Summary
이 문서에서 설명 하는 내 피 폰 Willebrand 평가 하는 방법 요소 릴리스 및 다음 혈소판 유체 전단 응력은 생체 외에서 흐름 챔버 시스템을 사용 하 여 염증 성 자극에 대 한 응답에서에서 캡처.
Abstract
폰 Willebrand 인자 (VWF) multimeric 당단백질 응고 요소를 혈소판 접착 력 및 내 피 손상의 사이트에서 집계 하는 중재 하 고 그 순환에 VIII 인자 이다. VWF 내 피 세포에 의해 합성 플라즈마에 constitutively 발표 하거나 또는 hemostatic 도전 하 응답에 온 디맨드 출시 Weibel Palade 시체 (WPBs) 라는 특수 세포에 저장 됩니다. Procoagulant 및 proinflammatory 자극 WPB exocytosis, VWF 출시에 급속 하 게 유도할 수 있다. 대부분 내 피 세포에 의해 풀어 놓인 VWF의 플라즈마;에서 순환 그러나, VWF의 비율 내 피 세포 표면에 고정은 됩니다. 생리 전단의 조건 하에서 내 피 고정 VWF 혈전 형성의 nidus 나타내는 VWF 혈소판 문자열을 형성, 혈소판에 바인딩할 수 있습니다. 시각적으로 재현 하 고 중재 하는 VWF 혈전 형성의 이상에 관련 된 방식으로 캡처 후속 혈소판 및 내 피 세포에서 VWF의 릴리스를 관찰 하는 흐름 챔버 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 내 피 세포는 교양 흐름 챔버에 고 이후에 WPB exocytosis 유도 하 secretagogues와 자극. 씻어 혈소판은 다음 활성화 endothelium에 끼얹는다. 혈소판 활성화 되 고 이후에 유체 흐름의 방향으로 길쭉한 VWF 문자열에 바인딩합니다. Procoagulant 및 proinflammatory 자극으로 extracellular 히스톤을 사용 하 여, 히스톤 치료 내 피 세포 치료 내 피 세포에 비해 증가 VWF 혈소판 문자열 형성을 관찰 합니다. 이 프로토콜 모델의 혈전 증 및 hemostasis 상호 작용 VWF 혈소판의 활성화의 양적, 시각, 그리고 실시간 평가 설명합니다.
Introduction
혈전 증 사망률 전세계1 의 주요 원인이 되 고 응답 todysregulated 혈소판 활성화 및 트 롬 빈 세대에 모두 veinsand 동맥에서 개발할 수 있습니다. VWF의 플라스마 수준 혈액 응고의 키 레 귤 레이 터, 그것에 의하여 낮은 수준 (< 50%)로 알려진 폰 Willebrand 질병 (VWD)2 그리고 상부 출혈 장애 발생 (> 150%) 정 맥3 의 위험 증가와 관련 된 고 4 동맥 혈전 증입니다.
VWF는 없으며 및 내 피 세포에 의해 합성 및 혈소판 α과 립 및 WPBs에 각각 저장 multimeric 당단백질 이다. Hemostatic 도전 시 VWF 순환 혈소판 활성화 된 내 피 세포5 또는6의 배 벽 노출 된 콜라겐을 밧줄로 내 피 WPBs에서 발표 될 수 있습니다. 내 피 세포에 VWF의 앵커 P selectin7 그리고 integrin αvβ38에 의해 중재에 표시 되었습니다. 혈소판 알파과 립 점포의 후속 릴리스 더욱 혈소판 혈소판 혈소판 플러그 형성, 응고 캐스케이드 및 섬유 소의 전파에 필요한 비 계에 대 한 상호 작용을 안정 된 VWF 농도 높일 수 있습니다. 증 착입니다. VWF의 혈소판 바인딩 활동 큰 hemostatic 활동9,10를 가진 높은 분자 무게 multimers와 그것의 multimeric 구조에 의해 통제 된다. 혈액 순환, VWF 또한 행위로 VIII 응고 인자에 대 한 캐리어.
유체 전단 응력 VWF 생리학의 필수 레 귤 레이 터 이다. 전단 응력의 부재, VWF 혈소판 당단백질 Ib 접착11에 대 한 바인딩 도메인 은폐 구형 형태로 존재 합니다. 전단 응력은 존재, metalloprotease, disintegrin 및 thrombospondin 모티브 (ADAMTS13), metalloprotease에 대 한 분열 사이트 노출 됩니다. ADAMTS13의 hemostatic 활동12줄일 적나라 하 고 혈소판 장식 VWF 문자열 multimer 크기 조절을 앞.
