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Genetics

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55903
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

Summary

आनुवंशिक रूप से दैहिक सेल लाइनों में हेरफेर करने की क्षमता में हालिया अग्रिम बुनियादी और व्यावहारिक अनुसंधान के लिए महान संभावनाएं हैं। यहां, हम सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 के लिए दो दृष्टिकोण पेश करते हैं, जिसमें नॉनआउट आउट उत्पादन और स्तनधारी सेल लाइनों में स्क्रीनिंग शामिल है, साथ ही चयन मार्करों के उपयोग के बिना।

Abstract

सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीनोम इंजीनियरिंग सिस्टम ने थोड़ा प्रयास करके सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देकर जीव विज्ञान में क्रांति ला दी है। एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) द्वारा निर्देशित किया गया है जो विशिष्टता प्रदान करता है, कैस 9 प्रोटीन लक्षित लोकस पर डीएनए किलों दोनों को साफ़ करता है। डीएनए ब्रेक या तो गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल हो रहे हैं (एनएचईजे) या समरूपता से संबंधित मरम्मत (एचडीआर)। एनएचईजे लघु विलोपन या सम्मिलन पेश कर सकता है जिससे फ्रेम-पारी में परिवर्तन होता है, जबकि एचडीआर बड़े और अधिक सटीक उलझन के लिए अनुमति देता है। यहां, हम डाउनस्ट्रीम चयन / स्क्रीनिंग के लिए दो विकल्पों के साथ स्थापित CRISPR / Cas9 विधियों को जोड़कर नॉकआउट सेल लाइन बनाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। NHEJ दृष्टिकोण एक एकल एसजीआरएनए कट साइट और चयन-स्वतंत्र स्क्रीनिंग का उपयोग करता है, जहां प्रोटीन का उत्पादन उच्च-थ्रिप्ट तरीके से डॉट इम्यूनोबलॉट द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। एचडीआर दृष्टिकोण दो एसजीआरएनए कट साइट का उपयोग करता है जो ब्याज की जीन को फैलाते हैं। प्रदान किए गए एचडीआर टेम्प्लेट के साथ, इस पद्धति को हटाए जा सकता हैकेबी के दसियों, डाला चयन प्रतिरोध प्रतिरोध मार्कर द्वारा सहायता प्राप्त। प्रत्येक विधि के उपयुक्त अनुप्रयोगों और फायदे पर चर्चा की जाती है।

Introduction

स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन सेलुलर गड़बड़ी के क्षणिक तरीकों पर एक लाभ प्रदान करते हैं, जो उनकी दक्षता और अवधि में चर हो सकता है। 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , झिंक-फिंगर न्यूक्लियोज़ जैसे लक्षित विशिष्ट न्युक्लिअल्स के विकास के कारण हाल के वर्षों में जीनोमिक संपादन तेजी से सामान्य हो गया है, ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे प्रभावकारी न्यूक्लेअसेज़ (टीएएलएन) 6 , 7 , 8 , 9 और आरएनए द्वारा निर्देशित न्यूक्लेयस क्लस्टर किए गए, नियमित रूप से अंतःस्थापित लघु रिल्लींड्रोमिक दोहराव (सीआरआईएसपीआर) प्रणाली 10 से प्राप्त हुए हैं ।

सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 संपादन मशीनरी एक प्रतिरक्षा प्रणाली से जुड़ा है जो बैक्टीरिया और आर्चिया वायरल संक्रमणों से बचाव के लिए उपयोग करती हैगधा = "xref"> 11 , 12 , 13 इस प्रक्रिया में, कम, वायरल अनुक्रम पर हमला करने के 20-30 एनटी टुकड़े एक जीनोमिक बिन्दु में शामिल किए जाते हैं क्योंकि इकाइयों 14 , 15 को दोहराते हुए "स्पेकर्स" निकलते हैं। अनुवर्ती प्रतिलेखन और आरएनए प्रसंस्करण छोटे सीआरआईएसपीआर से जुड़े आरएनए 16 (सीआरआरएनए) को उत्पन्न करता है, कि एक ट्रांस-सक्रिय CRRNA 17 (tracrRNA) के साथ, प्रभावकार कैस 9 एंडोन्यूक्लेज़ के साथ इकट्ठा होता है। सीआरआरएनए इस प्रकार सीएस 9 लक्ष्यीकरण के लिए विशिष्टता प्रदान करते हैं, जटिल वायरल डीएनए दृश्यों को साफ करने और आगे संक्रमण 18 , 1 को रोकने के लिए जटिल मार्गदर्शन करते हैं। लक्षित डीएनए में कोई भी "प्रोटॉस्पासर" क्रम सीआरआरएनए के स्रोत के रूप में सेवा कर सकता है, जब तक कि एस 5 के मामले में एनजीजी एक छोटी प्रोटॉस्पेयर आसन्न आकृति (पीएएम) के लिए सीधे 5 है। 21 में लोड किया गया है।

कैस 9 और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एक एसजीआरएनए की अभिव्यक्ति पर, कैस 9 प्रोटीन लक्षित लोकस पर डीएनए किलों दोनों को साफ़ करता है। मुताबिक़ अनुक्रम के उपयुक्त क्षेत्र की अनुपस्थिति में, सेल गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) 22 , 23 , 24 के माध्यम से इस ब्रेक को हल करता है, जो आमतौर पर छोटे विलोपन का परिचय देता है या, शायद ही कभी, सम्मिलन जब एक खुला लक्ष्यीकरणपढ़ना फ्रेम, मरम्मत की संभावना एक अनुवादक frameshift की ओर जाता है जो एक गैर-कार्यात्मक प्रोटीन उत्पाद का उत्पादन करता है। इसके विपरीत, जब समरूपता के बड़े क्षेत्रों के साथ एक बाहरी टेम्प्लेट के साथ प्रदान किया जाता है, तो सेल द्वारा दोहराए गए विराम के अनुसार समरूपता की मरम्मत 25 , 26 को ठीक कर सकता है। इस मार्ग से जीसॉम में बड़े सटीक विलोपन, प्रतिस्थापन या सम्मिलन की अनुमति मिल सकती है, जो कि एक्सीएबल चयन मार्करों 27 के परिचय के साथ मिलकर जुटाई जा सकती है।

