JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Undersøker von Willebrand faktor Patofysiologien ved hjelp av en Flow Chamber modell av von Willebrand faktor-Platederivert streng formasjon

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

I dette papir, beskriver vi en metode for å vurdere endothelial von Willebrand faktor utgivelsen og den påfølgende Platederivert fange under væske skjæring stress svar på inflammatorisk stimuli bruker en i vitro flow chamber-system.

Abstract

Von Willebrand faktor (VWF) er en multimeric glykoprotein koagulering faktor som formidler Platederivert vedheft og samling på nettsteder av endothelial skade og som bærer faktor VIII i sirkulasjon. VWF er synthesized av endotelceller og slippes enten constitutively i plasma eller lagres i spesialiserte organelles, kalt Weibel-Palade organer (WPBs), for behovsbetinget utgivelsen svar hemostatic utfordring. Procoagulant og proinflammatory stimuli føre snarlig WPB exocytosis og VWF utgivelse. Fleste VWF utgitt av endotelceller sirkulerer i plasma; Imidlertid er en del av VWF forankret på endothelial celle overflaten. Tilfeller av fysiologiske skjær kan endothelial-forankret VWF binde til blodplater, danner en VWF-Platederivert streng som kan representere nidus av dannelse. Et kammer med system kan brukes til visuelt observere utgivelsen av VWF fra endotelceller og den påfølgende Platederivert fange på en måte som er reproduserbar og relevant i Patofysiologien ved VWF-mediert dannelse. Med denne metoden, endotelceller er kultivert i en flyt kammer og senere stimulert med secretagogues å indusere WPB exocytosis. Vasket blodplater er deretter perfused over aktivert endotelet. Blodplater er aktivert og deretter binde til langstrakte VWF strenger i retning av væskestrøm. Bruke ekstracellulære histones som en procoagulant og proinflammatory stimulans, observerte vi økt VWF-Platederivert streng formasjon på histone-behandlet endotelceller sammenlignet med ubehandlet endotelceller. Denne protokollen beskriver en kvantitativ, visuelle og sanntid vurdering av aktivering av VWF-Platederivert interaksjoner i modeller av tromboser og hemostasen.

Introduction

Blodpropp er en ledende årsak til dødelighet verdensomspennende1 og kan utvikle i svaret todysregulated Platederivert aktivisering og trombin generasjon i begge veinsand arterier. Plasmanivåer av VWF er en viktig regulator av blodpropp, der lave nivåer (< 50%) føre til blødning uorden kalles von Willebrand sykdom (VWD)2 og høye nivåer (> 150%) er assosiert med økt risiko for venøs3 og arterial4 trombose.

VWF er en multimeric glykoprotein syntetisert av megakaryocytes og endotelceller og lagret i blodplater α-korn og WPBs, henholdsvis. På hemostatic utfordring, kan VWF frigis fra endotelial WPBs å tjore sirkulerende blodplater aktivert endotelceller5 eller utsatt kollagen på fartøyet veggen6. Forankring av VWF til endotelceller har vist seg å være formidlet av P-selectin7 og integrin αvβ38. Etterfølgende utgivelsen av blodplater α-granulen butikker kan øke lokaliserte VWF konsentrasjoner å stabilisere blodplater-Platederivert samhandlinger for Platederivert plug formasjon, stillaset nødvendig for spredning av koagulasjonssystemet cascade og fibrin deponering. Blodplater-bindende aktiviteten til VWF er regulert av multimeric strukturen, med høy-molekylær vekt multimers besitter større hemostatic aktivitet9,10. I omløp fungerer VWF også som en bærer for koagulering faktor VIII.

Flytende skjær stress er en viktig regulator av VWF fysiologi. I fravær av skjæring stress finnes VWF i en globular form, skjuler bindende domener for Platederivert glykoprotein Ib vedheft11. Når skjæring stress, er cleavage området for en metalloprotease, en disintegrin og metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), utsatt. ADAMTS13 innstiftet naken og blodplater innredede VWF strenger å regulere multimer størrelse, og dermed redusere sin hemostatic aktivitet12.

