Summary
Nylige fremskritt i evnen til å genetisk manipulere somatiske cellelinjer har stort potensial for grunnleggende og anvendt forskning. Her presenterer vi to tilnærminger til CRISPR / Cas9 generert knockout produksjon og screening i pattedyrcellelinjer, med og uten bruk av selekterbare markører.
Abstract
CRISPR / Cas9-genometeknikksystemet har revolusjonert biologi ved å tillate nøyaktig genomredigering med liten innsats. Guided av en enkelt guide RNA (sgRNA) som gir spesifisitet, spalter Cas9-proteinet begge DNA-strengene på målrettet lokus. DNA-pause kan utløse enten ikke-homolog sluttenforening (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR). NHEJ kan introdusere små slettinger eller innføringer som fører til rammeskiftmutasjoner, mens HDR muliggjør større og mer presise forstyrrelser. Her presenterer vi protokoller for generering av knockout-cellelinjer ved å kopiere etablerte CRISPR / Cas9-metoder med to alternativer for nedstrøms valg / screening. NHEJ-tilnærmingen bruker et enkelt sgRNA-kuttsted og utvalgsavhengig screening, hvor proteinproduksjon vurderes med prikkimmunoblot på høy gjennomstrømningsmetode. HDR-tilnærmingen bruker to sgRNA-kuttsteder som spenner over genet av interesse. Sammen med en gitt HDR-mal kan denne metoden slettesAv titalls kb, hjulpet av den innsatte valgbare motstandsmarkøren. De aktuelle anvendelsene og fordelene ved hver metode diskuteres.
Introduction
Stabile genetiske endringer gir en fordel over forbigående metoder for cellulær forstyrrelse, som kan variere i effektivitet og varighet. Genomisk redigering har blitt stadig mer vanlig de siste årene på grunn av utviklingen av mål-spesifikke nukleaser, slik som sinkfingernukleaser 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkripsjonsaktivator-lignende effektor-nukleaser (TALENer) 6 , 7 , 8 , 9 Og RNA-styrte nukleaser avledet fra det klyngede, regelmessige interspaced korte palindromiske gjentagelser (CRISPR) system 10 .
CRISPR / Cas9-redigeringsmaskinen er tilpasset fra et immunsystem som bakterier og arkea bruker til å forsvare seg mot virusinfeksjonerAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . I denne prosessen blir korte 20-30 nt-fragmenter av invaderende virussekvens inkorporert i et genomisk lokus som "avstandsstykker" flankert av gjentagende enheter 14 , 15 . Etterfølgende transkripsjon og RNA-prosessering genererer små CRISPR-assosierte RNA'er 16 (crRNAer) som sammen med et transaktiverende crRNA 17 (tracrRNA) samler sammen med effektor Cas9 endonukleasen. CrRNAene gir således spesifisitet til Cas9-målretting, styring av komplekset for å spalte komplementære virale DNA-sekvenser og forhindre ytterligere infeksjoner 18 , 19 . En hvilken som helst "protospacer" -sekvens i det målrettede DNA kan tjene som kilden til crRNA, så lenge det er direkte 5 'til et kort protospacer tilstøtende motiv (PAM), NGG i tilfelle av S. pyogenes Cas9
Ved ekspresjon av Cas9 og et sgRNA i eukaryote celler spaltes Cas9-proteinet begge DNA-strengene på det målrettede locus. I fravær av en egnet region med homolog sekvens, fikserer cellen denne pause via ikke-homolog endende sammenføyning (NHEJ) 22 , 23 , 24 , som typisk introduserer små deletjoner eller sjelden innsettinger. Når du målretter mot en åpenLeserammen, vil reparasjonen sannsynligvis føre til en translationsramme som produserer et ikke-funksjonelt proteinprodukt. I kontrast, når den er forsynt med en eksogen mal med store homologområder, kan cellen fikse dobbeltstrengspausen ved homologertilt reparasjon 25 , 26 . Denne ruten gir mulighet for større presise deletjoner, erstatninger eller innsetting i genomet, kombinert med introduksjon av excisable markeringsmarkører 27 .
