Summary
本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。
Abstract
フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF) はポリコームタンパク糖タンパク質の凝固因子血小板粘着および血管内皮細胞障害のサイトで集計を仲介し、循環の第 VIII 因子を運ぶ。VWF は、血管内皮細胞で合成しプラズマに恒常解放ですかまたは止血チャレンジへの応答でのオンデマンド リリース Weibel Palade 体 (WPBs) と呼ばれる特殊な細胞小器官で格納されます。凝血促進および炎症性刺激は、WPB エキソサイトーシスと VWF リリースを急速に引き起こすことができます。VWF は、血管内皮細胞によるリリースの大半が循環するプラズマ;ただし、VWF の割合は、血管内皮細胞表面に固定されています。生理学的なせん断の条件の下で内皮アンカー VWF は、血栓形成の nidus を表す VWF 血小板文字列を形成血小板にバインドできます。流れ溜まりは、内皮細胞から VWF のリリースと再現し VWF を介する血栓形成の病態に関連する方法でキャプチャ後の血小板を視覚的に観察する使用できます。この方法を使用すると、内皮細胞培養流れ区域で、WPB の開口放出を誘発する分泌促進物質でその後刺激です。洗浄血小板は、活性化された血管内皮細胞に灌流します。血小板が活性化し、その後の流体の流れ方向に細長い VWF 文字列にバインドします。凝血促進、炎症性刺激として細胞のヒストンを使用して、ヒストン治療血管内皮細胞, 血管内皮細胞と比較して増加した VWF 血小板文字列形成を観察した.このプロトコルでは、止血と血栓形成モデルの VWF 血小板相互作用の活性化の定量的・視覚・ リアルタイム評価について説明します。
Introduction
血栓症は、死亡率世界1の主要な原因で応答 todysregulated 血小板活性化とトロンビン生成両方 veinsand 動脈内で開発することができます。VWF の血漿中濃度は血液凝固の重要な調節因子、という低いレベル (< 50%) フォン Willebrand の病気 (VWD)2および高レベルとして知られている出血障害が発生 (> 150%) 静脈3のリスクの増加に関連付けられていると4動脈血栓症。
VWF はポリコームタンパク糖巨核球や血管内皮細胞により合成、血小板 α 顆粒と WPBs にそれぞれ格納されます。止血の挑戦時に VWF 活性化血管内皮細胞5または容器壁6露出したコラーゲンに血小板を循環をテザーに内皮細胞の WPBs から解放できます。内皮細胞と VWF のアンカーは、P-セレクチン ・ タンパク7とインテグリン αvβ38によって媒介される示されています。血小板 α 顆粒店の後続のリリースはさらに血小板血小板相互作用血小板栓形成、凝固カスケードとフィブリンの伝播に必要な足場を安定させるためにローカライズされた VWF 濃度を増やすことができます。蒸着。VWF の血小板結合活性より止血作用9,10を有する高分子量多量とポリコームタンパク体質によって調整されます。循環、VWF も血液凝固因子の第 VIII のためのキャリアとして機能します。
流体のせん断応力は、VWF の生理学の本質的なレギュレータです。剪断応力がない場合は、VWF は血小板糖蛋白 Ib 接着11の結合ドメインを隠して球状の形で存在します。せん断応力が存在する場合は、メタロプロテアーゼ、disintegrin、トロンボスポンジン モチーフ (ADAMTS13) メタロプロテアーゼの胸の谷間のサイトが公開されます。ADAMTS13 裂く裸と血小板装飾の VWF 文字列多量体のサイズを調節するその止血作用12を減らします。
VWF は急性期蛋白質、低酸素症13、感染症14、炎症性サイトカインなど、多数の刺激は、血管内皮細胞から VWF リリースを仲介する示されています。他に似たような炎症剤、細胞のヒストンも示されている全身 VWF リリース マウス15,16と血小板体外17,18,の活性化を誘導する19. このリジンの違いとして、ヒストンのサブタイプに依存することが示され、アルギニン含有量関数15に影響を与える可能性があります。流れ区域を確立する研究目標は、リジンが豊富な (HK) の影響を調査するモデルし、アルギニンが豊富な (HR) ヒストン サブタイプと内皮の VWF リリースとリアルタイムの血小板の分泌促進薬、潜在的な初期イベントでキャプチャ炎症による血栓症です。
この流れの商工会議所の方法論は、ビジュアルと、再現と定量化にある生体外でシステムで subendothelial コラーゲン、血管内皮細胞、VWF と血小板の生体内での相互作用を繰り返します。WPB 分泌、血小板の活性化と VWF 分解を含む VWF 血小板の相互作用を調節する経路のすべての側面のリアルタイム評価が可能です。VWF のせん断応力を制御条件の下での研究は、ADAMTS135VWF リリースと血小板結合関数20、WPB 生理21VWF 胸の谷間を損なう VWD の突然変異を評価に使用されています。この方法論を使用して、炎症性刺激の結果として VWF 血小板文字列形成の定量化: 細胞のヒストン。
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Protocol
これらの研究は、研究倫理委員会の女王の大学、カナダによって承認されました。
1. 血管内皮細胞刺激
-
コラーゲン コート 6 ウェル培養プレート。
- 事前に、コート 1 ml コラーゲンの 37 ° C で 6 も組織培養プレート h 24 バッファー (50 μ G/ml ラット尾コラーゲン タイプ 1 0.02 M 氷酢酸と)。
- 2 mL のハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) で 2 回洗浄します。
注: プレート錫箔に包まれてでき 4 ° C で気密のポリ袋で保存
