Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos
Summary
Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.
Abstract
El sistema de ingeniería del genoma CRISPR / Cas9 ha revolucionado la biología permitiendo la edición precisa del genoma con poco esfuerzo. Guiado por una sola guía de ARN (sgRNA) que confiere especificidad, la proteína Cas9 escinde ambas cadenas de ADN en el lugar de destino. La ruptura del ADN puede desencadenar la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ puede introducir pequeñas supresiones o inserciones que conducen a mutaciones de cambio de marco, mientras que el HDR permite perturbaciones más grandes y más precisas. Aquí, presentamos protocolos para la generación de líneas celulares knockout mediante el acoplamiento CRISPR / Cas9 métodos establecidos con dos opciones para la selección / cribado aguas abajo. El enfoque de NHEJ utiliza un único sitio de corte sgRNA y selección independiente de la selección, donde la producción de proteínas se evalúa por punto inmunoblot en un alto rendimiento. El enfoque HDR utiliza dos sitios de corte sgRNA que abarcan el gen de interés. Junto con una plantilla de HDR proporcionada, este método puede lograr supresiónDe decenas de kb, ayudado por el marcador de resistencia seleccionable insertado. Se discuten las aplicaciones y ventajas apropiadas de cada método.
Introduction
Las alteraciones genéticas estables proporcionan una ventaja sobre los métodos transitorios de perturbación celular, que pueden ser variables en su eficacia y duración. La edición genómica se ha vuelto cada vez más común en los últimos años debido al desarrollo de nucleasas específicas para el objetivo, como las nucleasas de zinc-dedo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , nucleasas efectoras semejantes a activadores de transcripción (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 Y ARN-guiado nucleasas derivadas de las agrupadas, regularmente intercaladas palindromic corto repite (CRISPR) sistema [ 10] .
La maquinaria de edición CRISPR / Cas9 está adaptada de un sistema inmunológico que las bacterias y arqueas utilizan para defenderse contra infecciones viralesAsno = "xref"> 11 , 12 , 13 . En este proceso, fragmentos cortos de 20-30 nt de secuencia viral invasora se incorporan en un locus genómico como "espaciadores" flanqueados por unidades repetidas 14 , 15 . La transcripción subsiguiente y el procesamiento de ARN genera ARNs 16 (CRRNAs) asociados a CRISPR pequeños que, junto con un ARNc trans-activador 17 (tracrRNA), se reúnen con la endonucleasa Cas9 efectora. Los CRRNAs, por lo tanto, proporcionar la especificidad de Cas9 orientación, la guía del complejo para escindir secuencias complementarias de ADN viral y la prevención de nuevas infecciones [ 18 , 19] . Cualquier secuencia "protospacer" en el ADN diana puede servir como fuente del CRRNA, siempre y cuando esté directamente 5 'con un motivo adyacente protospacer corto (PAM), NGG en el caso de S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. La ausencia de la secuencia de PAM cerca del espaciador en el locus CRISPR del anfitrión distingue entre el yo y el no-yo, evitando el objetivo del huésped. Debido a su universalidad y flexibilidad, este sistema biológico ha sido poderosamente adaptado para la edición genómica, de tal manera que casi cualquier sitio de ADN PAM adyacente puede ser dirigido. En esta versión, una modificación adicional fundido el crRNA y tracrRNA en un único ARN guía (sgRNA) componente que se carga en el Cas9 proteína [ 21] .
Tras la expresión de Cas9 y un sgRNA en células eucariotas, la proteína Cas9 escinde ambas cadenas de ADN en el locus diana. En ausencia de una región apropiada de secuencia homóloga, la célula fija esta ruptura mediante la unión final no homóloga (NHEJ) 22 , 23 , 24 , que típicamente introduce pequeñas deleciones o, en raras ocasiones, inserciones. Al orientar unaLectura, la reparación conduce probablemente a un desplazamiento de traslación que produce un producto proteico no funcional. Por el contrario, cuando se proporciona una plantilla exógena con grandes regiones de homología, la célula puede fijar la ruptura de doble hebra mediante reparación dirigida por homología 25 , 26 . Esta ruta permite mayores deleciones precisas, sustituciones o inserciones en el genoma, junto con la introducción de marcadores de selección excisable [ 27] .
Aquí, presentamos protocolos para generar knockout líneas celulares por cualquiera de estos dos CRISPR / Cas9 métodos ( Figura 1A ]. El enfoque de NHEJ utiliza un solo sitio de corte sgRNA y selección independiente de la selección, y por lo tanto requiere poca preparación inicial. Cuando se utiliza este método, deben diseñarse RNAs guía complementarios a los exones cerca del extremo 5 'de la transcripción, que son más probables para producir un knockout. Desde la modificaciónIones al genoma en este caso son pequeños, el cribado para los clones knockout se basa en transferencias de punto, donde el producto proteico se evalúa de una manera de alto rendimiento. Utilizamos la generación de líneas de knockout de ELAV-like 1 protein (ELAVL1) como ejemplo. El segundo enfoque se basa en la reparación dirigida por homología (HDR) y utiliza dos sitios de corte de sgRNA que abarcan el gen o región de interés, permitiendo deleciones de decenas de kb. Un plásmido con dos regiones de homología que flanquean los sitios de escisión proporciona una plantilla de reemplazo ( Figura 1B ), introduciendo un marcador de resistencia seleccionable que aumenta la eficiencia de la generación de knockout. Este método también puede adaptarse para introducir modificaciones genéticas con brazos de homología diseñados apropiadamente. En este caso, la integración de un nuevo fragmento de ADN permite el cribado basado en PCR ( Figura 1C ). Aquí, utilizamos la generación de Pumilio RNA vinculante familia miembro 2 (PUM2) knockout líneas como un ejemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema CRISPR / Cas9 ha permitido la generación eficiente de modificaciones genómicas estables, que proporcionan una alternativa más consistente a otros métodos de manipulación transitorios. Aquí, hemos presentado dos métodos para la rápida identificación de CRISPR / Cas9 genes knockouts en líneas de células de mamíferos. Ambos métodos requieren poco material celular, por lo que las pruebas se pueden hacer en las primeras etapas del cultivo clonal, ahorrando tiempo y reactivos. Para aumentar la eficienc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Gissell Sanchez, Megan Lee y Jason Estep por la asistencia experimental, y Weifeng Gu y Xuemei Chen por compartir reactivos.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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