VWF 이라면 급성 상 단백질, 그리고 수많은 자극, hypoxia13, 감염14및 proinflammatory cytokines를 포함 하 여 내 피 세포에서 VWF 릴리스를 중재에 표시 되었습니다. 다른 비슷한 염증 성 에이전트, extracellular 히스톤 또한 표시 되었습니다 조직의 VWF 릴리스 마우스15,16 와 혈소판 생체 외에서17,18, 의 활성화를 유도 하 19.이 리에 차이점으로 히스톤 하위에 종속 되도록 표시 했다 및 아르기닌 콘텐츠 기능15에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 연구 목표로 설정 흐름 챔버 리-리치 (홍콩)의 영향을 조사 하 모델과 아르기닌이 풍부한 (HR) 히스톤 하위 및 내 피 VWF 릴리스 및 실시간 혈소판에 secretagogues에 잠재적인 초기 이벤트 캡처 염증 유발 혈전 증
이 흐름 챔버 방법론 생체 외에서 시스템에 시각, 재현성, 고 정량에 vivo에서 상호 subendothelial 콜라겐, 내 피 세포, VWF, 및 혈소판이. VWF 혈소판 상호 작용, WPB 분 비, 혈소판 활성화, VWF 베이스 등을 조절 하는 통로의 모든 측면의 실시간 평가 대 한 수 있습니다. 제어 전단 응력 조건 하에서 VWF의 연구 VWF 릴리스 및 혈소판 바인딩 함수20, WPB 생리학21, VWF 분열 손상 VWD 돌연변이 평가 하 ADAMTS135에 의해 사용 되었습니다. 계량 한 염증 성 자극의 결과로 VWF 혈소판 문자열 형성이이 방법론 사용: extracellular 히스톤.
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Protocol
이 연구는 연구 윤리 위원회의 여왕의 대학, 캐나다에 의해 승인 되었다.
1. 내 피 성장 세포 자극
-
콜라겐-코트 6 잘 조직 문화 접시.
- 24 미리, 코트 콜라겐의 1 mL와 함께 37 ° C에서 6 잘 조직 문화 접시 h 버퍼 (50 µ g/mL 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1 0.02 M 빙 초 산으로).
- 2 mL의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)로 두 번 웰 스 워시.
참고: 판 수 깡통 호 일에 싸여 있으며 4 ° c.에 밀폐 비닐 봉지에 저장
- 내 피 세포 성장 매체 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 2 mL에 잘 당 1 x 106 세포의 조밀도에 씨. 37 ° C (5% CO2)에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.
참고: 여기, 혈액 결과 내 피 세포 (BOECs) 구절 5와 15 사이 사용 되었다. BOECs는 스타크 외 에 참조 하는 메서드를 사용 하 여 wildtype VWF 시퀀스와 건강 한 지원자에서 고립 되었다 22 정돈23으로 앞서 설명한 것과 비슷한 방식입니다. - 24 시간 후 매체를 제거 하 고 세척 HBSS 셀.
- 혈 청 무료 매체 (FBS 없이 최소한의 필수 성장 매체) 포함 phorbol myristate 12 13-아세테이트의 1 mL을 추가 (PMA; 100 nM), unfractionated 히스톤 (어), 그리고 홍콩 또는 2 h 37 ° C (5% CO2)에 대 한 셀에 HR (25 µ g/mL에서 모두).
참고: 히스톤의이 농도 Xu 그 외 여러분 에 의해 이전에 체 외에서 세포 독성 보고에 근거 했다 24 와 브람스 외. 25 50 µ g/mL를 사용 하는. - 2 시간 후 매체를 수집 하 고 분석까지-20 ° C에서 그것을 저장.
2. VWF 정량화 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해
- 버퍼 (10 m m 염기 나트륨 인산 염 및 145 m m 염화 나트륨, pH 7.2) 포함 10 µ g/mL polyclonal 안티-VWF 항 체 4 ° c.에 하룻밤 코팅의 100 µ L와 미 판 코트
- 세 번 세척 버퍼의 250 µ L와 접시 세척 (10 m m 염기 나트륨 인산 염, 염화 나트륨 500 m m, 0.1% 트윈 20, pH 7.2).
- 1: 2와 1:4 워시 버퍼와 중간 샘플을 희석 하 고 표준 곡선, 1시 10분에서 시작에 대 한 일반적인 참조 플라즈마를 사용 하 여 희석.
- 100 µ L 희석된 샘플의 접시와 표준 4 ° c.에서 하룻밤
- 워시 워시 버퍼의 250 µ L로 세 번 접시.
- 접시에 HRP 활용 된 탐지 항 체 (1.1 µ g / µ L 워시 버퍼에서) 안티 VWF 희석된의 100 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
- 접시를 세척 하 고 제조업체의 지침에 따라 O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) 시 약을 10 분 동안 품 어.
- 그래서 1 M H2의 100 µ L 반응 중지4 와 읽기 492에 접시 nm.
3. 고체 상 히스톤-VWF 바인딩 분석 결과
- 히스톤 0.5% 나트륨 deoxycholate 50 m m 탄산 버퍼 (pH 9.6) 4 ° c.에 하룻밤 10 µ g/mL에에서 희석 한 microplate 코트
- 0.1%를 보충 하는 PBS의 250 µ L로 세 번 접시 세척 트윈 20, 세척 사이 10 분 동안 잠복기.
