Summary
Nylige fremskridt i evnen til at genetisk manipulere somatiske cellelinier har stort potentiale for grundlæggende og anvendt forskning. Her præsenterer vi to metoder til CRISPR / Cas9 genereret knockout produktion og screening i pattedyrcellelinjer, med og uden brug af selekterbare markører.
Abstract
CRISPR / Cas9 genomteknik systemet har revolutioneret biologi ved at tillade præcis genom redigering med lidt indsats. Guided af en enkelt guide RNA (sgRNA), der giver specificitet, spalter Cas9-proteinet begge DNA-tråde på det målrettede sted. DNA-pause kan udløse enten ikke-homolog slutningen (NHEJ) eller homologi-rettet reparation (HDR). NHEJ kan introducere små sletninger eller insertioner, der fører til rammeskift mutationer, mens HDR muliggør større og mere præcise forstyrrelser. Her præsenterer vi protokoller til generering af knockout-cellelinjer ved at kombinere etablerede CRISPR / Cas9 metoder med to muligheder for downstream-udvælgelse / screening. NHEJ-tilgangen anvender et enkelt sgRNA-cut-site og selektionsuafhængig screening, hvor proteinproduktion vurderes ved prik-immunoblot på en høj gennemstrømningsmåde. HDR-fremgangsmåden anvender to sgRNA-cut-sites, der spænder over genet af interesse. Sammen med en leveret HDR-skabelon kan denne metode opnå sletningAf titus kb, hjulpet af den indsatte valgbare resistansmarkør. De relevante applikationer og fordele ved hver metode diskuteres.
Introduction
Stabile genetiske ændringer giver en fordel i forhold til transiente metoder til cellulær forstyrrelse, som kan variere i deres effektivitet og varighed. Genomisk redigering er blevet mere og mere almindelig de seneste år som følge af udviklingen af målspecifikke nukleaser, såsom zinkfinger-nukleaser 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkriptionsaktivator-lignende effektor-nucleaser (TALEN'er) 6 , 7 , 8 , 9 Og RNA-styrede nucleaser afledt fra de klyngede, regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) system 10 .
CRISPR / Cas9-redigeringsmaskinen er tilpasset et immunsystem, som bakterier og archaea bruger til at forsvare mod virusinfektionerAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . I denne proces inkorporeres korte 20-30 nt-fragmenter af invaderende virussekvens i et genomisk locus som "afstandsstykker" flankeret af gentagende enheder 14 , 15 . Efterfølgende transkription og RNA-behandling genererer små CRISPR-associerede RNA'er 16 (crRNA'er), der sammen med et transaktiverende crRNA 17 (tracrRNA) samler med effektor Cas9 endonuclease. CrRNA'erne tilvejebringer således specificitet til Cas9-målretning, styring af komplekset til spaltning af komplementære virale DNA-sekvenser og forebyggelse af yderligere infektioner 18 , 19 . Enhver "protospacer" -sekvens i det målrettede DNA kan tjene som kilden til crRNA, så længe den er direkte 5 'til et kort protospacer tilstødende motiv (PAM), NGG i tilfælde af S. pyogenes Cas9 21 .
Ved ekspression af Cas9 og et sgRNA i eukaryote celler spalter Cas9-proteinet begge DNA-tråde på det målrettede sted. I fravær af en egnet region af homolog sekvens fikserer cellen denne pause via ikke-homolog end-sammenføjning (NHEJ) 22 , 23 , 24 , som typisk introducerer små deletioner eller sjældent insertioner. Når du målretter mod en åbenLæserammen fører reparationen sandsynligvis til en translationsramme, der frembringer et ikke-funktionelt proteinprodukt. I modsætning hertil kan cellen, når den er forsynet med en eksogen template med store områder af homologi, rette dobbeltstrengspausen ved hjælp af homologi-rettet reparation 25 , 26 . Denne rute tillader større præcise deletioner, udskiftninger eller insertioner i genomet, kombineret med indførelsen af excisable markeringsmærker 27 .