यहां, हम इन दो सीआरआईआईएसपीआर / कास 9 तरीकों ( चित्रा 1 ए ) में से किसी एक से नॉकआउट सेल लाइन बनाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। NHEJ दृष्टिकोण एक एकल एसजीआरएनए कट साइट और चयन-स्वतंत्र स्क्रीनिंग का उपयोग करता है, और इस प्रकार थोड़ा अग्रिम तैयारी की आवश्यकता होती है। इस पद्धति का उपयोग करते समय, प्रतिलिपि के 5 'अंत के पास एक्सॉन के पूरक आरएनए को मार्गदर्शन करते हैं, जो कि एक नॉकआउट बनाने की सबसे अधिक संभावना है, डिजाइन किए जाने चाहिए। संशोधित होने के बाद सेइस मामले में जीनोम के लिए आयन छोटे होते हैं, नॉकआउट क्लोन के लिए स्क्रीनिंग डॉट ब्लाट पर आधारित होती है, जहां प्रोटीन उत्पाद को उच्च-थ्रिप्ट तरीके से मूल्यांकन किया जाता है। हम एक उदाहरण के रूप में ELAV जैसी 1 प्रोटीन (ELAVL1) नॉकआउट लाइनों की पीढ़ी का उपयोग करते हैं दूसरा दृष्टिकोण समरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) पर निर्भर करता है और दो एसजीआरएनए कट साइट्स का उपयोग करता है जो कि जीन या हित के क्षेत्र में फैला है, जिससे केबी के दसियों के विलोपन की अनुमति मिलती है समालोचना के दो क्षेत्रों के साथ एक प्लाज्मिड जो दरार साइटों की ओर जाता है एक प्रतिस्थापन टेम्पलेट ( चित्रा 1 बी ) प्रदान करता है, एक चयन प्रतिरोध मार्कर पेश करता है जो पीटा नॉकआउट पीढ़ी की दक्षता बढ़ाता है। इस पद्धति को भी जीन संशोधनों को लागू करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ताकि उचित रूप से डिजाइन किया गया समरूपता हथियार हो। इस मामले में, एक नया डीएनए टुकड़ा का एकीकरण पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग ( चित्रा -1 सी ) के लिए अनुमति देता है। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में Pumilio आरएनए बाध्यकारी परिवार के सदस्य 2 (पीओएम 2) पीटा पीढ़ी का उपयोग करते हैं।

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Protocol

1. इच्छित विलोपन के आसपास होमोलाजी क्षेत्र की पहचान

नोट: चयन-आधारित संपादन का उपयोग करते समय केवल आवश्यक।

  1. वांछित हटाए जाने वाले स्थान के दोनों तरफ, दो क्षेत्रों का चयन करें, शुरू में 1.5-2 केबी, जो एचडीआर टेम्प्लेट ( चित्रा 1 ए ) में समरूपता के रूप में काम करेगा। क्लोनिंग की सुविधा के लिए ऐसे क्षेत्रों की पहचान करें जिन पर बीएसएआई मान्यता वाले साइटों की कमी है (जीजीटीसीटीसी)। यदि बीएसएआई साइट अपरिहार्य हो, तो वैकल्पिक प्रकार के आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम (बीएसएमबीआई, एसएपीआई, बीबीएसआई) का उपयोग करें और प्राप्तकर्ता प्लास्मिड (पीयूसी 1 9-बीएसईआई), प्रतिरोध मार्कर दाता प्लाज्मिड (पीगोल्डन-निओ या पीजील्डन-हाइग्रो) में इसी साइट को संशोधित करें, और समरूपता हाथ पीसीआर उत्पाद ओवरहांग

2. कैस 9-एसजीआरएनए अभिव्यक्ति प्लास्मिड का निर्माण

  1. उत्परिवर्तन के लिए लक्ष्यीकरण साइट (ओं) को परिभाषित करें एकल-कट, चयन-मुक्त पद्धति के लिए, 5 गैर-फ़ू की संभावना बढ़ाने के लिए 5 'समीपस्थ कोडिंग एक्सन लक्षित करेंएनक्शनल उत्परिवर्तन दो-कट विधि के लिए, दो साइटों का चयन करें, जो आवश्यक जीन जितने ज़्यादा आवश्यक हो
    नोट: हमारे अनुभव में, 53 केबी तक का विलोपन कुशलतापूर्वक बनाया गया है।
  2. Crispr.mit.edu डिजाइन उपकरण में लक्षित क्षेत्र अनुक्रम के 200 से 300 बीपी इनपुट। चयन-आधारित क्लोनिंग के लिए, पहचान किए गए समरूप क्षेत्रों के 200-300 बीपी का उपयोग करें जो विलोपन लोकस ( चित्रा 1 ए ) के समीप हैं। अपनी गतिविधि में मतभेदों के कारण खाते में लक्षित प्रत्येक लक्षित क्षेत्र के 2-3 उच्चतम श्रेणी के एसजीआरएनए का चयन करें, और स्वतंत्र क्लोनों को अलग करने के लिए जो एक ही संभावित ऑफ-लक्ष्य प्रभाव को साझा नहीं करते हैं।
  3. अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में प्रविष्टि के लिए उपयुक्त ओवरहांग वाले डुप्लेक्स वाले ओलिगोनक्लियोटाइड्स को डिज़ाइन करने के लिए, अंत में पीएएम अनुक्रम (एनजीजी) को न छोड़ें और 5'-सीएसीसी ओवरहेन्ग को एक जी से ऊपर के किनारा ओलिगो तक जोड़ दें। निचली किनारा ओलोगो के लिए, एक 5'-एएएसी को रिवर्स-पूरक लक्ष्य अनुक्रम में घुमाएं, उसके बाद 3'-सी, आईएल के रूप मेंनीचे तृप्ति:
    अनुक्रम 1
  4. जांग लैब प्रोटोकॉल 29 में वर्णित गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करते हुए पीएसपीकास 9 (बीबी) प्लास्मिड में एसजीआरएनए के समतुल्य सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स डालें।

3. होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट प्लास्मिड की जनरेशन

नोट: चयन-आधारित संपादन का उपयोग करते समय केवल आवश्यक। समरूपता-निर्देशित मरम्मत टेम्प्लेट प्लास्मिड में दो क्षेत्रों से युक्त दवा प्रतिरोध कैसेट होता है जो दो एसजीआरएनए लक्ष्य साइटों ( चित्रा 1 बी ) के बाहर जीनोम के पूरक हैं।