- 200 µ L의 PBS 0.1% Tween 20과 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온에서 1 h에 대 한 보충으로 접시를 차단 합니다.
- 3.2 단계를 반복 합니다.
- 직렬로 플라스마 파생 된 인간의 VWF/요인 VIII 염 분 버퍼에 25 mU/ml 200 mU/mL에서 복잡 한 희석 (염화 나트륨 10 m m 염기 나트륨 인산 염, , 500 m m와 0.1% 트윈 20, pH 7.2). 실 온에서 2 h에 대 한 접시에 100 µ L를 추가 합니다.
- 3.2 단계를 반복 합니다.
- PBS-0.1% 트윈 20, 1:1,000 토끼 polyclonal 안티-VWF 항 체 HRP를 실 온에서 1 h에 대 한 활용을 포함 하는 솔루션의 100 µ L를 사용 하 여 고정된 히스톤 VWF의 바인딩을 검색.
- 3.2 단계를 반복 합니다.
- OPD 시 약의 100 µ L 30 분 동안 접시를 품 어 하 고 그래서 1 M H2의 100 µ L 반응 중지4. 492에서 광학 밀도 측정 nm.
4. 시드 흐름 챔버에 내 피 세포
- 1 mL 주사기 Luer 잠금에 콜라겐 코팅 버퍼 (2.1 단계에서 설명) 0.5 mL를 로드 합니다.
- 흐름 챔버 슬라이드의 저수지에 주사기 Luer 잠금 끝을 트위스트.
- 전체 레인 코팅 및 각 저수지가 가득 때까지 플런저를 천천히 누릅니다. 각 레인에 대 한 반복 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서 챔버를 품 어.
- 콜라겐 코팅 버퍼 200 μ 피펫은와 발음 1 mL HBSS와 다른 주사기를 로드 하 고 천천히 흐름 챔버의 각 레인을 세척 하는 플런저를 누릅니다. 흐름 챔버의 반대 끝에 200 μ 피 펫 세척 발음 두 번 반복 합니다.
- 10% 성장 매체에 3 x 106 셀/mL 내 피 세포 (BOEC) 솔루션의 약 100 µ L 플라스틱 FBS 흐름 챔버의 차선으로.
참고: 내 피 세포의 시드 밀도 챔버의 용량을 초과합니다. 이 최대한 채널 적용; 비 부착 한 세포는 연속적인 세척 단계에서 제거 됩니다. - 품 어 24 h. 변경에 대 한 37 ° C에서 챔버 매체 (4.4 단계) 에서처럼 Luer 잠금 주사기를 사용 하 여 모든 8-12 h. 차선에서 볼 수 없는 거품 인지 확인 합니다.
5. 인간의 전체 혈액에서 혈소판을 분리
- 생물 안전 캐비닛 30g 바늘, 무 첨가 3 mL 혈액 컬렉션 vacutainer를 산 시트르산 포도 당 버퍼 (85mm trisodium 시트르산, 111 m m D-포도 당, 그리고 71 m m 구 연산 산 성, pH 4.5)의 300 µ L를 추가 합니다.
- 베르나르도 외26의해 비슷한 프로토콜 다음 venipuncture 3 ml (3 관), 여 (7 일 동안 항 혈소판 및 비 스테로이드 성 항 염증 약물에서 무료) 건강 한 지원자에서 전체 혈액 수집 합니다.
- 초기 조직 손상에서 venipuncture와 관련 된 자발적인 혈소판 활성화를 발생할 수 있습니다 첫 번째 튜브를 삭제 합니다.
- 부드럽게 반전 하는 vacutainers 세 번 혈액 응고 제와 혼합.
- 24 ° C (실내 온도)에서 15 분 동안 150 x g에서 vacutainers 원심
- 천천히 생물 안전 캐비닛에 피 펫과 혈소판이 풍부한 혈장 (표면에 뜨는)를 제거 하 고 신중 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 그것을 전송. 잠재적인 크로스-활성화를 피하기 위해 단일 원뿔 관에 각 vacutainer의 혈소판이 풍부한 볼륨을 전송 합니다.
참고: 혈소판 격리 생물학 안전 장은 세균 오염 및 잠재적인 인공 혈소판 및 내 피 활성화를 방지 하기 위해 수행 되어야 한다. - 900 x g 작은 공의 혈소판에 24 ° C (실내 온도)에서 10 분에 원뿔 튜브 원심
- 플라스틱 및 혈소판 가난한 상쾌한 삭제.
- 시트르산 포도 당 나트륨 (CGS) 버퍼 (13 m m 나트륨 구 연산 염, 30 mM D-포도 당, 및 120 m m 염화 나트륨, pH 7.0)의 1 mL와 함께 신중 하 게 펠 릿을 세척.