Her præsenterer vi protokoller til generering af knockout-cellelinjer ved hjælp af en af disse to CRISPR / Cas9 metoder ( figur 1A ). NHEJ-tilgangen anvender et enkelt sgRNA-cut-site og selektionsafhængig screening, og kræver derfor lidt forudgående forberedelse. Ved brug af denne metode skal guide RNA'er komplementære til exoner nær 5'-enden af transkriptet, som mest sandsynligt frembringer en knockout, skal udformes. Siden modificatIoner til genomet i dette tilfælde er små, screening for knockout-kloner er baseret på prikblots, hvor proteinproduktet vurderes på høj gennemstrømningsmåde. Vi bruger generationen af ELAV-lignende 1 protein (ELAVL1) knockout linjer som et eksempel. Den anden tilgang er baseret på homologi-rettet reparation (HDR) og bruger to sgRNA-cut-sites, der spænder over genet eller regionen af interesse, hvilket tillader sletninger af titusvis af kb. Et plasmid med to regioner af homologi, der flankerer spaltningsstederne, tilvejebringer en erstatningsskabelon ( figur 1B ), der indfører en selekterbar resistensmarkør, som øger effektiviteten af knockout-generationen. Denne metode kan også tilpasses til at indføre genmodifikationer med ordentligt udformede homologi arme. I dette tilfælde muliggør integrationen af et nyt DNA-fragment PCR-baseret screening ( figur 1C ). Her bruger vi generationen af Pumilio RNA bindende familiemedlem 2 (PUM2) knockout linjer som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Identifikation af homologiregioner omkring den ønskede sletning
BEMÆRK: Kun nødvendigt, hvis du bruger valgbaseret redigering.
- Vælg to regioner, oprindeligt 1,5-2 kb, på hver side af det ønskede sletningslokal, som vil fungere som homologearmer i HDR-skabelonen ( Figur 1A ). Identificer regioner, der mangler BsaI anerkendelsessteder på begge strenger (GGTCTC) for at lette kloning. Hvis BsaI-steder er uundgåelige, skal du bruge et alternativt type IIs restriktionsenzym (BsmBI, SapI, BbsI) og modificere de tilsvarende steder i recipientplasmidet (pUC19-BsaI), resistormarkør-donorplasmidet (pGolden-Neo eller pGolden-Hygro) og Homologi arm PCR produkt overhæng.
2. Frembringelse af Cas9-sgRNA-ekspressionsplasmider
- Definer målretningssite (er) til mutagenese. For den enkeltskårne, valgfri metode skal du målrette 5 'proksimale kodende exoner for at øge sandsynligheden for en ikke-fuNionel mutation. For to-cut-metoden, vælg to steder, der spænder over så meget af genet som nødvendigt.
BEMÆRK: Efter vores erfaring er sletninger op til 53 kb effektivt oprettet. - Indtast 200 til 300 bp af den målrettede områdesekvens i crispr.mit.edu designværktøjet. Ved udvælgelsesbaseret kloning anvendes 200-300 bp af de identificerede homologiregioner, som er proximale til deletionslokalet ( figur 1A ). Vælg 2-3 af de højest placerede sgRNA'er pr. Målrettet region for at tage højde for forskelle i deres aktivitet og for at isolere uafhængige kloner, der ikke deler de samme potentielle off-target-effekter.
- For at designe duplexede oligonukleotider med passende overhæng til indsættelse i ekspressionsplasmidet udelades den endelige PAM-sekvens (NGG) og tilføjer et 5'-CACC-overhæng efterfulgt af en G til topstrengoligoen. For bundstrengoligoen tilføjes et 5'-AAAC overhæng til den omvendt komplementerede målsekvens efterfulgt af en 3'-C som ilLustrerede nedenfor:
- Indsæt syntetiske oligonukleotider svarende til sgRNA'erne i pSpCas9 (BB) plasmidet under anvendelse af Golden Gate-kloning 28 som beskrevet i Zhang lab-protokol 29 .
3. Generering af homologiregerede reparationsskabelonplasmider
BEMÆRK: Kun nødvendigt, hvis du bruger valgbaseret redigering. Det homologiregerede reparationsskabelonplasmid består af en lægemiddelresistens-kassette flankeret af to regioner, som er komplementære til genomet lige udenfor de to sgRNA-målsteder ( figur 1B ).