Her presenterer vi protokoller for å generere knockoutcellelinjer ved hjelp av en av disse to CRISPR / Cas9-metodene ( figur 1A ). NHEJ-tilnærmingen bruker et enkelt sgRNA-kuttsted og utvalgsavhengig screening, og krever derfor lite forberedelse på forhånd. Når du bruker denne metoden, må du styre RNAer som er komplementære til exoner nær 5'-enden av transkripsjonen, som mest sannsynlig vil gi en utkobling, må utformes. Siden modifiseringenIoner til genomet i dette tilfellet er små, screening for knockout kloner er basert på dot blots, hvor proteinproduktet er vurdert på høy gjennomstrømningsmetode. Vi bruker generasjonen av ELAV-lignende 1 protein (ELAVL1) knockout linjer som et eksempel. Den andre tilnærmingen er avhengig av homologertilt reparasjon (HDR) og bruker to sgRNA-kuttsteder som spenner over genet eller regionen av interesse, noe som tillater sletting av titalls kb. Et plasmid med to regioner av homologi som flankerer klyvningssteder, gir en erstatningsmal ( figur 1B ), innføring av en selekterbar resistansmarkør som øker effektiviteten av knockout-generasjon. Denne metoden kan også tilpasses for å introdusere genmodifikasjoner med riktig utformede homologarmarmer. I dette tilfellet tillater integrasjonen av et nytt DNA-fragment PCR-basert screening ( figur 1C ). Her bruker vi generasjonen av Pumilio RNA bindende familiemedlem 2 (PUM2) knockout linjer som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Identifikasjon av homologiregionene rundt ønsket sletting
MERK: Bare nødvendig hvis du bruker valgbasert redigering.
- Velg to regioner, i utgangspunktet 1,5-2 kb, på hver side av det ønskede slettepunktet, som vil fungere som homologarmarmer i HDR-malen ( Figur 1A ). Identifiser regioner som mangler BsaI-anerkjennelsessteder på begge strenger (GGTCTC) for å lette kloning. Hvis BsaI-steder er uunngåelige, bruk et alternativt type IIs restriksjonsenzym (BsmBI, SapI, BbsI) og modifiser de tilsvarende stedene i mottakerplasmidet (pUC19-BsaI), resistormarkør-donorplasmidet (pGolden-Neo eller pGolden-Hygro), og Homolog arm PCR produktoverheng.
2. Generering av Cas9-sgRNA Expressionsplasmider
- Definer målrettingsstedet (e) for mutagenese. For den enkeltskårne, valgfrie metoden, mål 5'-proksimale kodende exoner for å øke sannsynligheten for en ikke-fuNeksjonsmutasjon. For to-cut-metoden, velg to områder som spenner så mye av genet som nødvendig.
MERK: I vår erfaring er sletting opptil 53 kb skapt effektivt. - Angi 200 til 300 bp av den målrettede områdesekvensen i designverktøyet crispr.mit.edu. For utvalgsbasert kloning, bruk 200-300 bp av de identifiserte homologiregionene som er proksimale for deletjonslokalet ( Figur 1A ). Velg 2-3 av de høyest rangerte sgRNAene per målrettet region for å ta hensyn til forskjeller i deres aktivitet, og å isolere uavhengige kloner som ikke deler de samme potensielle off-target-effektene.
- For å designe tosidige oligonukleotider med hensiktsmessige overheng for innføring i ekspressjonsplasmidet, utelates slutt-PAM-sekvensen (NGG) og legge til et 5'-CACC-overheng etterfulgt av en G til toppstrengoligoen. For bunnstrengoligoen legger du til et 5'-AAAC overheng til den revers-komplementerte målsekvensen, etterfulgt av en 3'-C, som ilLustrerte nedenfor:
- Sett inn syntetiske oligonukleotider som tilsvarer sgRNAene i pSpCas9 (BB) plasmidet ved bruk av Golden Gate-kloning 28 som beskrevet i Zhang lab-protokollen 29 .
3. Generering av homologiregerte reparasjonsmalplasmider
MERK: Bare nødvendig hvis du bruker valgbasert redigering. Det homologiregerte reparasjonsmallplasmidet består av en medikamentresistenskassett flankert av to regioner som er komplementære til genomet like utenfor de to sgRNA-målstedene ( figur 1B ).