참고:는 혈소판에에서 나타납니다 wisp 모양의 형성 때 CGS 버퍼 추가 되 고 펠 릿 부드럽게 resuspended. 혈소판 활성화에 의해 오염 된 샘플에는 혈소판 쉽게 resuspend 하지 않습니다 고 clumpy 표시 됩니다. - 일단 완벽 하 게 resuspended, 원심에서 24 ° C (실내 온도)에서 10 분 동안 900 x g 샘플.
- CGS 워시 버퍼를 제거 하 고 Tyrode의 버퍼 (138 m m 염화 나트륨, 5.5 m m D-포도 당, 12 m m 탄산, 2.9 m m 염화 칼륨, 그리고 0.36 m m 염기 나트륨 인산 염, pH 7.4) 3 mL에 펠 릿을 resuspend. 혈소판의 완전 한 물의 resuspension를 확인 하 고, 집계, 관찰 하는 경우 삭제 샘플.
- 20 mM DiOC6 재고 솔루션 (디졸브 57.25 mg에 메탄올의 5 mL)에서 각 3 mL 원뿔 튜브 1 µ M의 최종 농도 대 한 세척된 혈소판의 1.5 µ L를 추가 합니다.
참고: DIOC6 라벨 혈소판이이 실험에 사용 되는 녹색 형광 미토 콘 드 리아 염료 이다. - 3 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 씻어 혈소판 솔루션의 aliquot 1 mL.
참고:이 실험에 필요한 혈소판 볼륨은 기준으로 계산 흐름 챔버 크기, 원하는 전단 응력 실험 (단계 6.5)의 길이에. 이 프로토콜은 조건이 유체 흐름에 대 한 충분 한 볼륨을 변경 조정할 수 있습니다. - 격리의 2 h 이내 씻어 혈소판을 사용 합니다.
6. 흐름 장치 어셈블리
- 메 마른 실리콘 한쪽 끝에 남성 팔꿈치 Luer 연결관 및 다른 여성 Luer 잠금 어댑터 (실내 직경 1.6 m m의) 튜브 70 c m 조각을 연결 합니다.
- 20 mL 주사기에 튜브에 부착 된 여성 Luer 잠금 어댑터를 연결 합니다.
- 6.1 및 6.2 3 동일한 주사기 튜브 연결을 생성 하는 두 번 단계를 반복 합니다.
-
주사기 펌프를 사용 하 여 유체 흐름을 생성. 주사기 펌프에 다음과 같은 설정을 입력: 주사기와 흐름 속도의 실내 직경.
참고: 20 mL 주사기는 19.55 m m 내부 직경. 흐름 속도 원하는 전단 속도/전단 응력 및 흐름 챔버의 크기에 따라 계산 됩니다. 1 dyn/cm2 (에서 관찰 된 낮은 정 맥 전단), 달성 하기 위해 현재 연구에 사용 된 흐름 챔버 9.37 µ L/min의 유량이 필요 합니다. 히스톤을 연결 하는 정 맥 혈전 증으로 증거 때문에 4.45 dyn/cm2 의 중간 정 맥 전단 선택 됩니다. 이것은 또한 가정에 기초는 버퍼 물에 비슷한 점도 있다. 유량 계산 하는 다양 한 흐름 챔버 크기의 유량에서 찾을 수 있습니다 하는 데 사용 하는 41.7 µ L/분 방정식 다음입니다.- 펌프 주사기 펌프에 단추 옵션을 사용 하 여 액체를 철회를 설정 합니다.
- 3 주사기 주사기 펌프에 튜브에 부착 된 로드 하 고 단단히 주사기와 plungers 브래킷을.
- 남성 팔꿈치 Luer 살 균 실리콘 튜브의 두 번째 20 cm 조각의 양쪽 끝에 연결 합니다.
- 무딘된 18 게이지 바늘을 한 팔꿈치 루어를 연결 합니다.
- 흐름 챔버의 3 개의 차선에 대 한 3 개의 동일한 흡입 시스템을 만드는 두 번 반복 합니다.
참고: 실리콘 튜브와 손잡이 10% 표 백제 뒤에 다시 사용 하기 전에 증류수로 세척 될 수 있다. 흐름 챔버를 다시 사용 하는 권장 하지 않습니다.
7. 현미경 설정
- 회전 디스크 현미경을 갖춘 완전 자동화 된 단계를 사용 합니다. 405, 458, 491, 543, 633 nm 레이저 라인을 제공 하는 레이저 출시와 함께 조명을 수행 합니다. 20 X 목적으로 모든 이미지를 캡처하십시오. 분석 소프트웨어 (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf)의 모든 매개 변수를 조정 합니다.
- 채널 설정 (배출 필터: 520/35), 491에 여기 nm, 수집에 대 한. 전체 동적 데이터 범위를 얻기 위해 전 하 결합 소자는 전자 멀티 이득의 150, 200 ms의 노출 시간을 곱한 전자를 설정 합니다.