- Fra de bredere homologiregioner, der er identificeret i trin 1.1, vælger 800-1000 bp 26 ikke mere end 5-10 bp væk fra de udformede Cas9 cut-steder for at tjene som homologearmerne ( figur 1A ). Sørg for ikke at medtage sgRNAMålsted og dets PAM i homologiarmene, da dette vil medføre CRISPR / Cas9-spaltning af template-plasmidet selv. Hvis homologiarmene indeholder interne BsaI-steder, skal du bruge alternative sgRNA-steder.
- PCR amplificerer homologarmarmer fra genomisk DNA ved anvendelse af en højfidelitets DNA-polymerase, pr. Producentens instruktioner, ved hjælp af fremad- og reverse-primere med yderligere 5'-sekvens, der introducerer BsaI-steder (GGTCTC) og unikke overhæng i begge ender af homologiregionen. Overhængene skal indeholde korrekte sekvenser for at generere korrekt monteringsrækkefølge og orientering som beskrevet nedenfor ( Figur 1B ):
Venstre homologi arm FP overhæng: 5 'GGGTCTCA GGCC
Venstre homologi arm RP overhæng: 5 'GGGTCTCT CACG
Højre homologi arm FP overhæng: 5 'GGGTCTCA GTCC
Højre homologi arm RP overhæng: 5 'GGGTCTCT CCAC - Tjek homologi arme for passende amplifIcation via gelelektroforese, inden du fortsætter fremad.
- Saml højre og venstre homologi arm regioner med modstandskassetten ind i et HDR skabelon plasmid ved Golden Gate kloning 28 . Brug pGolden-Neo eller pGolden-Hygro plasmider 30 som kilde til loxP-flankerede modstandskassetter (loxP-PGK-Neo-pA-loxP eller loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Brug pUC19-BsaI, en modificeret pUC19 med BsaI steder i multiple kloning regionen og eliminerede BsaI steder andre steder som modtager vektor (tilgængelig efter anmodning). Brug et forhold på 1: 1: 1: 1 for de tre indsatser og vektoren.
- Forbered den følgende reaktionsblanding 30 :
Right homology arm PCR produkt 0,06 pmol (30-40ng) Venstre homologi arm PCR produkt 0,06 pmol (30-40ng) PGolden-Neo-plasmid (100 ng / μl) 1 &# 181; L PUC19-BsaI plasmid (100 ng / μl) 1 μl 2x T7 DNA ligase buffer 5 μl BsaI (10 U / μl) 0,75 μl T7 DNA ligase (3000 U / μl) 0,25 μl Vand Op til 10 μl - Brug følgende termocyklerparametre: 37 ° C i 5 minutter, 20 ° C i 5 minutter. Gentag i 30 cykler.
- Behandle kloningsproduktet med en exonuklease pr. Producentens anvisninger for at fordøje det resterende lineariserede DNA.
- Omsæt reaktionsblandingen til en kompetent E. coli- stamme ifølge protokollen, der følger med cellerne, og plade på ampicillinholdige fade.
- Forbered den følgende reaktionsblanding 30 :
- For at identificere kloner med den korrekte skabelonsamling, udfør bakterierAl koloni-PCR for at amplificere homologarmarmsegmenterne i den samlede indsats (da hele indsatsen kan være for stor til at amplificere pålideligt). Brug en primerglødning til den flankerende plasmidsekvens og en anden primer komplementær til kanten af modstandskassetten ( figur 1B , sekvensen er fælles for både Neo og Hygro-indsatser), hvilket frembringer et samlingsafhængigt produkt, som er ca. 200 bp længere end Den indeholdte homologiarm:
PUC19-Bsal-venstre: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Modstand-venstre: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-Højre: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Modstand-Højre: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Vælg bakteriekolonier med sterile tandstikkere og suspender bakterierne i 20 μl vand. Varm ved 95 ° C i 15 minutter, og spind ned i en tabletopcentrifuge ved maksimal hastighed i 5 minutter. Placer straks på is.