- Fra de bredere homologiregionene identifisert i trinn 1.1, velg 800-1000 bp 26 ikke mer enn 5-10 bp vekk fra de utformede Cas9-kuttsteder for å tjene som homologarmarmen ( figur 1A ). Pass på at du ikke inkluderer sgRNAMålsted og dets PAM i homologarmarmen, da dette vil forårsake CRISPR / Cas9-spaltning av templatplasmidet selv. Hvis homologearmen inneholder interne BsaI-steder, bruk alternative sgRNA-sider.
- PCR amplifiserer homologarmarmer fra genomisk DNA ved hjelp av en høyfidelisitets DNA-polymerase, etter produsentens instruksjoner, ved bruk av fremover- og revers-primere med ytterligere 5'-sekvens som introduserer BsaI-steder (GGTCTC) og unike overheng på begge ender av homologiregionen. Overhengene må inneholde riktige sekvenser for å generere riktig monteringsrekkefølge og orientering, som beskrevet nedenfor ( Figur 1B ):
Venstre homologi arm FP overheng: 5 'GGGTCTCA GGCC
Venstre homologi arm RP overheng: 5 'GGGTCTCT CACG
Høyre homologi arm FP overheng: 5 'GGGTCTCA GTCC
Høyre homologi arm RP overheng: 5 'GGGTCTCT CCAC - Sjekk homologi armer for passende amplifIcation via gelelektroforese før du fortsetter fremover.
- Monter høyre og venstre homologi armregioner med motstandskassetten i et HDR-sjablongplasmid ved Golden Gate-kloning 28 . Bruk pGolden-Neo eller pGolden-Hygro plasmider 30 som kilde til loxP-flankerte motstandskassetter (loxP-PGK-Neo-pA-loxP eller loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Bruk pUC19-BsaI, en modifisert pUC19 med BsaI-steder i den multiple kloningsregionen og eliminert BsaI-steder andre steder som mottakervektor (tilgjengelig på forespørsel). Bruk et forhold på 1: 1: 1: 1 for de tre innleggene og vektoren.
- Tilbered følgende reaksjonsblanding 30 :
Høyre homolog arm PCR produkt 0,06 pmol (30-40ng) Venstre homologi arm PCR produkt 0,06 pmol (30-40ng) PGolden-Neo-plasmid (100 ng / μl) 1 &# 181; L PUC19-BsaI plasmid (100 ng / μl) 1 μl 2x T7 DNA ligase buffer 5 ul BsaI (10 U / μl) 0,75 μl T7 DNA ligase (3000 U / μl) 0,25 μl Vann Opptil 10 μl - Bruk følgende termocyklerparametere: 37 ° C i 5 minutter, 20 ° C i 5 minutter. Gjenta i 30 sykluser.
- Behandle kloningsproduktet med en exonuklease per produsentens instruksjoner for å fordøye gjenværende lineært DNA.
- Omforme reaksjonsblandingen til en kompetent E. coli- stamme i henhold til protokollen som følger med cellene, og platen på ampicillinholdige retter.
- Tilbered følgende reaksjonsblanding 30 :
- For å identifisere kloner med riktig malmontering, utfør bakterierAl koloni-PCR for å amplifisere homologarmarmenes delregioner av den samlede innsatsen (da hele innsatsen kan være for stor til å amplifisere pålitelig). Bruk en primer-annealing til den flankerende plasmidsekvensen og en andre primer som er komplementær til kanten av motstandskassetten ( figur 1B , sekvensen er vanlig for både Neo og Hygro innlegg), og genererer et forsamlingsavhengig produkt som er ca. 200 bp lengre enn Den inneholdte homologarmen:
PUC19-Bsal-venstre: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Motstand-venstre: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-Høyre: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Motstand-Høyre: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Velg bakteriekolonier med sterile tannpirkere og suspendere bakteriene i 20 μl vann. Varm ved 95 ° C i 15 minutter, og spinn ned i en tavlecentrifuge ved maksimal hastighet i 5 minutter. Plasser umiddelbart på is.