참고: 혈소판 녹색 형광 염료, DiOC6, 파장 맥시 마와 함께 표시 됩니다 (여기, 482 nm; 방출, 504 nm). - 491 nm 레이저 전력 20%로 조정 합니다.
- 모든 3 레인의 센터를 표시 하 고 z 범위 1 μ m와 0.5 μ m 단계 크기를 선택 합니다. 모든 10 시간 점 (즉, 기간)의 수와 이미지 캡처 이미지 (즉, 간격) 사이의 시간을 선택 s; 슬라이드 당 "60 시간 점"을 선택 합니다. 3 차선에서 이미지를 캡처하고 지정 된 실험 폴더에 저장을 현미경을 설정 합니다.
참고: 흐름 챔버 3 차선 있기 때문에, 현미경 이미지를 캡처 3 위치 사이 전환 하려면 필요 합니다.
8. VWF 혈소판 문자열 형성
- (4 단계)에서 흐름 상공에서 문화 매체를 제거 단계 4.4 에서처럼 동일한 기술을 사용 하 여.
- 중 히 스타 민 (25 µ M), PMA의 100 µ L를 추가 (100 nM), 어, 홍콩, 또는 실 온 및 주변 O2/CO2에서 15 분 동안 BOEC 단층을 자극 (1.4 단계)에서 혈 청 자유로운 매체에 희석 (25 µ g/mL에서 모두) 인사.
참고: 비록 VWF 릴리스에 대 한 필요 하지 않습니다, 37 ° C에서이 자극 수행 향상 됩니다 VWF exocytosis27. - 셋 중 하나를 확인 흐름 챔버의 별도 차선 유지 실험 컨트롤로 치료.
- 1 mL 주사기를 사용 하 여 매체를 제거 하 고 씻어 내 피 단층의 secretagogues PBS의 100-200 µ L로 대체.
- 장소에 챔버를 확보 하기 위해 혈관 클립을 사용 하 여 슬라이드 스탠드에 흐름 챔버를 탑재 합니다.
- 흐름 챔버의 저수지에 70 cm 튜브 (주사기에 연결)의 끝에 사용할 수 있는 남성 Luer 커넥터를 연결 합니다. 두 개의 다른 흐름 챔버 레인에 대 한 반복 합니다.
- 주사기 펌프 PBS 세척 제거를 시작 합니다. 피 펫 레인 건조 실행 할 수 있도록 반대 흐름 챔버 저수지로 추가 PBS
- 모든 3 개의 차선에 걸쳐 해당 흐름에 대 한 흐름 시스템을 확인 하 고 주사기 펌프를 일시 중지.
- 에 대 한 실험 사이 대략 동일한 지역에서 각 레인의 중간에 이미지를 캡처하는 영역을 선택 합니다.
참고: 현미경을 운영 하는 사람 실험 조건에 멀게 될 수 있다. 이 단계를 수행 하면 현미경은 혈소판 흐름 전에 초점을 맞추고 (7 단계 참조). - 여성 luer 커플러를 연결 5 mL 주사기 그리고 무료 남성 luer 커넥터 (단계 6.8) 잠수함 무딘된 바늘 1.5 mL microcentrifuge 튜브 세척된 혈소판 솔루션 (5.13 단계)를 포함 하 고. 천천히 그릴 시스템 내에서 아무 공기 방울을 보장 하기 위해 튜브를 통해 혈소판 솔루션.
- 5 mL 주사기를 제거 하 고 남성 Luer 흐름 챔버의 오픈이 저수지에 연결. 3 개의 차선에 대 한 반복 합니다.
- 주사기 펌프를 다시 시작 하 고 어둠 속에서 10 분에 대 한 단계 7에서에서 현미경 및 프로토콜 설정을 사용 하 여 혈소판 흐름 중 이미지를 캡처하십시오.
- 10 분 후 흐름 챔버 저수지에 섭취 튜브에서는 루어를 분리 하 고 내 피 단층을 통해 흐름을 유지 하기 위해 PBS 저수지를 채울.
9. VWF 혈소판 문자열 정량화
참고: PBS의 지속적인 흐름 이미지 분석을 위한 VWF 혈소판 문자열 연신 율을 유지 하기 위해 필요 합니다. 흐름의 정지 되는 구형 VWF에 되며 VWF 혈소판 문자열 정량화에 악영향을 줄 것 이다. 그것은 이미지 캡처 동안 PBS 가진 각 저수지를 가기로 필수적 이다. HBSS 셀 축소 또는 초연이이 단계 동안 관찰 되는 경우 PBS를 바꿀 수 있습니다.
- 첫 번째 레인로 시작 하는 슬라이드의 중간에 주위 20 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 중복 없이 슬라이드 당 10 이미지를 캡처합니다. 각 레인에 대 한 반복이.