  1. चरण 1.1 में पहचाने गए विस्तृत समरूप क्षेत्रों से, समरूपता हथियार ( चित्रा 1 ए ) के रूप में सेवा करने के लिए, डिजाइन किए Cas9 कट साइटों से 5-10 बीपी दूर नहीं 800-1000 बीपी 26 का चयन करें। एसजीआरएनए को शामिल नहीं करना सुनिश्चित करेंलक्ष्य साइट और इसकी पीएएम समरूपता हथियारों में है, क्योंकि इससे टेलीकम प्लैमिड के सीआरआईएसपीआर / सीसी 9 दरार का कारण होगा। यदि समरूपता के हथियारों में आंतरिक बीएसएआई साइट होते हैं, तो वैकल्पिक एसजीआरएनए साइटें का उपयोग करें।
  2. पीसीआर ने जीनोमिक डीएनए से एक उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का इस्तेमाल करते हुए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, अतिरिक्त 5 'अनुक्रम जो बीएसईआई साइट्स (जीजीटीसीटीसी) का परिचय देता है और समरूपता क्षेत्र के दोनों छोर पर अनोखा ओवरहेन्ग का उपयोग करता है। ओवरहेन्ग में सही आसन्न आदेश और अभिविन्यास उत्पन्न करने के लिए उचित अनुक्रम होना चाहिए, जैसा कि नीचे वर्णित है ( चित्रा 1 बी ):
    वाम अनुरुप हाथ एफपी ओवरहाँग: 5 'जीजीजीटीसीटीसीए जीजीसीसी
    वाम अनुरुप आर्म आरपी ओवरहाँग: 5 'जीजीजीटीसीटीटीटी सीएसीजी
    सही समालोचना शाखा एफपी ओवरहाँग: 5 'जीजीजीटीसीटीसीए जीटीसीसी
    सही समरूपता आरपी ओवरहाँग: 5 'जीजीजीटीसीटीसीटी सीसीएसी
  3. उचित एम्पलीफाफे के लिए समरूपता हथियार की जांच करेंआगे बढ़ने से पहले जेल वैद्युतकणसंचलन के जरिये
  4. गोल्डन गेट क्लोनिंग 28 द्वारा एचडीआर टेम्पलेट प्लास्मिड में प्रतिरोध कैसेट के साथ दाएं और बाएं समरूप हाथ क्षेत्रों को इकट्ठा करें। लॉज पी-फ्लैक्ड प्रतिरोध कैसेट (लॉक्स पी-पीजीके-निओ-पीए-लॉक्सपी या लॉक्सपी-पीजीके-हायग-पीए-लॉक्स पी) के स्रोत के रूप में पीगोल्डन-निओ या पीगॉल्डन-हाइग्रो प्लैमिड 30 का उपयोग करें। कई क्लोनिंग क्षेत्र में बीएसएआई साइटों के साथ पीयूसी 1 9-बीएसएआई, एक संशोधित पीयूसी 1 का उपयोग करें और बीएसईआई साइटों को अन्य जगहों से हटा दिया गया है, क्योंकि प्राप्तकर्ता वेक्टर (अनुरोध पर उपलब्ध) के रूप में। तीन आवेषण और वेक्टर के लिए 1: 1: 1: 1 के अनुपात का उपयोग करें।
    1. निम्न प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें 30 :
      सही समरूपता हाथ पीसीआर उत्पाद 0.06 pmol (30-40 एमजी)
      वाम अनुरुप हाथ पीसीआर उत्पाद 0.06 pmol (30-40 एमजी)
      पी ग्लोडेन-नेओ प्लास्मिड (100 एनजी / एमएल) 1 &# 181, एल
      पीयूसी 1 9-बीएसएआई प्लाज्मिड (100 एनजी / एमएल) 1 μL
      2x टी 7 डीएनए लेगेज बफर 5 μL
      बीएसएआई (10 यू / μ एल) 0.75 μL
      टी 7 डीएनए लिगेज (3000 यू / μ एल) 0.25 μL
      पानी 10 μL तक
    2. निम्न थर्मासीक्लर मापदंडों का प्रयोग करें: 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस 30 चक्रों के लिए दोहराएं
    3. क्लोनिंग उत्पाद को किसी भी शेष रेखीय डीएनए को पचाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक्सोन्यूचले के साथ व्यवहार करें।
    4. एक सक्षम ई में प्रतिक्रिया मिश्रण को रूपांतरित करें । कोशिकाओं के साथ दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार कोलाई तनाव, और ampicillin युक्त व्यंजन पर प्लेट।
  5. सही टेम्पलेट विधानसभा के साथ क्लोन की पहचान करने के लिए, बैक्टीरिया प्रदर्शनअल कॉलोनी पीसीआर को इकट्ठा किए गए सम्मिलन के समरूपता के उप-उप-नियमों को बढ़ाने के लिए (जैसा कि संपूर्ण डालने में मज़बूती को बढ़ाने के लिए बहुत बड़ा हो सकता है)। फ्लैंकिंग प्लाज्मिड अनुक्रम में एक प्राइमर का उपयोग करें और प्रतिरोध कैसेट ( चित्रा 1 बी , अनुक्रम दोनों नव और हाइग्रो सम्मिलित दोनों के लिए आम है) के पूरक के लिए पूरक दूसरा प्राइमर, एक विधानसभा-आश्रित उत्पाद का उत्पादन करता है जो लगभग 200 बीपी लंबा है निहित समरूप हाथ:
    पीयूसी 1 9-बस्ल-वाम: 5 'जीजीसीटीसीजीटीएटीजीटीटीजीटीजीटीजीजीएटीटीजीटीजीएजी
    विरोध-बायां: 5 'एएएएएजीसीजीसीसीटीसीसीसीसीटीएसीसीसीसी
    पीयूसी19-बीएसएआई-अधिकार: 5 'जीसीटीएटीटीसीजीसीएजीसीटीसीजीजीजीएएएए
    प्रतिरोध-अधिकार: 5 'एगैकैटगैगैक्टगैक्टजीजीजीजी
    1. बाँझ टूथपेक्स के साथ जीवाणु कालोनियों को उठाएं और 20 μL पानी में बैक्टीरिया को स्थगित करें। 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, और 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में स्पिन करें तुरंत बर्फ पर रखें
    2. निम्न पीसीआर मिश्रण 31 < तैयार करें/ Sup>:
      कॉलोनी टेम्पलेट पतला 1.25 μL
      10x ताक प्रतिक्रिया बफर 1.25 μL
      20 एमएम डीएनटीपी 0.25 μL
      10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर 0.25 μL
      10 सुक्ष्ममापी रिवर्स प्राइमर 0.25 μL
      ताक पोलीमरेज़ 0.25 μL
      पानी 9 μL
    3. निम्न थर्मासीक्लर मापदंडों का उपयोग करें: 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, (95 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 61 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट / केबी), 25 चक्रों के लिए दोहराएं, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
    4. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सही amplicon आकार के लिए पीसीआर उत्पाद की जाँच करें।
    5. वैकल्पिक रूप से, सही डालने के आकार और अनुक्रम के साथ व्यक्तिगत कॉलोनियों से मिलिप्रप प्लाज्मिड डीएनएउपरोक्त उल्लिखित प्रवर्धन प्राइमरों के साथ सेंगर अनुक्रमण द्वारा ई समरूपता के क्षेत्र