- Forbered følgende PCR-blanding 31 </ Sup>:
Fortynn koloni mal 1,25 μl 10x Taq reaksjonsbuffer 1,25 μl 20mM dNTPs 0,25 μl 10 μM Forward primer 0,25 μl 10 μM omvendt primer 0,25 μl Taq Polymerase 0,25 μl Vann 9 μl - Bruk følgende termocyklerparametre: 95 ° C i 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min / kb), gjenta i 25 sykluser, 72 ° C i 2 min.
- Sjekk PCR-produktet for riktig amplikonstørrelse ved hjelp av agarosegelelektroforese.
- Eventuelt, miniprep plasmid DNA fra individuelle kolonier med korrekt innsatsstørrelse og sekvens thE-homologi armregioner ved Sanger-sekvensering med amplifikasjonsprimere nevnt ovenfor.
4. Transfeksjon av CRISPR-komponenter i dyrkede celler
- Før transfeksjon: kultur T-REx293 celler i DMEM media tilsatt 10% FBS ved 37 ° C og 5% CO2.
- Plate celler på 6-brønn plater og vokse til ca 70% konfluens. Inkluder en brønn for en uovervåket kontroll.
- Transfekt celler med 2,5 μg totalt plasmid ved bruk av en kommersiell transfeksjonsprotokoll. Parallelt opprettholder utransfekterte kontrollen.
MERK: Transfeksjonsmetode og effektivitet varierer avhengig av celletype. Bestem riktig transfeksjonsmetode for systemet før eksperimentet.- For transfeksjon av celler med utvalg, bruk 0.75 μg Cas9-sgRNA 1 (venstre kutt), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (høyre kutt) og 1,0 μg homolog rekombinationsmal.
- For transfeksjonPå celler uten valg, bruk 2,5 μg Cas9-sgRNA plasmid.
5. Drug Selection
- 48 timer etter transfeksjon, behandle cellene med det aktuelle legemidlet (Neomycin / Hygromycin). Utfør valg til alle celler i den utransfekterte kontrollen dør (vanligvis 3-5 dager for Neo, 7-14 dager for Hygro).
MERK: Bruk konsentrasjoner på 500 μg / ml og 10 μg / ml for henholdsvis Neomycin og Hygromycin for T-REx293-celler. For andre celletyper kan det være nyttig å utføre en tidligere titrering av legemiddel på utransfekterte celler for å bestemme den effektive konsentrasjonen.
6. Isolering av klonale populasjoner
- Voks celler til 100% konfluens i den opprinnelige brønnen etter valg. Frøceller i 96 brønnplater med en tetthet på 0,33 celler per brønn.
MERK: Seeding tre 96 brønnplater er et godt utgangspunkt for å sikre isolasjon av mer enn en riktig klon, men det kan mer eller mindre være nødvendig å deponereSlutter på sgRNA og HDR effektivitet. - Følg kolonier over en 2-4 ukers periode, til kolonier er synlige for øyet. Velg synlige kolonier med en steril pipettespiss og reser i nye brønner for å oppmuntre monolagsvekst. Ved bruk av suspensjonsceller kan selv lavere sjødensiteter brukes til å sikre en større andel av enkeltkoloni brønner.
7. Screening kandidater
- Screening kandidater uten bruk av utvalg: dot blot
- Voks individuelle kloner til 50-100% konfluens. Fjerne monolaget av celler ved pipettering i brønnen.
- Aliquot 90 μL av 100 μl totalt volum til et rent mikrocentrifugerør. Spinn ned ved 6000 rpm i 5 minutter, fjern media og lyscellepellet i 10 μl 1x Lysis Buffer eller 1x SDS-påføringsbuffer (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% brompenolblå, 40% Glycerol, 100 mM DTT). Legg til 90 μl nye medier til resten av cellene i brønnenJeg fortsetter å forplante meg.
- Pipetter 1 μl cellelysat på en tørr nitrocellulosemembran for å danne en prikk. Ta hver prøve to ganger på to separate membraner, og opprett to identiske mønstre av prøver.
- Blokker membranene i 5% melk i TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris base, opptil 1 L destillert vann, pH 7,4) 31 i 1 time ved romtemperatur Med rocking, her og gjennom hele prosedyren).