- Forbered den følgende PCR-blanding 31 </ Sup>:
Fortynd koloni skabelon 1,25 μl 10x Taq reaktionsbuffer 1,25 μl 20 mM dNTP'er 0,25 μl 10 μM Forward primer 0,25 μl 10 μM Reverse primer 0,25 μl Taq Polymerase 0,25 μl Vand 9 μl - Brug følgende termocyklerparametre: 95 ° C i 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min / kb), gentag i 25 cyklusser, 72 ° C i 2 min.
- Kontroller PCR-produktet for korrekt ampliconstørrelse ved hjælp af agarosegelelektroforese.
- Eventuelt kan miniprep plasmid DNA fra individuelle kolonier med korrekt indsatsstørrelse og sekvens thE-homologiarmregioner ved Sanger-sekventering med amplifikationsprimerne nævnt ovenfor.
4. Transfektion af CRISPR-komponenter i dyrkede celler
- Før transfektion: kultur T-REx293 celler i DMEM medier tilsat 10% FBS ved 37 ° C og 5% CO2.
- Plader celler på 6-brønds plader og vokser til ca. 70% konfluens. Inkluder en brønd for en uoverfisket kontrol.
- Transfektorer med 2,5 μg totalt plasmid ved anvendelse af en kommerciel transfektionsprotokol. Parallelt skal du opretholde den utransficerede kontrol.
BEMÆRK: Transfektionsmetode og effektivitet varierer afhængigt af celletype. Bestem den relevante transfektionsmetode for systemet forud for eksperimentet.- Til transfektion af celler med udvælgelse anvendes 0,75 μg Cas9-sgRNA 1 (venstre snit), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (højre snit) og 1,0 μg homolog rekombinationsskabelon.
- Til transfektionPå celler uden udvælgelse, brug 2,5 μg Cas9-sgRNA plasmid.
5. Drug Selection
- 48 timer efter transfektion behandler cellerne med det passende lægemiddel (Neomycin / Hygromycin). Udfør valg indtil alle celler i den ikke-overførte kontrol dør (typisk 3-5 dage for Neo, 7-14 dage for Hygro).
BEMÆRK: Brug koncentrationer på 500 μg / ml og 10 μg / ml for henholdsvis Neomycin og Hygromycin til T-REx293 celler. For andre celletyper kan det være nyttigt at udføre en tidligere titrering af lægemiddel på utransficerede celler for at bestemme den effektive koncentration.
6. Isolering af klonale populationer
- Væk celler til 100% sammenflydelse i den oprindelige brønd efter udvælgelsen. Frøceller i 96 brøndsplader med en tæthed på 0,33 celler pr. Brønd.
BEMÆRK: Seeding tre 96-brønds plader er et godt udgangspunkt for at sikre isolering af mere end en korrekt klon, men det kan mere eller mindre være nødvendigt at depSlutter på sgRNA og HDR effektivitet. - Overhold kolonierne over en 2-4 ugers periode, indtil kolonier er synlige for øjet. Vælg synlige kolonier med en steril pipettespids og vend tilbage i nye brønde for at fremme monolagsvækst. Ved anvendelse af suspensionsceller kan endnu lavere sødedensiteter anvendes til at sikre en større andel af enkeltkoloni-brønde.
7. Screening kandidater
- Screening kandidater uden brug af udvælgelse: dot blot
- Voks individuelle kloner til 50-100% konfluens. Dislodge monolag af celler ved pipettering i brønden.
- Aliquot 90 μL af 100 μl total volumen til et rent mikrocentrifugerør. Spin ned ved 6000 omdr./min. I 5 minutter, fjern medier og lyscellepellet i 10 μl 1x Lysis Buffer eller 1x SDS-påfyldningsbuffer (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% bromphenolblåt, 40% Glycerol, 100 mM DTT). Tilsæt 90 μL nye medier til resten af cellerne i welJeg fortsætter med at formere.
- Pipetter 1 μl cellelysat på en tør nitrocellulosemembran for at danne en prik. Blot hver prøve to gange på to separate membraner, hvilket skaber to identiske mønstre af prøver.