참고: 저수지 주변 지역 난 류 전단 응력 때문에 피해 야 한다. - "이미지," "조정," 및 "밝기/대비."를 클릭 하 여 밝기를 조정 하는 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 준수 혈소판 정량화 충분히 볼 수 있습니다 때까지 스크롤 막대를 끕니다.
- 때 3 개 이상의 정렬 된 혈소판 이미지에는 VWF 혈소판 문자열을 기록 합니다. 이미지의 모든 VWF 혈소판 문자열을 계산 합니다. 모든 10 이미지에 대 한 반복 하 고 실험에 대 한 평균.
참고:는 정량화를 수행 하는 사람 실험 조건에 멀게 될 수 있다. 이것은 독립적인 연구8,,2829에 의해 확인 된 대로, VWF에 대 한 공동 얼룩 필요는 없습니다. - 최소한 각 간접적인 평가를 세 번의 실험을 반복 합니다.
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Representative Results
직접 내 피 세포에서 VWF 석방에 히스톤의 효과 평가, 우리 2 h 혈 청 무료 중간 포함 PMA (긍정적인 통제), 어, 시간, 및 홍콩에 confluent BOECs 노출. 우리는 홍콩 VWF 단백질 (VWF:Ag) 치료 내 피 세포 (그림 1)의 중간에 2-fold 증가 유도 보였다. 흥미롭게도, BOECs 어와 HR 자극 했다 때 거기 VWF:Ag 덜 발견 되었다 치료 조건에 보다 매체에. 우리는 히스톤 VWF30에 직접 바인딩할 수 있습니다, 때문에 그들은 차동 문화 매체에서 VWF:Ag 검색 방해할 수 가설. VWF 히스톤 바인딩을 평가, 우리는 고체 상 바인딩 분석 결과 사용 합니다. 우리는 어 및 HR VWF 홍콩 (그림 2) 보다 더 강력 하 게 바인딩된 지원 탐지 간섭 그림 1에 설명 했다 보였다.
Extracellular 히스톤 혈소판 생체 외에서19, 활성화 표시 되었습니다 그리고 히스톤 VWF 릴리스 내 피 세포에서 중재를 제안 하는 우리의 데이터. VWF 혈소판 상호 작용에 히스톤의 효과 특성, 우리는 VWF 혈소판 문자열 형성 이라는 혈소판 자극된을 내 피 세포에 끼얹는다 했다의 흐름 챔버 모델을 사용. 대표 이미지 캡처 후 흐름, 그리고 VWF 혈소판 문자열의 수 정량 했다.
우리는, 흐름 조건의 개시, 다음 치료 세포 거의 VWF 혈소판 문자열 했다 관찰 (< 검토 필드당 1 문자열), 히 스타 민 세포 PMA 처리 했다 각각 2.10, 3.10 문자열의 평균. 훨씬 더 많은 VWF 혈소판 문자열 셀 홍콩으로 치료 했다 때 형성 되었다 (3.52 문자열, P = 0.019), 시간 (6.00 문자열, P = 0.004), 고 어 (5.51 문자열, P = 0.012). VWF 혈소판 문자열의 그래픽 표현은 그림 3에 표시 됩니다. 치료 되지 않는 셀에 비해 어에 대 한 응답에서 실시간 VWF 혈소판 문자열 형성 동영상 1A와 B에표시 됩니다.
조사 다른 그룹에 의해 함께 이러한 연구 결과는 히스톤28 및 히 스타 민5 , cytokines31 같은 다른 proinflammatory 에이전트 자극, 내 피 세포에서 분 비 VWF 후속 혈소판 중재 에 체 외를 캡처하십시오. 우리는 내 피 세포의 정적 자극 바인딩 VWF 격리 하는 히스톤의 기능 때문에 VWF 릴리스를 명료 하 게 충분 하지 않았다 시연 했다. VWF 발표 및 혈소판 접착의 흐름 챔버 모델의 디자인 더 완전히 특성화 및 endothelium, VWF, 및 혈소판 간의 비보에 상호 작용 모델 따라서 필요 했다.