- Bare bruk av det primære antistoffet mot målproteinet på en membran og det primære antistoffet for et kontrollprotein (tubulin, GAPDH, eller noe annet protein som ikke forventes å forandre seg) på den andre. Bruk anbefalt primær antistoff fortynning (0,2 μg / mL for ELAVL1 og 0,1 μg / mL for Pum2 i dette tilfellet) i TBST + 5% melk. Inkubér 1 time ved romtemperatur.
- Vask 3 ganger med TBST i 5 minutter.
- Inkuber hver membran med passende HRP-konjugert sekundært antistoff i TBST + 5% melk i 1 time ved romtemperatur.
- Vask 3 ganger med TBST i 5 minutter.
- Påfør kjemiluminescenssubstratoppløsning (se Materialebord) i henhold til produsentens instruksjoner og bilde den blottet membranen på en digital kjemiluminescensbilder.
- Kvantifiser prikkintensiteter for mål- og kontrollproteiner ved hjelp av riktig programvare.
- Eliminer kandidater med lavt kontrollproteinsignal, og beregne bakgrunns-subtraherte forhold mellom mål for å kontrollere proteinintensiteter for de resterende kandidatene. Velg kandidatene med de laveste forholdene for passering og videre validering av Western blot.
- Screening kandidater med bruk av utvalg: koloni PCR
- Samle celle lysat ved hjelp av et DNA prep kit (Se Material Table ).
- Dupliserer individuelle kolonier i en ny 96-brønn og vokser til 100% konfluens.
- Fjern media fra ett sett av klonene, aOg resuspender celler i 30 ul ekstraksjonsbuffer fra settet. Overfør til en ren 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Oppvarm oppløsningen til 96 ° C i 15 minutter og la avkjøle til romtemperatur.
- Tilsett 30 μl stabiliseringsbuffer fra settet. Bland godt.
- Identifiser wildtype og monoallel / biallelmutant linjer ved koloni PCR.
- Design to separate sett med PCR-primere (for venstre og høyre side av målrettet lokus) for å amplifisere regioner rundt homologarmarmer basert på enten vellykket eller mislykket integrasjon av motstandskassetten ( figur 2C ). På hver side bruker du en felles primer (rød) som annealer utenfor homologarmen. Bruk den med en tilsvarende parret primer som er komplementær til den endogene sekvensen, som spenner over homologiregionen (blå), for å teste for vildtype allelen. Bruk en annen parret primer, komplementær til den innsatte motstandskassetten (se primere i seksjon2.3), for å teste for ønsket mutasjon.
- (Anbefalt) Bekreft primer settene ved hjelp av celle lysat fra den opprinnelige utvalgte bulkcellepopulasjonen, siden den vil inneholde en blanding av både WT og mutant alleler ( Figur 2D ).
- Forbered følgende reaksjonsblanding:
Celllysat 0,5 μl 10x KOD buffer 1,25 μl 25 mM MgSO4 0,75 μl 2 mM dNTPs 1,25 μl 10 μM Forward primer 0,375 μl 10 μM omvendt primer 0,375 μl KOD polymerase 0,25 μl Vann 7,75 μl - Bruk følgende termocyklerbetingelser: 95 ° C i 2 minutter, (95 ° C i 20 s, Primer Tm i 10 s, 70 ° C i 20 s / kb), gjenta i 25 sykluser.
- Visualiser PCR-produktet ved hjelp av agarosegelelektroforese.
- Gjenta koloni-PCR-testingen for hver side av den antatte integrasjonen. Velg og utvide kandidater som viser tilstedeværelse av integrasjon og ikke endogent sekvensprodukt for den slettede regionen.
- Valider positive kandidater med Western blot og / eller RT-qPCR.
- Samle celle lysat ved hjelp av et DNA prep kit (Se Material Table ).
8. Bekreft den genomiske mutasjonen ved sekvensering
- Isoler genomisk DNA fra mutantcellelinjer ved fenolkloroformekstraksjon 31 .
- PCR amplifiserer sgRNA-målområdet, ved bruk av primere med 5'-overheng som legger BsaI-restriksjonssteder til hver ende.