- Bloker membranerne i 5% mælk i TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris base, op til 1 L destilleret vand, pH 7,4) 31 i 1 time ved stuetemperatur Med rocking, her og i hele proceduren).
- Bare at bruge det primære antistof mod målproteinet på en membran og det primære antistof for et kontrolprotein (tubulin, GAPDH eller et hvilket som helst andet protein, der ikke forventes at ændre sig) på den anden. Brug den anbefalede primær antistof fortynding (0,2 μg / ml for ELAVL1 og 0,1 μg / ml for Pum2 i dette tilfælde) i TBST + 5% mælk. Inkubér 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 3 gange med TBST i 5 minutter.
- Inkubér hver membran med passende HRP-konjugeret sekundært antistof i TBST + 5% mælk i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 3 gange med TBST i 5 minutter.
- Påfør kemiluminescenssubstratopløsning (se Materialebord) efter producentens anvisninger og billedet den blottet membran på en digital kemiluminescensbilleder.
- Kvantificere punktintensiteter for mål- og kontrolproteinerne ved hjælp af den relevante software.
- Eliminer kandidater med lavt kontrolsproteinsignal, og beregne baggrunds-subtraherede forhold mellem mål for at kontrollere proteinintensiteter for de resterende kandidater. Vælg kandidaterne med de laveste forhold for passage og yderligere validering af Western blot.
- Screening kandidater med brug af selektion: koloni PCR
- Saml celle lysat ved hjælp af et DNA prep kit (Se Materialebord ).
- Duplikere individuelle kolonier i en ny 96 brønd og vokse indtil 100% konfluens.
- Fjern medier fra et sæt kloner, aOg resuspender cellerne i 30 μl ekstraktionsbuffer fra kittet. Overfør til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Opvarm opløsningen til 96 ° C i 15 minutter og lad afkøle til stuetemperatur.
- Tilsæt 30 μl stabiliseringspuffer fra sættet. Bland godt.
- Identificere vildtype og monoallel / biallelmutantlinier ved koloni-PCR.
- Design to separate sæt PCR-primere (til venstre og højre side af det målrettede locus) for at amplificere regioner omkring homologarmarmerne baseret på enten succesfulde eller mislykkede integration af modstandskassetten ( figur 2C ). På hver side skal du bruge en fælles primer (rød), der annealer uden for homologarmen. Brug den med en tilsvarende parret primer, som er komplementær til den endogene sekvens, der spænder over homologiregionen (blå), for at teste for vildtype allelen. Brug en anden parret primer, komplementær til den indsatte modstandskassette (se primere i sektion2.3) for at teste for den ønskede mutation.
- (Anbefalet) Valider primersætene ved hjælp af cellelysat fra den oprindelige valgte massecellepopulation, da den vil indeholde en blanding af både WT og mutant alleler ( Figur 2D ).
- Forbered den følgende reaktionsblanding:
Celllysat 0,5 μl 10x KOD buffer 1,25 μl 25 mM MgSO4 0,75 μl 2 mM dNTP'er 1,25 μl 10 μM Forward primer 0,375 μl 10 μM Reverse primer 0,375 μl KOD polymerase 0,25 μl Vand 7,75 μl - Brug følgende termocyklervilkår: 95 ° C i 2 minutter, (95 ° C i 20 s, Primer Tm i 10 s, 70 ° C i 20 s / kb) gentages i 25 cyklusser.
- Visualiser PCR-produktet ved hjælp af agarosegelelektroforese.
- Gentag koloni-PCR-testningen for hver side af den forudsagte integration. Vælg og udvide kandidater, der viser tilstedeværelsen af integration og intet endogent sekvensprodukt for den slettede region.
- Valider positive kandidater med western blot og / eller RT-qPCR.
- Saml celle lysat ved hjælp af et DNA prep kit (Se Materialebord ).
8. Kontroller den genomiske mutation ved sekventering
- Isolér genomisk DNA fra mutante cellelinier ved phenolchlorformekstraktion 31 .
- PCR amplificerer sgRNA-målområdet ved anvendelse af primere med 5'-overhæng, der tilføjer BsaI-restriktionssteder til hver ende.