4. सीआरएसपीआर अवयवों में संवर्धित कोशिकाओं में अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक से पहले: संस्कृति टी-रेक्स 293 डीएमईएम मीडिया में 37% सी और 5% सीओ 2 में 10% एफबीएस के साथ पूरक।
  2. प्लेट की कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह प्लेटों पर और लगभग 70% सामंजस्य तक बढ़ने के लिए एक अप्रतिबंधित नियंत्रण के लिए एक अच्छी तरह से शामिल करें
  3. 2.5 μg कुल प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग करके एक वाणिज्यिक अभिकर्मक प्रोटोकॉल का उपयोग करें। समानांतर में, असंतुलित नियंत्रण को बनाए रखें।
    नोट: अभिकर्मक विधि और दक्षता सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होती है। प्रयोग से पहले प्रणाली के लिए उपयुक्त अभिकर्मक विधि का निर्धारण करें।
    1. चयन के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए, 0.75 माइक्रोग्राम सीस 9-एसजीआरएनए 1 (बायां कट), 0.75 माइक्रोग्राम सीसीआरआरएनए (सही कटौती), और 1.0 माइक्रोन मुताबिक़ पुनर्संयोजन टेम्प्लेट का उपयोग करें।
    2. ट्रांसफ़ेक्ट्री के लिएबिना चयन के कोशिकाओं के, 2.5 μg कास 9-एसजीआरएनए प्लाज्मिड का उपयोग करें।

5. दवा चयन

  1. अभिकर्मक के बाद 48 घंटे, उचित दवा (Neomycin / Hygromycin) के साथ कोशिकाओं का इलाज। गैर-निष्कासित नियंत्रण में सभी कोशिकाओं को मरने तक आम तौर पर चयन करें (निओ के लिए आमतौर पर 3-5 दिन, हाइग्रो के लिए 7-14 दिन)।
    नोट: टी-रेक्स 293 कोशिकाओं के लिए क्रमशः 500 माइक्रोग्राम / एमएल और निओमोसीन और हेग्रोमाइसिन के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल के सांद्रण का प्रयोग करें। अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए, प्रभावी एकाग्रता निर्धारित करने के लिए गैर-संक्रमित कोशिकाओं पर दवा का एक पूर्व अनुरेखण करना उपयोगी हो सकता है।

6. क्लोनल आबादी का अलगाव

  1. चयन के बाद मूल अच्छी तरह से कोशिकाओं को 100% सामंजस्य बढ़ाएं। बीज कोशिकाओं को अच्छी तरह से 0.33 कोशिकाओं प्रति घनत्व पर 96 अच्छी तरह से प्लेटें।
    नोट: सीडिंग तीन 96 अच्छी प्लेटें एक से अधिक सही क्लोन के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन अधिक या कम की आवश्यकता हो सकती है depएसजीआरएनए और एचडीआर दक्षताओं पर समाप्त
  2. उपनिवेशों को 2-4 सप्ताह की अवधि में देखें, जब तक कि कालोनियों को आंखों में दिखाई नहीं देता। एक बाँझ विंदुक टिप के साथ दृश्य कालोनियों को उठाएं और मोनोलायर विकास को प्रोत्साहित करने के लिए नए कुओं में शोध किया। निलंबन कोशिकाओं का उपयोग करते समय, यहां तक ​​कि कम बोने वाले घनत्व का उपयोग एकल कॉलोनी कुओं के अधिक से अधिक अनुपात सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है।