MERK: For kloner som er redigert med HDR, hvor begge alleler kan være identiske, kan PCR-produktet sekvenseres direkte. - Klon det amplifiserte området inn i pUC19-BsaI ved Golden Gate-kloning.
- Omforme reaksjonsblandingen til en kompetent E. coli- stamme.
- Miniprep plasmid DNA fra 6-10 individuelle kolonier og sekvens det klonte området ved Sanger-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For generering av ELAVL1 knockout linjer, var et robust antistoff tilgjengelig, slik at redigering ved bruk av enkelt sgRNAer ( Figur 1A , venstre) ble utført, fulgt av prikkimmunoblot. Tre sgRNA ble transfektert uavhengig for å sammenligne effektivitet og å utelukke mål-effekter i de resulterende klonene. Etter oppsamling og blotting av cellelysater fra klonale populasjoner på to nitrocellulosemembraner ble blottene undersøkt for både ELAVL1 og PUM2 (som en normaliseringskontroll) ( Figur 2A ). Det kvantifiserte forholdet mellom ELAVL1 og PUM2-signalet viste et svært bredt,> 10 4- foldsintervall blant de isolerte linjene ( figur 2B ). Ved å bruke dette forholdet som et utvalgskriterium, validerte vi en rekke linjer ved hjelp av ELAVL1 western blots ( Figur 3A ). I de fleste tilfeller var klonpopulasjoner med det laveste relative ELAVL1-signaletKorrekt identifisert som knockouts ( figur 2B ), som bekrefter den prediktive kraften til denne kvantifiseringen (til tross for betydelig variasjon i styresignalet, som sannsynligvis oppsto fra forskjellige antall innsamlede celler). Omvendt utviste de fleste klonene med mellomliggende forhold ELAVL1-signal ved validering, som potensielt representerte monoallelle deletjonshendelser. Imidlertid ble ingen generell tiering av forholdene i WT observert monoalleliske og fulle (biallelle) mutantpuljer, og selv de ELAVL1-positive klonene viste et bredt og kontinuerlig nivånivå, trolig på grunn av klonal variabilitet av ekspresjon. Den samlede effekten av ELAVL1 knockout generasjon ved hjelp av denne metoden varierte fra 6 til 36% blant sgRNAene.
For andre genmål (som PUM2) forhindrer kvaliteten på de tilgjengelige antistoffene nøyaktig screening av kandidatkloner med dot blot på grunn av høy bakgrunn fra kryssreaktorvity. I tillegg kan effektiviteten til å målrette noen genomiske loki være betydelig lavere på grunn av kromatintilgjengelighet. I slike tilfeller er en utvalgsavhengig metode hensiktsmessig for å øke effektiviteten. To sgRNAer rettet mot tidlig og sent kodende regioner av PUM2 ble kotransfektert med en homologiregeret reparasjonsmal for å aksessere 45 kb genomisk DNA og erstatte det med en neomycinresistenskassett ( Figur 1A , høyre). Montering av homologemalen er illustrert i figur 1B . PCR-primere ble utformet for å amplifisere regioner rundt homologarmarmer basert på enten vellykket eller mislykket integrasjon av resistenskassetten ( figur 2C ), og ble testet på ikke-transfekterte og de valgte massecellene (venstre panel). Som forventet, i utransfekterte celler, ble det bare observert en amplikon tilsvarende den endogene tilstanden (topp), mens de utvalgte cellene viste amplikoner fra begge delerWild-type og mutant alleler. Cellelysater fra genererte klonale kandidater ble samlet og screenet for nærvær av både den endogene sekvensen og motstandskassetten. Kandidatutslag ble identifisert ved nærvær av resistentkassette amplikon alene, hvilket indikerer biallelisk deletjon / integrasjon ( figur 2D , stjerner). Kloner med monoallelle innsatser ble også observert, og var ganske vanlige, siden slike populasjoner også kan overleve utvelgelsesprosessen. Disse klonene ble indikert ved nærvær av både den endogene sekvensen og motstandskassetten. I noen få tilfeller ble klonale vildtyper på det testede locus også observert, noe som tyder på at tilfeldig, ikke-sgRNA-assistert genomisk integrasjon av den homologiregerte reparasjonsmalen opptrer ved lav frekvens. Biallelmutantlinjer ble ytterligere validert av Western blot ( Figur 3B ). Den totale effektiviteten av knockout-generasjonen ved hjelp av HDR-prosedyren var 33%.