BEMÆRK: For kloner, der er redigeret med HDR, hvor begge alleler kan være identiske, kan PCR-produktet sekventeres direkte. - Klon det amplificerede område ind i pUC19-BsaI ved Golden Gate-kloning.
- Omsæt reaktionsblandingen til en kompetent E. coli- stamme.
- Miniprep plasmid DNA fra 6-10 individuelle kolonier og sekvens det klonede område ved Sanger-sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til generering af ELAVL1 knockout linjer var et robust antistof tilgængeligt, så redigering ved anvendelse af enkelt sgRNA'er ( Figur 1A , venstre) blev udført efterfulgt af prikimmunoblot. Tre sgRNA'er blev transficeret uafhængigt for at sammenligne effektiviteter og at udelukke målvirkninger i de resulterende kloner. Efter opsamling og blotting af cellelysater fra klonale populationer på to nitrocellulosemembraner blev blottene probet for både ELAVL1 og PUM2 (som en normaliseringskontrol) ( Figur 2A ). Det kvantificerede forhold mellem ELAVL1 og PUM2-signalet viste et meget bredt,> 10 4- gange interval blandt de isolerede linjer ( figur 2B ). Ved anvendelse af dette forhold som et valgkriterium validerede vi en række linjer ved hjælp af ELAVL1 western blots ( figur 3A ). I de fleste tilfælde var klonpopulationer med det laveste relative ELAVL1-signalKorrekt identificeret som knockouts ( figur 2B ), der bekræfter den forudsigende effekt af denne kvantificering (på trods af betydelig variabilitet i styresignalet, hvilket sandsynligvis opstod fra forskellige antal opsamlede celler). Omvendt udviste de fleste kloner med mellemprocent ELAVL1 signal ved validering, hvilket potentielt repræsenterer monoallelle deletionshændelser. Imidlertid blev ingen generel tiering af forholdene i WT observeret monoallelle og fulde (biallelle) mutantpuljer, og selv de ELAVL1-positive kloner viste et bredt og kontinuerligt niveauniveau, sandsynligvis på grund af klonal variabilitet af ekspression. Den samlede effektivitet af ELAVL1-knockoutgenerering ved anvendelse af denne metode varierede fra 6 til 36% blandt sgRNA'erne.
For andre genmål (såsom PUM2) forhindrer kvaliteten af de tilgængelige antistoffer nøjagtig screening af kandidatkloner ved dot blot på grund af høj baggrund fra krydsreaktionvity. Desuden kan effektiviteten af at målrette nogle genomiske loci være væsentligt lavere på grund af chromatin tilgængelighed. I sådanne tilfælde er en udvælgelsesafhængig metode hensigtsmæssig for at øge effektiviteten. To sgRNA'er rettet mod tidlige og senkodende regioner af PUM2 blev cotransficeret med en homologiregeret reparationsskabelon for at excise 45 kb genomisk DNA og erstatte det med en neomycinresistenskassette ( figur 1A , højre). Montering af homologemalen er illustreret i figur 1B . PCR-primere blev designet til at amplificere regioner omkring homologiarmene baseret på enten succesfulde eller mislykkede integration af modstandskassetten ( figur 2C ) og blev testet på ikke-transfekterede og de valgte celler (venstre panel). Som forventet blev der i utransficerede celler observeret kun en amplikon svarende til den endogene tilstand (top), mens de udvalgte celler udviste amplikoner fra beggeVildtype og mutant alleler. Cellelysater fra dannede klonale kandidater blev opsamlet og screenet for tilstedeværelsen af både den endogene sekvens og resistenskassetten. Kandidatknockouts blev identificeret ved tilstedeværelsen af resistentkassette amplicon alene, hvilket indikerer biallel deletion / integration ( figur 2D , stjerner). Kloner med monoallelle insertioner blev også observeret og var temmelig almindelige, da sådanne populationer også kan overleve udvælgelsesprocessen. Disse kloner blev indikeret ved tilstedeværelsen af både den endogene sekvens og modstandskassetten. I nogle få tilfælde blev klonale vildtyper på det testede sted også observeret, hvilket tyder på, at tilfældig, ikke-sgRNA-assisteret genomisk integration af den homologiregerede reparationsskabelon forekommer ved lav frekvens. Biallelmutantlinjer blev yderligere valideret af western blot ( figur 3B ). Den samlede effektivitet af knockout generation ved hjælp af HDR proceduren var 33%.