7. स्क्रीनिंग उम्मीदवार

  1. चयन के उपयोग के बिना उम्मीदवारों को स्क्रीनिंग करना: डॉट ब्लाट
    1. व्यक्तिगत क्लोन को 50-100% सामंजस्य तक बढ़ाएं अच्छी तरह से pipetting के द्वारा कोशिकाओं के monolayer बेदखल
    2. 100 माइक्रोन के कुल मात्रा के 9 0 μL को शुद्ध माइक्रोप्रोसीज ट्यूब में विभाजित करना। 5 मिनट के लिए 6000 आरपीएम पर स्पिन करें, मीडिया को हटा दें, और 10 μL 1x lysis बफर या 1x एसडीएस लोडिंग बफर (5x: 250 मिमी त्रि-सीएच पीएच 6.8, 8% एसडीएस, 0.1% ब्रोमोफेनॉल नीला, 40% ग्लिसरॉल, 100 मिमी डीटीटी)। वेल में शेष कोशिकाओं के लिए 90 μL नए मीडिया को जोड़ेंमैं प्रचार जारी रखने के लिए।
    3. पिपेट एक सूक्ष्म नाइट्रो सेलुलोज़ झिल्ली पर कोशिका lysate के 1 μL को डॉट बनाने के लिए। प्रत्येक नमूने को दो अलग-अलग झिल्ली पर दो बार छोड़ दें, नमूने के दो समान पैटर्न बनाएं।
    4. टीबीएसटी में 5% दूध में झिल्ली को अवरुद्ध करें (ट्राइस बफर्ड सलाइन + 0.01% बीच में 20: 8 ग्राम नालक्ल, 0.2 ग्राम केएलएल, 3 ग्राम ट्राइस बेस, 1 एल आसुत जल तक, पीएच 7.4) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 31 कमाल के साथ, यहां और प्रक्रिया के दौरान)।
    5. एक झिल्ली पर लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए और अन्य पर नियंत्रण प्रोटीन (ट्यूबिलिन, जीएपीडीएच, या किसी भी अन्य प्रोटीन को बदलने की उम्मीद नहीं है) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना। टीबीएसटी + 5% दूध में सिफारिश की गई प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (इस मामले में एलाविल् 1 के लिए 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल और पीएम 2 के 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) का प्रयोग करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे सेते हैं।
    6. 5 मिनट के लिए टीबीएसटी के साथ 3 बार धोएं
    7. टी में उचित एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक झिल्ली को सेते हैंबीएसटी + 5% दूध के तापमान पर 1 घंटे के लिए।
    8. 5 मिनट के लिए टीबीएसटी के साथ 3 बार धोएं
    9. निर्माता के निर्देशों और छवि को डिजिटल कैमिम्युमेन्सेंस इमेजर पर धमाकेदार झिल्ली के बाद रसायनयुक्त सब्सट्रेट सब्सट्रेट समाधान (सामग्री तालिका देखें) लागू करें।
    10. उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके लक्ष्य और नियंत्रण प्रोटीनों के लिए डॉट तीव्रता को बढ़ाएं।
    11. कम नियंत्रण प्रोटीन सिग्नल वाले उम्मीदवारों को समाप्त करें और शेष उम्मीदवारों के लिए प्रोटीन तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए लक्ष्य के पृष्ठभूमि-घटाए गए अनुपातों की गणना करें। पारगमन के लिए सबसे कम अनुपात वाले उम्मीदवारों का चयन करें और पश्चिमी धब्बा द्वारा आगे की पुष्टि करें।
  2. चयन के उपयोग के साथ उम्मीदवारों को स्क्रीनिंग करना: कॉलोनी पीसीआर
    1. एक डीएनए प्रस्तुतिकरण काट ( सामग्री तालिका देखें) का उपयोग कर सेल lysate ले लीजिए।
      1. एक नई 96 अच्छी तरह से डुप्लिकेट व्यक्तिगत कॉलोनियों और 100% सामंजस्य तक बढ़ने के लिए।
      2. क्लोन के एक सेट से मीडिया को निकालें, एकिट से निकासी बफर के 30 μL में nd resuspend कोशिकाओं। एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरण।
      3. 15 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस का समाधान गर्मी और कमरे के तापमान को शांत करने दें।
      4. किट से 30 μL स्थिरीकरण बफर जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं।
    2. कॉलोनी पीसीआर द्वारा wildtype और मोनोलेल्लिक / बायललालिस उत्परिवर्ती लाइनों को पहचानें
      1. प्रतिरोध कैसेट ( चित्रा 2 सी ) के सफल या असफल एकीकरण के आधार पर समरूपता हथियारों के आसपास के क्षेत्रों को बढ़ाने के लिए (लक्षित लोकस के बाएं और दाएं किनारे के लिए) पीसीआर प्राइमरों के दो अलग-अलग सेटों को डिज़ाइन करें। प्रत्येक पक्ष पर, एक सामान्य प्राइमर (लाल) का उपयोग करें जो समरूपता के बाहर हाथों की अंगूठी जंगली-प्रकार एलील के लिए परीक्षण करने के लिए समरूप युग्मक प्राइमर के साथ इसका प्रयोग करें जो अंतर्जात अनुक्रम के पूरक हैं, जो समरूपता क्षेत्र (नीला) फैले हुए हैं। डाला प्रतिरोधकैसेट के पूरक के लिए एक और बनायी गई प्राइमर का उपयोग करें (अनुभाग में प्राइमरों को देखें2.3), वांछित उत्परिवर्तन के लिए परीक्षण करने के लिए।
      2. (अनुशंसित) मूल चयनित थोक सेल आबादी से सेल lysate का उपयोग करने वाले प्राइमर को मान्य करें, क्योंकि इसमें डब्ल्यूटीएल और उत्परिवर्ती एलील ( चित्रा 2 डी ) दोनों का मिश्रण होगा।
      3. निम्न प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें:
        सेल lysate 0.5 μL
        10x कोऑडी बफर 1.25 μL
        25 एमएम एमजीएसओ 4 0.75 μL
        2 मिमी डीएनटीपी 1.25 μL
        10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर 0.375 μL
        10 सुक्ष्ममापी रिवर्स प्राइमर 0.375 μL
        कोोड पॉलिमरेज़ 0.25 μL
        पानी 7.75 μL
      4. निम्नलिखित थर्मोसायक्लर परिस्थितियों का प्रयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट, (20 डिग्री के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 एस के लिए प्राइमर टीएम, 20 एस / केबी के लिए 70 डिग्री सेल्सियस) 25 चक्रों के लिए दोहराएं।
      5. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद को कल्पना।
    3. पूर्वानुमानित एकीकरण के प्रत्येक पक्ष के लिए कॉलोनी पीसीआर परीक्षण को दोहराएं। उन उम्मीदवारों का चयन करें और विस्तार करें, जो हटाए गए क्षेत्र के लिए एकीकरण की उपस्थिति और कोई अंतर्जात अनुक्रम उत्पाद नहीं दिखाते हैं।
    4. पश्चिमी धब्बों और / या आरटी- qPCR द्वारा सकारात्मक उम्मीदवारों की पुष्टि करें।

8. अनुक्रमण द्वारा जीनोमिक उत्परिवर्तन की पुष्टि करें

  1. फेनोल क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण 31 द्वारा उत्परिवर्ती सेल लाइनों से जीनोमिक डीएनए को अलग करना।
  2. पीसीआर एसजीआरएनए लक्ष्य क्षेत्र को बढ़ाता है, प्राइमरों के उपयोग से 5 'ओवरहेन्ग्स का उपयोग करता है जो प्रत्येक छोर पर बीएसएआई प्रतिबंध साइटों को जोड़ता है
    नोट: एचडीआर के साथ संपादित क्लोनों के लिए, जहां दोनों समानताएं समान हो सकती हैं, पीसीआर उत्पाद को सीधा क्रमबद्ध किया जा सकता है।
  3. पीयूसी 1 9-बीएसएआई में प्रवर्धित क्षेत्र को गोल्डन गेट क्लोनिंग द्वारा क्लोन करें।
  4. एक सक्षम ई में प्रतिक्रिया मिश्रण को बदल दें । कोलाई तनाव।
  5. 6-10 व्यक्तिगत कालोनियों से मिनिप्रैप प्लाज्मिड डीएनए और सेंगर अनुक्रमण द्वारा क्लोन क्षेत्र को अनुक्रम।