Figur 1: En arbeidsflyt for generering av CRISPR-medierte knockouts i pattedyrcellelinjer. ( A ) Genome redigering hendelser produsert av CRISPR / Cas9 spaltning og NHEJ (venstre) eller HDR (høyre). Nettstedet for Cas9 spaltning er betegnet av en hvit vertikal linje. ( B ) Komponenter og montering av HDR-templatplasmidet. Type IIs restriksjonsenzymer som anvendes i Golden Gate-kloning, slik som BsaI, gjenkjenner en asymmetrisk DNA-sekvens og la et forskjøvet kutt utover gjenkjenningssekvensen, slik at det blir mulig å designe vilkårlige overlappende segmenter for montering (bildet). Pilene indikerer primerposisjonene for å sjekke om riktig plasmidmontering. ( C ) Arbeidsflyt: Etter transfeksjon (og valg av stoffet hvis det er aktuelt), blir celler plettet ved begrensende fortynninger i 96-brønnsplater. Klonale populasjonerBlir vist enten ved prikkimmunoblot (utvalg-uavhengig, NHEJ) eller koloni-PCR (utvalgsavhengig, HDR). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Screening kandidat knockout linjer med prikk blots eller koloni PCR. ( A ) prikkimmunoblot av isolerte ELAVL1-målrettede kloner med ELAVL1-antistoff (venstre) og separat med et antistoff for et kontrollprotein, Pum2 (høyre). Kloner som viste lite kontrollsignal, sannsynligvis på grunn av lavt proteininntak, er merket med en X og utelukket fra videre analyse. Kloner med lavt ELAVL1-signal (sirkler) ble ytterligere testet av western blots som bekreftet (grønn) eller ugyldiggjorte (grå) kandidatene. ( B ) Kvantifisering av KO cAndidates fra dot blot. Forholdene til ELAVL1 for å kontrollere proteinsignalet i punktflaten vist i A, i stigende rekkefølge. ( C ) Primer-design for utkobling / innsettingstesting via koloni-PCR. En primer som er komplementær til det genomiske locus utenfor den homologiske armregionen (rød) er parret med en primer komplementær til den endogene sekvensen (blå) eller mot resistenskassetten (grønn), probing for den ubearbeidede tilstand, eller en deletion / innsettingshendelse , Henholdsvis. Separate primerpar er designet for å teste begge sider av integrasjonen. ( D ) Eksempel agarosegel av koloni-PCR-resultater ved bruk av primere som spenner oppstrøms integrasjonskrysset ved bruk av endogene indre primere (topp) og knockout inne i primere (bunn). Primers er først validert i både foreldre T-REx293 celler og bulk utvalgte celler (venstre). Individuelle kandidatkloner (midt) og forventede båndmønstre for WT, KO og monoallel deletion (WT / KO) kloner (høyre). Bialleliske knockout kloner er indikertD av en stjerne. De riktige amplifikasjonsproduktene er indikert med svarte piler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Validering av knockoutkandidater med Western blot. ( A ) Western blot for ELAVL1 (topp) av en delmengde kloner identifisert av dot blot. PUM2 ble blottet på samme membran som en lastekontroll (bunn). ( B ) Western blot for PUM2 (topp) av en delmengde kloner identifisert av koloni PCR. GAPDH ble blottet på samme membran som en lastekontroll (bunn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR / Cas9-systemet har muliggjort effektiv generering av stabile genomiske modifikasjoner, noe som gir et mer konsekvent alternativ til andre forbigående manipulasjonsmetoder. Her har vi presentert to metoder for rask identifisering av CRISPR / Cas9 gen-knockouts i pattedyrcellelinjer. Begge metodene krever lite cellemateriale, så testing kan gjøres i tidlige stadier av klonalkultur, sparer tid og reagenser. For å øke effektiviteten av begge metodene, anbefaler vi å teste flere sgRNAer, da effektiviteten varierer avhengig av sekvens og genomisk plassering. I tillegg er bruk av flere sgRNAer nyttig ved å identifisere off-target-effekter ved å detektere outlier-fenotyper som et resultat av mutasjoner i ikke-målrettede gener. Effektiv transfeksjon og Cas9 spaltning vil øke sjansene for å generere knockouts. Alternativt transfekterer cellene direkte med kommersielt hentede sgRNA / Cas9 ribonukleoproteinkomplekser 32 ,33 kan fremskynde protokollen og redusere off-target-effekter.