VWF er en akutt fase protein, og mange stimuli, inkludert hypoksi13, infeksjon14og proinflammatory cytokiner, har vist seg å megle VWF utgivelse fra endotelceller. Ligner andre inflammatoriske agenter, ekstracellulære histones har også blitt vist å indusere systemisk VWF utgivelse i mus15,16 og aktivering av blodplater i vitro17,18, 19. dette viste seg å være avhengig av histone undertypen, som forskjeller i lysin og arginin innhold kan påvirke funksjonen15. Vår studie tar sikte på å etablere en flyt kammer modell for å undersøke påvirkning av lysin-rik (HK) og arginin-rik (HR) histone subtyper og secretagogues på endothelial VWF utgivelse og sanntid Platederivert fange, potensielle tidlig hendelser i betennelse-indusert trombose.

Denne flyten kammer metodikken viser i vivo interaksjoner mellom subendothelial kollagen, endotelceller, VWF og blodplater i en i vitro system som er visuelt, reproduserbare og målbare. Det gir mulighet for sanntids vurdering av alle aspekter av veien som regulerer VWF-Platederivert interaksjoner, inkludert WPB sekresjon, blodplater aktivisering og VWF proteolyse. Studier av VWF under kontrollerte skjæring stress forhold har blitt brukt til å evaluere VWD mutasjoner som svekke VWF utgivelse og blodplater-bindende funksjon20, WPB fysiologi21og VWF spalting av ADAMTS135. Vi bruker denne metodikken for å kvantifisere VWF-Platederivert streng dannelsen av en inflammatorisk stimulans: ekstracellulære histones.

Protocol

Disse studiene ble godkjent av forskning etikk styret av Queen’s University, Canada. 1. endothelial celle stimulering Kollagen-coat en 6-og vev kultur plate. 24 timer i forveien, lag en 6-og vev kultur plate på 37 ° C med 1 mL av kollagen buffer (50 µg/mL rotte hale kollagen type 1 med 0.02 M iseddik). Vask brønnene to ganger med 2 mL av Hanks balansert Salt løsning (HBSS).Merk: Plater kan være pakket i tinn folie og lagret i en luftte…

Representative Results

Å direkte vurdere effekten av histones på VWF utgivelse fra endotelceller, utsatt vi confluent BOECs serum-fri medium som inneholder PMA (positiv kontroll), UH, HR og HK for 2T. Vi viste at HK indusert en 2-fold økning i VWF protein (VWF:Ag) i medium av behandlet endotelceller (figur 1). Interessant, da BOECs ble stimulert UH og HR, var det mindre VWF:Ag oppdaget i medium enn ubehandlet tilstanden. Vi hypotese at fordi histones kan bindes direkte til VWF<s…

Discussion

Mens fysiologiske relevansen av VWF-Platederivert strenger fortsatt kontroversiell på grunn av deres raske oppløsningen i nærvær av den VWF-spalte protease ADAMTS13, tjener de som kvantifiserbare i vitro modell av blodplater rekruttering av VWF til et område på som en blodpropp kan danne i nærvær av lokalisert øker i histone nivå5. Videre i patologi mangler ADAMTS13 aktivitet, slik som trombotiske thrombocytopenic purpura (TTP) – eller inflammatorisk microenvironments – hvor ADA…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alison Michels er en mottaker av Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate stipend fra Canadian institutter for helse forskning (CIHR). Laura L. Swystun er mottakeren en CIHR fellesskap. David Lillicrap er mottakeren av en Canada forskning stol i molekylær hemostasen. Denne studien ble finansiert delvis av en CIHR opererer grant (MOPP-97849).

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel – Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend’homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Von Willebrand FactorVWF-platelet String FormationFlow Chamber ModelCollagenEndothelial CellsPlateletsSecretagoguesIn VitroMicroscopySyringe Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image