode erheblich. Obwohl eine Dot-Blot-Detektion auch verwendet werden kann, ist das Screening durch Kolonie-PCR allgemeiner anwendbar, um korrekte Integration / Knockout-Kandidaten mit solchen großen genomischen Störungen genau zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Prüfung durch PCR die Identifizierung von Klonen mit unvollständigen und unvollständigen Integrationen, die Einblick in das Ausmaß und die Art des HDR-Prozesses selbst geben können. Zusätzlich kann der eingeführte Marker nachträglich entfernt werden (durch transiente Cre-Expression oder Addition in membranpermeable Form), wobei eine minimale, 34 bp Deletions-Narbe (loxP-Stelle) zurückbleibt und eine zukünftige Wiederverwendung des Selektionsmarkers ermöglicht. Die Flexibilität dieses Ansatzes steigt mit der Verwendung von mehreren Widerstand Marker, so dass die Erzeugung von mehreren cumuLative Protein Knockouts. Bei der Anwendung dieser Methode ist es wichtig, dass die Abwesenheit des Produkts weiter validiert wird, beispielsweise durch RT-qPCR des erwarteten Transkripts. Da dieser Bildschirm antikörperunabhängig sein kann, lässt sich diese Methode problemlos auf Protein-Knockouts ohne robusten Antikörper anwenden sowie Veränderungen erkennen, die nicht in Proteinkodierungsgenen fallen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Gissell Sanchez, Megan Lee und Jason Estep für experimentelle Hilfe und Weifeng Gu und Xuemei Chen für den Austausch von Reagenzien anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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