그림 1: Lysine 풍부한 히스톤 유도 배양된 내 피 세포에서 VWF 출시. BOECs unfractionated 히스톤 (어)와 자극 했다 리-리치 (홍콩), 그리고 아르기닌이 풍부한 (HR) 히스톤 분수. 홍콩 문화 매체로 VWF 릴리스 자극. 어 및 HR 치료 치료 (Untr) 컨트롤을 기준으로 내 피 세포 매체에 VWF:Ag의 검색을 감소. N ≥3 개별 실험을 수행 했다. 데이터는 평균값 ± SE.으로 표시 됩니다 *P < 0.05, * *P < 0.01, 그리고 * * *P < 0.001 치료 상태를 기준으로 의미를 나타냅니다. 이 그림은 Michels 외15에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: VWF 히스톤 바인딩을 방해 VWF 탐지에서 생체 외에서. 플라즈마 파생 VWF 고체 상 바인딩 분석 결과에 리-리치 (홍콩) 히스톤에 비해 복용량 의존 패션에 시간을 어 더 강하게 바인딩합니다. 데이터는 평균값 ± SE. 개별 실험 수행 했다 N≥3로 표시 됩니다. 이 그림은 Michels 외15에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 히스톤 중재 VWF 혈소판 문자열 형성. 내 피 세포에 흐름 챔버 슬라이드 unfractionated 히스톤 (어), 라이 신이 풍부한으로 치료 했다 시드 (홍콩), 아르기닌이 풍부한 (HR) 히스톤 분수 또는 히 스타 민/PMA (긍정적인 컨트롤)와 10 분 동안 4.45 dyn/cm2 의 전단 응력에 끼얹는다 했다 와, 붙일 레이블된 혈소판 세척. 대표 이미지 치료 제어 (A)와 세포 히 스타 민 (B), Phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) (C), 홍콩 (D), 치료 후 혈소판 흐름 가져온 HR (E), 고 어 (F). PMA 처리 결과 보기의 필드, 히 스타 민에 비해 당 3.1 문자열의 평균. VWF 혈소판 문자열 10 연속 검토 분야에서 정량 되었고 n≥3 개별 실험 (G)에 대 한 평균. 데이터는 평균값 ± SE.으로 표시 됩니다 * P < 0.05와 * * P < 0.01 치료 상태를 기준으로 의미를 나타냅니다. 이 그림은 Michels 외15에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
VWF 혈소판의 생리 적인 관련성 VWF 고착 효소 ADAMTS13의 그들의 급속 한 해체로 인해 논란이 남아 문자열, 그들은 사이트에서 VWF에 의해 혈소판 모집의 정량 생체 외에서 모델 역 히스톤 레벨5에 증가 지역화는 혈전의 존재 양식을 수 있습니다. 또한, 병 리 thrombotic thrombocytopenic 혈관 (TTP)으로-또는 염증 성 microenvironments-ADAMTS13 활동 같은 부족에 ADAMTS13 활동 저해 VWF 혈소판 문자열32 vivo에서관찰 될 수 있다 고 수 있습니다 혈소판 microaggregation 및 백혈구 넘쳐 흐름, 연결 하는 VWF33의 hemostatic 및 proinflammatory 기능에 기여 한다. 마지막으로, 가설 되어 있다 그 VWF 혈소판 문자열 형성 정 맥 또는 동맥 혈전 증, 형성 하는 병 적인 혈전 만들어집니다 nidus에에서 시작 이벤트를 있을 수 있습니다.
흐름 챔버 시스템에서 VWF 혈소판 문자열 형성 WPB exocytosis, ADAMTS13 분열 및 VWF의 혈소판 바인딩 용량을 사용할 수 있습니다. 이러한 실험을 성공적으로 실행 하려면 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 그러나, 모델의 응용 프로그램에 따라 수정 프로토콜을 만들 수 있습니다.
특정 혈관 침대에서 내 피 세포는 그들의 기계 및 생 화 확 적인 신호34에 이종. 그것은 그러므로이 방법론의 응용 프로그램에 대 한 적합 한 셀 유형을 선택 하려면 유용할 수 있습니다. BOECs는 그들의 증식 잠재력; 때문에 현재 연구에 사용 했다 여러 (10 +) 구절;에서 표현 형의 유지 보수 그리고 강력한 VWF 식, VWF exocytosis의 정량화를 촉진. 인간의 배꼽을 사용 하는 다른 수 사관 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)5,,828 및 비 내 피 세포 (인간 미 발달 신장 293 세포) VWF cDNAs VWD 돌연변이35 표현으로 페 . 그것은 VWF 식 조직과 혈관 생리학36사이 크게 다릅니다 증명 되었습니다. 교양된 내 피 세포에서 다양 한 마이크로-macrovasculature 발생 VWF 단백질 기저 분 비37, 현저한 차이가 있고 증거가 칼슘 채널 차이 내 피 세포 하위 WPB 영향 secretagogues38응답에서 exocytosis입니다.
히스톤 소설 간접적인으로이 연구에 사용 되었다. 그들은 긍정적인 통제, 히 스타 민, VWF 릴리스의 자주 설명된 생리 자극 제에 비해 했다. VWF:Ag ELISA 정적 조건에서 내 피 세포에서 VWF 릴리스를 확인 하기 위해 사용 되었다. VWF의 릴리스를 게재할 두 세포내 메커니즘이 있습니다: 세포내 칼슘39 또는 pf 순환 앰프 상승 레벨40. 이 통로의 차동 활성화 트 롬 빈/히 스타 민 또는 피 네 프 린/바소 같은 secretagogues에 의해 유도 (또는 수, VWD, desmopressin 관련), 각각, 그리고 그것은이 흐름 챔버를 사용 하 여 이러한 두 경로 비교 하는 흥미로운 있을 수 있습니다. VWF 혈소판 문자열 형성의 모델입니다. Thrombo 염증 성 질병의 맥락에서 더 cytokines41 등 손상/병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPS/의 DAMPS), 염증 성 마커 및 VWF 혈소판 문자열 대형에서 그들의 역할의 권장 합니다.