Figur 1: En arbejdsgang til generering af CRISPR-medierede knockouts i pattedyrcellelinjer. ( A ) Genome redigering begivenheder produceret af CRISPR / Cas9 spaltning og NHEJ (venstre) eller HDR (højre). Stedet for Cas9 spaltning er betegnet med en hvid vertikal linje. ( B ) Komponenter og samling af HDR-templateplasmidet. Type IIs-restriktionsenzymerne anvendt i Golden Gate-kloning, såsom BsaI, genkender en asymmetrisk DNA-sekvens og efterlader et forskudt snit uden for genkendelsessekvensen, hvilket tillader udformning af vilkårlig overlappende segmenter til montering (afbildet). Pile angiver primerpositionerne for at kontrollere korrekt plasmidmontering. ( C ) Arbejdsstrøm: efter transfektion (og valg af lægemiddelvalg), er cellerne plettet ved begrænsende fortyndinger i 96-brøndsplader. Klonale populationerScreenes enten ved prikimmunoblot (selektionsuafhængig, NHEJ) eller koloni-PCR (selektionsafhængig, HDR). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Screening kandidat knockout linjer med prik blots eller koloni PCR. ( A ) prikimmunoblot af isolerede ELAVL1-målrettede kloner med ELAVL1-antistof (venstre) og separat med et antistof for et kontrolprotein, Pum2 (højre). Kloner, der viste lille kontrolsignal, sandsynligvis på grund af lavt proteinindhold, er markeret med en X og udelukket fra yderligere analyse. Kloner med lavt ELAVL1-signal (cirkler) blev yderligere testet ved western blots, der bekræftede (grønne) eller ugyldige (grå) kandidaterne. ( B ) Kvantificering af KO cAndidates fra dot blot. Forhold af ELAVL1 til styring af proteinsignal i dot blot vist i A, i stigende rækkefølge. ( C ) Primer design til knockout / indsættelse test via koloni PCR. En primer, som er komplementær til det genomiske locus uden for homologiarmregionen (rød), er parret med en primer, der er komplementær til den endogene sekvens (blå) eller til modstandskassetten (grøn), probing for den uedited tilstand eller en deletion / insertion-hændelse , henholdsvis. Separate primerpar er designet til at teste begge sider af integrationen. ( D ) Eksempel agarosegel af koloni-PCR-resultater ved anvendelse af primere, der spænder opstrøms integrationskryds ved anvendelse af endogene indre primere (top) og knockout inderste primere (bund). Primers valideres først i både forældre T-REx293 celler og bulk udvalgte celler (til venstre). Individuelle kandidatkloner (midt) og de forventede båndmønstre for WT, KO og monoallel deletion (WT / KO) kloner (højre). Bialleliske knockout kloner er indikeretD af en stjerne. De korrekte amplifikationsprodukter er angivet med sorte pile. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af knockout kandidater med Western blot. ( A ) Western blot for ELAVL1 (top) af en delmængde af kloner identificeret ved dot blot. PUM2 blev blottet på samme membran som en belastningskontrol (bund). ( B ) Western blot for PUM2 (top) af en delmængde af kloner identificeret ved koloni PCR. GAPDH blev blottet på den samme membran som en belastningskontrol (bund). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR / Cas9-systemet har muliggjort effektiv generering af stabile genomiske modifikationer, hvilket giver et mere konsistent alternativ til andre transient manipulationsmetoder. Her har vi præsenteret to metoder til hurtig identifikation af CRISPR / Cas9 gen-knockouts i pattedyrcellelinier. Begge metoder kræver lille cellulært materiale, så test kan ske i tidlige stadier af klonalkultur, hvilket sparer tid og reagenser. For at øge effektiviteten af begge metoder anbefaler vi at teste flere sgRNA'er, da effektiviteten varierer afhængigt af sekvens og genomisk placering. Derudover er anvendelse af flere sgRNA'er nyttigt til at identificere off-target-effekter ved at detektere outlier-fænotyper som et resultat af mutationer i ikke-målrettede gener. Effektiv transfektion og Cas9 spaltning vil i høj grad øge chancerne for at generere knockouts. Alternativt transfekterer cellerne direkte med kommercielt fremskaffede sgRNA / Cas9 ribonukleoproteinkomplekser 32 ,33 kan fremskynde protokollen og reducere off-target-effekter.