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Representative Results

ELAVL1 नॉकआउट लाइनों की पीढ़ी के लिए, एक मजबूत एंटीबॉडी उपलब्ध थी, इसलिए सिंगल एसजीआरएनए ( चित्रा 1 ए , बाएं) का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया, उसके बाद डॉट इम्यूनोबलॉट किया गया। तीन एसजीआरएनए स्वतंत्र रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किए गए थे और परिणामस्वरूप क्लोनों में लक्ष्य प्रभावों को बाहर निकालने के लिए। क्लोनल आबादी से दो नाइट्रोकेल्यूलोज़ झिल्ली पर कोशिका lysates को इकट्ठा करने और ब्लोटिंग के बाद, ब्लॉलेट की जांच ELAVL1 और PUM2 (सामान्यीकरण नियंत्रण के रूप में) ( चित्रा 2 ए ) दोनों के लिए की गई। ELAVL1 से PUM2 सिग्नल का मात्रात्मक अनुपात अलग-अलग लाइनों ( चित्रा 2 बी ) के बीच एक बहुत विस्तृत,> 10 4 -फाल्ड रेंज का प्रदर्शन करता है। एक चयन मानदंड के रूप में इस अनुपात का उपयोग करते हुए, हमने ELAVL1 वेस्टर्न ब्लोट ( चित्रा 3 ए ) का उपयोग करके कई पंक्तियों को मान्य किया है। ज्यादातर मामलों में, सबसे कम रिश्तेदार ELAVL1 संकेत वाले क्लोनल आबादी थेनाकआउट्स ( चित्रा 2 बी ) के रूप में सही ढंग से पहचाने जाने पर, इस क्वालिफिकेशन की अनुमानित शक्ति (कंट्रोल सिग्नल में काफी परिवर्तनशीलता के बावजूद, जो संभवतः एकत्रित कोशिकाओं के भिन्न संख्या से उत्पन्न हुई) की पुष्टि करता है। इसके विपरीत, इंटरमीडिएट अनुपात वाले अधिकांश क्लोन सत्यापन पर ईलावीएल 1 सिग्नल का प्रदर्शन करते हैं, संभावित रूप से मोनोलेल्लिक हटाना कार्यक्रमों का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, डब्लूटी, मोनोलेलिक और पूर्ण (बायललेलिंक) उत्परिवर्ती पूल में अनुपात का कोई सामान्य स्तर नहीं देखा गया, और यहां तक ​​कि ईलावीएल 1-पॉजिटिव क्लोन ने अभिव्यक्ति की क्लोनल परिवर्तनशीलता के कारण संभवतः एक विस्तृत और निरंतर स्तरों को प्रदर्शित किया। इस पद्धति का उपयोग करने वाले ELAVL1 पीटा पीढ़ी की संपूर्ण प्रभावशीलता एसजीआरएनए में 6 से 36% तक थी।

अन्य जीन लक्ष्यों (जैसे PUM2) के लिए, उपलब्ध एंटीबॉडी की गुणवत्ता क्रॉस-रिएक्शन से ऊंची पृष्ठभूमि के कारण डॉट ब्लोट द्वारा उम्मीदवार क्लोन की सटीक स्क्रीनिंग रोकती हैvity। इसके अतिरिक्त, क्रोमेटिन पहुंच के कारण कुछ जीनोमिक लोकी को लक्षित करने की दक्षता काफी कम हो सकती है। ऐसे मामलों में, दक्षता बढ़ाने के लिए एक चयन-आधारित विधि उपयुक्त है। पीओएम 2 के शुरुआती और देर से कोडिंग क्षेत्रों को लक्षित करने वाले दो एसजीआरएनए को मनोचिकित्सा-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट के साथ कोट्रैनेक्टेड किया गया था ताकि 45 डीबी जीनोमिक डीएनए को उत्पादित किया जा सके और इसे नेमोसीन प्रतिरोध कैसेट ( चित्रा 1 ए , दाएं) के साथ बदल दिया। समरूपता टेम्पलेट की विधानसभा चित्रा 1 बी में सचित्र है पीसीआर प्राइमरों को प्रतिरोध कैसेट ( चित्रा 2 सी ) के सफल या असफल एकीकरण के आधार पर समरूपता के आसपास के क्षेत्रों को बढ़ाने के लिए डिजाइन किया गया था, और बिना ट्रांसफेक्ट और थोक चयनित कक्ष (बाएं पैनल) पर परीक्षण किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, अप्रसारित कोशिकाओं में, अंतर्जात अवस्था (शीर्ष) के अनुरूप केवल एक एम्प्लिकॉन मनाया जाता था, जबकि बल्क चयनित कक्ष दोनों से एम्प्लीकॉन दिखाते थेजंगली प्रकार और उत्परिवर्ती alleles उत्पन्न क्लोनल उम्मीदवारों से सेल lysates इकट्ठा और दोनों अंतर्जात अनुक्रम और प्रतिरोध कैसेट की उपस्थिति के लिए जांच की गई। उम्मीदवार नॉकआउट की पहचान केवल प्रतिरोध कैसेट एम्पलीकॉन की उपस्थिति से हुई थी, जो कि बाइललेलिंक विलोपन / एकीकरण ( चित्रा 2 डी , सितारों) को दर्शाती है। मोनोलेलल सम्मिलन के साथ क्लोन भी देखे गए, और काफी सामान्य थे, क्योंकि ऐसी आबादी भी चयन प्रक्रिया से बच सकती है। इन क्लोनों को अंतर्जात अनुक्रम और प्रतिरोध कैसेट दोनों की उपस्थिति से संकेत दिया गया था। कुछ मामलों में, टेस्टेड लोकस में क्लोनल वाइन्फ़ोलिपि भी मनाया जाता था, यह सुझाव देते हुए कि यादृच्छिक, गैर-एसजीआरएनए की सहायता से समरूपता-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट का जीनोमिक एकीकरण कम आवृत्ति पर होता है। बायललालिस उत्परिवर्ती लाइनों को पश्चिमी धब्बा ( चित्रा 3 बी ) द्वारा भी मान्य किया गया था। एचडीआर प्रक्रिया का उपयोग करते हुए नॉकआउट पीढ़ी की कुल दक्षता 3 थी3%।