구형 VWF 혈소판11당단백질 Ib에 대 한 A1 도메인 바인딩 사이트 노출 펼쳐져 유체 전단 응력은 중요 합니다. 그것은 약 0.73 dyn/cm2 의 최소 유체 전단 응력은 VWF 문자열42혈소판 바인딩에 필요한 증명 되었습니다. 또한, 이러한 문자열 형태에서 내 피 세포에는 상대적으로 낮은 전단 응력 (2.5 dyn/cm2) 하지만8이상 20 dyn/cm2 의 전단 응력에서 dislodged 수 있습니다. 현재 조사에 우리는 10 분의 실험에 대 한 관류 버퍼를 보존 하는 동안 내 피, VWF, 및 혈소판 사이의 상호 작용에 대 한 허용 정 맥 전단 응력 (4.45 dyn/cm2) 선택.
ADAMTS13 분열 VWF 혈소판 문자열의 평가를이 흐름 챔버 시스템을 사용 하 여이 실험에 사용 된 이상 유체 전단 응력의 증가 요구 한다. VWF 혈소판 문자열의 최대 ADAMTS13 분열 사이 10 그리고 30 dyn/cm212, 범위를 포함 하는 높은 발생 중간 동맥 전단 응력43정 맥. 이 시스템에서 전단 속도 수정 VWF 혈소판 문자열 형성 및 해산, 정 맥, 동맥, 또는 microvascular 혈전 증의 개발에서 요인 비교 하는 데 유용 수 있습니다.
추가 수정이이 기술의 관류 재료와 흐름 챔버에 만들 수 있습니다. Secretagogues 환경 비보에 닮은 흐름 조건 하에서 시행 될 수 있습니다. 그들의 반응성을 평가 하는 촉진제와 혈소판을 못쓰게 또는 백혈구 인구를 포함 하 여이 기술의 확장입니다. 또한, VWF multimer 길이, 혈소판 바인딩 용량, 또는 혈소판 반응성을 대상으로 하는 치료제를 포함 한 혈전 개발의 개시를 규제 하는 중요 한 메커니즘 명료 수 있습니다. 다른 수 사관 중 사내44 사용 또는 구입 유리 coverslip 흐름 챔버45, 폴리머 기반 슬라이드 반대이 연구에 사용 하 고 유사한 결과 얻을 것.
VWF 혈소판 문자열 프로토콜에 중요 한 고려 사항은 씻어 혈소판의 준비 이다. ADAMTS13의 존재로 인해이 프로토콜에서 전 혈을 사용 하는 권장 하지 않습니다. 예: prostacyclin 또는 apyrase, 혈소판 활성화를 방지 하는 에이전트가 나중 부정적인 혈소판 접착 VWF에 영향을 미칠 수로 피해 야 한다. 버퍼는 혈소판 분리 전에 실내 온도에 가져온 고 주의 피 펫 기술 (즉, 거품과 가혹한 전단 응력을 방지)를 사용 하 여 비활성 상태에서 혈소판을 유지 하기 위해 열쇠입니다. 또한, DIOC6 등 rhodamine 6g, 미토 콘 드 리아 얼룩으로 혈소판 라벨 끝났습니다 선호 방해 하 고 세포 외 도메인 VWF 바인딩을 위해 중요 있을 수 있습니다. 그러나, DIOC6는 막 투과성 염료, 그것 수 있습니다 또한 수에서 채택 내 피 세포에 의해 소량 실험의 과정을 통해. 형광 현미경의 부재, 다른 연구는 VWF 혈소판 문자열 밝은 분야 현미경 검사 법46을 사용 하 여 관찰.
결론적으로,이 흐름 챔버 방법론 VWF 혈소판 문자열 형성의 혈전 증의 병 인에서 vivo에서 관측을 지원 하기 위해 기계, 실시간 데이터를 제공할 수 있습니다. 강하게 전단에 노출은 병 태 생리 역할 VWF thrombo 염증 성 질환에 미치는 영향, 흐름 챔버 모델은 어떤 랩이 내 피 세포-혈소판 상호 작용을 이해 하는 데 관심이 대 한 중요 한 조사 도구 컨텍스트입니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
앨리슨 Michels 프레더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금에서는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR)의 받는 사람입니다. 로 라 L. Swystun 받는 사람 CIHR 화목입니다. 데이비드 Lillicrap 캐나다 연구의 자에 분자 Hemostasis의 받는 사람입니다. 이 연구는 일부 CIHR 그랜트 (MOP-97849)를 운영 하 여 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
References
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