Dot blots er velegnede til at vurdere protein knockouts forårsaget af de små genomiske ændringer på grund af NHEJ. Da kun en enkelt sgRNA / Cas9-konstruktion er nødvendig, kan denne fremgangsmåde være den hurtigste for at opnå nulllinjer, og blot-proceduren omgår yderligere trin for at fremskynde screeningen. Det normaliserede immunoblotproteinsignal tjener som en pålidelig forudsigelse for vellykket validering ( figur 2B ). Denne protokol er ideel til generering af knockouts med minimal genomisk forstyrrelse. Alternativt kan denne screeningsmetode tilpasses til probe for proteinaddition eller modifikation, såsom transgene proteiner eller proteinmærker. Imidlertid kræver denne screeningsmetode et antistof med høj specificitet til proteinet af interesse, da krydsreaktivitet fører til høj baggrund i prikkestik. Denne metode er naturligvis begrænset til mutationsmålretningProteinkodende regioner, idet den endelige produktion afhænger af tilstedeværelsen / fraværet af et proteinprodukt. Det er også vigtigt at bemærke, at mutationer forårsaget af NHEJ kan føre til en række proteinresultater, herunder et protein med konstitutivt aktiv, delvis eller dominerende negativ funktion eller et funktionelt protein, der mangler detektionsantistofepitopen. For at minimere disse problemer er det nyttigt at målrette Cas9-skæringen så tidligt ind i kodningsområdet som muligt for at øge chancerne for at generere et fuldt ikke-funktionelt protein. Derudover kan målretning af genomiske regioner, der er mindre tilgængelige for Cas9-maskinerne, producere lave deletionsudbytter i fravær af selektion. Endelig kan knockouts, der giver en selektiv ulempe, være vanskeligt at opnå ved denne fremgangsmåde af tilsvarende grunde.
Brug af homologiregerede reparationsmekanismer sammen med CRISPR / Cas9 spaltning muliggør meget større og mere specifikke genomiske manipulationer, som kan omfatte både laRge-skala deletioner (afgrænset af to sgRNA spaltninger) og insertioner. Da to spaltningshændelser og en præcis reparationsproces skal finde sted, øger integrationen af en lægemiddelresistensmarkør væsentligt knockout udbytter ved anvendelse af denne metode. Selvom dot blot-detektion også kan anvendes, er screening ved koloni-PCR mere generelt anvendelig til nøjagtigt at detektere korrekte integration / knockout-kandidater med sådanne store genomiske perturbationer. Endvidere muliggør test ved PCR identifikation af kloner med ufuldkomne og ufuldstændige integrationer, som kan give indsigt i omfanget og arten af HDR-processen selv. Derudover kan den introducerede markør efterfølgende fjernes (ved transient Cre-ekspression eller tilsætning i membran-permeabel form), hvilket efterlader et minimalt 34 bp deletionsar (loxP-sted) og muliggør fremtidig genbrug af markeringsmarkøren. Fleksibiliteten af denne fremgangsmåde stiger ved brug af flere modstand markører, der tillader generering af flere cumuLative protein knockouts. Det er vigtigt, når man anvender denne metode, at fraværet af produkt yderligere valideres, for eksempel ved RT-qPCR af det forventede transkript. Da denne skærm kan være uafhængig uafhængig, anvendes denne metode let på proteinudfald uden et robust antistof, såvel som at detektere ændringer, der ikke falder i proteinkodende gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Gissell Sanchez, Megan Lee og Jason Estep for eksperimentel bistand, og Weifeng Gu og Xuemei Chen til deling af reagenser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