आकृति 1
चित्रा 1: स्तनधारी सेल लाइनों में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता वाले दस्तक बनाने के लिए एक कार्यप्रवाह। ( ए ) सीआरआईएसपीआर / कास 9 क्लीवेज और एनएचईजे (बाएं) या एचडीआर (दाएं) द्वारा निर्मित जेनोम संपादन इवेंट्स सीएस 9 दरार की साइट को एक सफेद ऊर्ध्वाधर रेखा से चिह्नित किया गया है। ( बी ) एचडीआर टेम्पलेट प्लाज्मिड के घटक और विधानसभा। गोल्डन गेट क्लोनिंग में इस्तेमाल किए जाने वाले टाइप II के प्रतिबंध एंजाइम, जैसे बीएसएआई, एक असममित डीएनए अनुक्रम पहचानते हैं और मान्यता अनुक्रम के बाहर एक कंपित कटौती छोड़ देते हैं, जिससे विधानसभा (चित्रित) के लिए मनमाना अतिव्यापी क्षेत्रों के डिजाइन की अनुमति मिलती है। तीर सही प्लाज्मिड विधानसभा की जांच करने के लिए प्राइमर की स्थिति दर्शाती हैं। ( सी ) कार्यप्रवाह: अभिकर्मक (और यदि दवा का चयन यदि लागू हो) के बाद, कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह प्लेटों में मंथन को सीमित करने पर चढ़ाया जाता है क्लोनल आबादीडॉट इम्यूनोबलॉट (चयन-स्वतंत्र, एनएचईजे) या कॉलोनी पीसीआर (चयन-निर्भर, एचडीआर) द्वारा जांच की जाती है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: डॉट ब्लास्ट या कॉलोनी पीसीआर द्वारा स्क्रीनिंग उम्मीदवार नॉकआउट लाइनें ( ए ) ELAVL1 एंटीबॉडी (बाएं) के साथ पृथक ELAVL1- लक्षित क्लोनों के, और अलग से एक नियंत्रण प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के साथ, Pum2 (दाएं) के डीॉट इम्यूनोबलॉट। कम इनपुट प्रोटीन मात्रा के कारण संभवतः थोड़ा नियंत्रण संकेत प्रदर्शित करने वाले क्लोन को एक्स के साथ चिह्नित किया जाता है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया है। निम्न ईलावीएल 1 सिग्नल (सर्कल) वाले क्लोनों का परीक्षण पश्चिमी ब्लोट्स द्वारा किया गया जो कि पुष्टि की गई (हरी) या अमान्य (ग्रे) उम्मीदवार ( बी ) केओ सी के मात्राकरणडॉट ब्लाट से स्थित एएलएवीएल 1 के अनुपात में ए में दिखाए गए डॉट ब्लोट में प्रोटीन सिग्नल को नियंत्रित करने के क्रम में ( सी ) कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से नॉकआउट / प्रविष्टि परीक्षण के लिए प्राइमर डिजाइन समरूपता क्षेत्र (लाल) के बाहर जीनोमिक ठिकाना के पूरक एक प्राइमर अंतर्जात अनुक्रम (नीला) या प्रतिरोध कैसेट (हरा) के लिए पूरक प्राइमर के साथ जोड़ा जाता है, जो बिना अवकाश वाले राज्य की जांच कर रहा है, या विलोपन / सम्मिलित होने की घटना है , क्रमशः अलग प्राइमर जोड़े को एकीकरण के दोनों तरफ का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ( डी ) कॉलोनी पीसीआर के उदाहरण अंडरोजेनिंग प्राइमरों (शीर्ष) और प्राइमरों (नीचे) के अंदर नॉकआउट का उपयोग करते हुए अपस्ट्रीम एकीकरण जंक्शन पर फैले प्राइमरों के उपयोग के उदाहरण। प्राइमर्स पहले माता-पिता टी-रेक्स 293 कोशिकाओं और थोक चयनित कक्षों (बाएं) दोनों में मान्य हैं। व्यक्तिगत उम्मीदवार क्लोन (मध्य) और डब्ल्यूटी, के.ओ. और मोनोलेलिक विलोपन (डब्लूटी / को) क्लोन (दाएं) के लिए अपेक्षित बैंड पैटर्न। बेलललिंक नाकआउट क्लोन संकेत मिलता हैडी एक स्टार द्वारा सही प्रवर्धन उत्पादों काले तीर से संकेत कर रहे हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: पश्चिमी ब्लॉट द्वारा नॉकआउट उम्मीदवारों की मान्यता। ( ए ) डॉट ब्लाट द्वारा पहचाने जाने वाले क्लोनों के एक सबसेट के ELAVL1 (शीर्ष) के लिए पश्चिमी धब्बा। पीओएम 2 को एक समान झिल्ली पर लदान नियंत्रण (नीचे) के रूप में मिटा दिया गया था। ( बी ) कॉलोनी पीसीआर द्वारा पहचाने जाने वाले क्लोनों के एक सबसेट के PUM2 (शीर्ष) के लिए पश्चिमी धब्बा लोडिंग नियंत्रण (नीचे) के रूप में एक ही झिल्ली पर GAPDH को मिटा दिया गया था इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली ने स्थिर जीनोमिक संशोधनों के कुशल उत्पादन की अनुमति दी है, जो अन्य क्षणिक हेरफेर विधियों के लिए एक अधिक सुसंगत विकल्प प्रदान करते हैं। यहां, हम स्तनधारी सेल लाइनों में सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीन नॉकआउट के तेजी से पहचान के लिए दो तरीके प्रस्तुत किए हैं। दोनों तरीकों को थोड़ा सेलुलर सामग्री की आवश्यकता होती है, इसलिए क्लोनल कल्चर के शुरुआती चरण में परीक्षण किया जा सकता है, बचत समय और अभिकर्मकों। दोनों तरीकों की दक्षता बढ़ाने के लिए, हम कई एसजीआरएनए का परीक्षण करने की सलाह देते हैं, क्योंकि अनुक्रम क्रम और जीनोमिक स्थान के आधार पर भिन्न होता है। इसके अलावा, गैर-लक्षित जीनों में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप आउटलेयर फेनोटाइप का पता लगाकर कई-सेग्राएनए का उपयोग करना बंद-लक्ष्य प्रभावों की पहचान करने में उपयोगी है। प्रभावी अभिकर्मक और Cas9 दरार बहुत knockouts पैदा करने की संभावना में वृद्धि होगी। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को सीधे व्यावसायिक रूप से sgRNA / Cas9 रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ ट्रांसफ़रिंग 32 ,33 प्रोटोकॉल में तेजी ला सकता है और ऑफ-टाईल्स प्रभाव कम कर सकता है।