Dot blots er velegnet til å vurdere protein knockouts forårsaket av små genomiske endringer på grunn av NHEJ. Siden bare en enkelt sgRNA / Cas9-konstruksjon er nødvendig, kan denne tilnærmingen være den raskeste for å oppnå nulllinjer, og blot-prosedyren omgår ytterligere trinn for å fremskynde screeningen. Det normaliserte immunoblotproteinsignalet tjener som en pålitelig prediktor for vellykket validering ( figur 2B ). Denne protokollen er ideell for generering av knockouts med minimal genomisk forstyrrelse. Alternativt kan denne fremgangsmåten for screening tilpasses til probe for proteinaddisjon eller modifisering, så som transgene proteiner eller protein-koder. Imidlertid krever denne screeningsmetoden et antistoff med høy spesifisitet til proteinet av interesse, idet krysreaktivitet fører til høy bakgrunn i prikkblott. Denne metoden er naturlig begrenset til mutasjonsmålrettingProteinkoding regioner, da den endelige produksjonen avhenger av nærvær / fravær av et proteinprodukt. Det er også viktig å merke seg at mutasjoner forårsaket av NHEJ kan føre til en rekke proteinutfall, inkludert et protein med konstitutivt aktiv, delvis eller dominerende negativ funksjon, eller et funksjonelt protein som mangler deteksjonsantistoffepitopen. For å minimere disse problemene, er det nyttig å målrette Cas9-kuttet så tidlig inn i kodingsområdet som mulig, for å øke sjansene for å generere et helt ikke-funksjonelt protein. I tillegg kan målrettede genomiske regioner som er mindre tilgjengelige for Cas9-maskineri, produsere lave deletjonsutbytter i fravær av valg. Endelig kan knockouts som gir en selektiv ulempe være vanskelig å oppnå ved denne fremgangsmåte av tilsvarende grunner.
Ved hjelp av homologiregerte reparasjonsmekanismer sammen med CRISPR / Cas9 spaltning muliggjør mye større og mer spesifikke genomiske manipulasjoner, som kan inkludere både laRGE-skala deletjoner (avgrenset av to sgRNA spaltninger) og innsettinger. Siden to spaltningshendelser og en presis reparasjonsprosess må finne sted, øker integrasjonen av en medikamentresistansmarkør vesentlig økning av utbytte ved bruk av denne metoden. Selv om dot blot-deteksjon også kan brukes, er screening ved koloni-PCR mer generelt anvendelig for nøyaktig å detektere korrekte integrasjon / knockout-kandidater med så store genomiske forstyrrelser. Videre muliggjør testing ved PCR identifisering av kloner med ufullkomne og ufullstendige integrasjoner, som kan gi innsikt i omfanget og naturen av HDR-prosessen selv. I tillegg kan den introduserte markøren senere fjernes (ved transient Cre-ekspression eller tilsetning i membran-permeabel form), etterlater en minimal 34 bp deletions arr (loxP-plass) og muliggjør fremtidig gjenbruk av seleksjonsmarkøren. Fleksibiliteten til denne tilnærmingen øker ved bruk av flere motstandsmarkører, som tillater generering av flere cumuLative protein knockouts. Det er viktig ved bruk av denne metoden at fraværet av produkt er ytterligere validert, for eksempel ved RT-qPCR av det forventede transkripsjon. Siden denne skjermen kan være antistoff-uavhengig, kan denne metoden lett påføres proteinutslag uten et robust antistoff, samt å oppdage endringer som ikke faller i proteinkoding gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Gissell Sanchez, Megan Lee og Jason Estep for eksperimentell assistanse, og Weifeng Gu og Xuemei Chen for å dele reagenser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