एनएपीएजे के कारण छोटे जीनोमिक परिवर्तनों की वजह से प्रोटीन नाकआउट्स का आकलन करने के लिए डॉट ब्लाटें अच्छी तरह से अनुकूल हैं। चूंकि केवल एक एकल एसजीआरएनए / कैस 9 निर्माण आवश्यक है, यह तरीका नल लाइनों को हासिल करने में सबसे तेज़ हो सकता है, और ब्लोट प्रक्रिया स्क्रीनिंग में तेजी लाने के लिए अतिरिक्त कदम उठाती है। सामान्यकृत इम्यूनोब्लॉट प्रोटीन सिग्नल सफल सत्यापन ( चित्रा 2 बी ) का विश्वसनीय भविष्यवाणी के रूप में कार्य करता है। यह प्रोटोकॉल न्यूनतम जीनोमिक उलझन के साथ knockouts के निर्माण के लिए आदर्श है। वैकल्पिक रूप से, स्क्रीनिंग की इस विधि को प्रोटीन अतिरिक्त या संशोधनों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे ट्रांसजेनिक प्रोटीन या प्रोटीन टैग। हालांकि, इस स्क्रीनिंग विधि को ब्याज की प्रोटीन के लिए उच्च विशिष्टता के साथ एक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, क्योंकि क्रॉस-रिएक्टिविटी डॉट ब्लोट्स में उच्च पृष्ठभूमि की ओर जाता है। यह विधि स्वाभाविक रूप से म्यूटेशन लक्ष्यीकरण तक ही सीमित हैप्रोटीन कोडिंग क्षेत्र, क्योंकि अंतिम उत्पादन प्रोटीन उत्पाद की मौजूदगी / अनुपस्थिति पर निर्भर करता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एनएचईजे की वजह से उत्परिवर्तन विभिन्न प्रकार के प्रोटीन परिणामों का नेतृत्व कर सकते हैं, जिसमें एक सक्रिय, आंशिक या प्रभावशाली नकारात्मक कार्यप्रणाली या प्रोटीन का पता लगाने एंटीबॉडी का पता लगाने में कोई कमी नहीं होती है। इन मुद्दों को कम करने के लिए, संभवतः कोडिंग क्षेत्र में Cas9 कट को लक्षित करना उपयोगी होता है, ताकि पूरी तरह से गैर-कार्यात्मक प्रोटीन पैदा करने की संभावना बढ़ सके। इसके अतिरिक्त, जीनोमिक क्षेत्रों को लक्षित करना जो कि सीएस 9 मशीनरी के लिए कम सुलभ हैं, चयन के अभाव में कम विलोपन पैदावार का उत्पादन कर सकते हैं। आखिरकार, एक ऐसी चुनौतीपूर्ण नुकसान पहुंचाने वाले दस्तक ऐसे कारणों से इस पद्धति से प्राप्त करना मुश्किल हो सकते हैं।

सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 दरार के साथ समरूपता-निर्देशित मरम्मत तंत्र का उपयोग करना बहुत बड़ा और अधिक विशिष्ट जीनोमिक जोड़तोड़ की अनुमति देता है, जिसमें दोनों ला शामिल हो सकते हैंबड़े पैमाने पर विलोपन (दो एसजीआरएनए दरारों द्वारा चित्रित) और सम्मिलन चूंकि दो क्लेवेज इवेंट्स और एक सटीक मरम्मत प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, एक ड्रग प्रतिरोध मार्कर के एकीकरण ने इस पद्धति का उपयोग करते हुए नॉकआउट उपज बढ़ाया है। यद्यपि डॉट ब्लोट डिटेक्शन का इस्तेमाल भी किया जा सकता है, कॉलोनी पीसीआर द्वारा स्क्रीनिंग अधिक आम तौर पर सही इंटिग्रेशन / नॉकआउट उम्मीदवारों को सटीक रूप से इस तरह के बड़े जीनोमिक पैरबर्बेशंस के साथ पहचानने के लिए लागू होती है। इसके अलावा, पीसीआर द्वारा परीक्षण से अपूर्ण और अपूर्ण एकीकरण के साथ क्लोन की पहचान करने की अनुमति मिलती है, जो एचडीआर प्रक्रिया की सीमा और प्रकृति की जानकारी प्रदान कर सकती है। इसके अतिरिक्त, शुरू की गईं मार्कर को बाद में हटाया जा सकता है (क्षणिक रचनात्मक अभिव्यक्ति या झिल्ली-पारगम्य रूप में अतिरिक्त), कम से कम, 34 बीपी हटाए जाने के निशान (लॉक्सपी साइट) को छोड़कर और चयन मार्कर के भविष्य में फिर से उपयोग की अनुमति दें। इस दृष्टिकोण की लचीलेपन कई प्रतिरोध मार्करों के उपयोग से बढ़ जाती है, जो कि कई सहू के निर्माण की अनुमति देता हैलैटिन प्रोटीन नॉकआउट इस पद्धति को लागू करते समय यह महत्वपूर्ण है कि उत्पाद की अनुपस्थिति को और मान्य किया गया है, उदाहरण के लिए उम्मीद की प्रतिलिपि के आरटी- qPCR द्वारा। चूंकि यह स्क्रीन एंटीबॉडी स्वतंत्र हो सकती है, इसलिए यह विधि आसानी से प्रोटीन नाकआउट्स पर एक मजबूत एंटीबॉडी के बिना लागू की जाती है, साथ ही ऐसे परिवर्तनों का पता लगाने के लिए जो प्रोटीन कोडन जीन में नहीं आते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

लेखकों ने अभिकर्मकों को साझा करने के लिए प्रायोगिक सहायता के लिए गिसेल सचेज़, मेगन ली, और जेसन एस्टेप को स्वीकार करना चाहूंगा, और Weifeng Gu और Xuemei चेन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1x SDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

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References

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आनुवांशिकी अंक 124 क्रिस्पीआर / कैस 9 समरूपता से जुड़ी मरम्मत गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने डॉट ब्लोट क्लोनल चयन स्क्रीनिंग
स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन
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Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

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