- 内皮細胞成長培地含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 2 mL でよくあたり 1 x 10 の6セルの密度での種子。37 ° C (5% CO2) で 24 時間のセルを孵化させなさい。
注: ここでは、血液由来内皮細胞 (BOECs) 通路 5 と 15 の間使用されました。BOECs はスタークらに参照されるメソッドを使用して野生型 VWF シーケンスを持つ健康なボランティアから分離しました。22ゼウス23によって前述 1 と同様の方法で。 - 24 h 後、培地を取り除き、HBSS でセルを洗浄します。
- 無血清培地 (FBS せず最小限不可欠な成長媒体) 含むホルボール 12-ミリスタート 13-アセタートの 1 mL を追加 (PMA; 100 nM)、37 ° c (5% CO2) 2 h のセルに HR (25 μ G/ml ですべて) や HK 未分画ヒストン (UH)。
ヒストンのこの集中は、徐らによる以前の in vitro毒性レポートに基づいていたメモ。24とエイブラムスら。25 50 μ g/mL を使用。 - 2 時間後メディアを収集して分析まで-20 ° C で保存します。
2 酵素結合抗体法 (ELISA) による VWF の定量化
- バッファー (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩と 145 mM 塩化ナトリウム, pH 7.2) 含む 10 μ G/ml ポリクローナル抗 VWF 抗体 4 ° C で一晩をコーティングの 100 μ L でマイクロ プレートをコートします。
- 洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回、洗浄 (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩、塩化ナトリウム 500 mM、0.1% Tween 20、pH 7.2)。
- 1:2 と 1:4 洗浄バッファー中のサンプルを希釈し、1:10 から始まる標準的なカーブの通常の参照のプラズマを使用して希釈。
- 希釈試料 100 μ L をプレートし、基準が 4 ° C で一晩
- 洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回洗浄します。
- 希釈抗 VWF、プレートに HRP 標識の検出の抗体 (1.1 μ g/μ L で洗浄バッファー) の 100 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。
- プレートを洗浄し、製造元の指示に従って、o-フェニレンジアミン二塩酸塩 (OPD) 試薬で 10 分間インキュベートします。
- だから 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4読み取り 492 でプレート nm。
3. 固相ヒストン VWF の結合の試金
- 0.5% ナトリウム デオキシ コール酸 50 mM 炭酸バッファー (pH 9.6) 一晩 4 ° C で 10 μ g/ml で希釈したヒストンをマイクロ プレートをコートします。
- 3 回を 250 μ L の PBS を 0.1% 添加した洗浄するトゥイーン 20、洗浄の間 10 分間インキュベートします。
- 200 μ L の PBS 0.1% Tween 20 と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間で補完とプレートをブロックします。
- 3.2 の手順を繰り返します。
- 連続希釈血漿由来 VWF/ヒューマンファクター 25 mU/mL の生理食塩水のバッファー内に 200 mU/mL から複雑な VIII (塩化ナトリウム 10 mM 塩基リン酸ナトリウム,での 500 mM と 0.1% Tween 20、pH 7.2)。室温で 2 h のプレートに 100 μ L を追加します。
- 3.2 の手順を繰り返します。
- VWF PBS-0.1% Tween 20 と縮尺ウサギ ポリクローナル抗 VWF 抗体室温で 1 時間 HRP 標識を含む溶液 100 μ L を使用して固定化ヒストンの結合を検出します。
- 3.2 の手順を繰り返します。
- OPD 試薬の 100 μ L で 30 分のプレートを孵化させなさい、従って 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4。492 の光学濃度を測定 nm。
4. フロー チャンバーに内皮細胞の播種
- ルアーロック 1 mL シリンジに 0.5 mL のコラーゲン ・ コーティング バッファー (ステップ 2.1 で説明) をロードします。
- 流れチェンバー スライドの貯水池にルアーロック注射器末をねじる。
- 全体のレーンをコーティングし、各タンクは満杯までプランジャーをゆっくりと押します。各レーンの繰り返し、インキュベート室 24 h の 37 ° C にします。
- 200 μ L ピペットとコラーゲン ・ コーティング バッファーを吸い出しなさい。注射器 1 mL HBSS、別の読み込みし、ゆっくりと流れ区域の各レーンを洗浄するプランジャーを押します。流れ区域の反対の端に 200 μ L ピペットの洗浄を吸い出しなさい。2 回繰り返します。
- 10% の培地に 3 x 10 6/mL の細胞内皮細胞 (BOEC) ソリューションの約 100 μ L をピペット流れ区域の車線に FBS。
注: 内皮細胞の播種密度はチャンバーの容量を超えています。これは、最大チャンネル報道;非付着性のセルは、その後洗浄ステップで削除されます。 - インキュベート室 24 時間変更の 37 ° C に媒体 (ステップ 4.4) のようにルアーロック注射器を使用してすべての 8-12 h。車線で目に見える気泡がないことを確認します。
5. ひと全血から血小板を分離します。
- 生物学的安全キャビネット 30 G 針付け無添加 3 mL 血液コレクション バキュテナーにバッファー酸クエン酸塩デキスト ロース (クエン酸ナトリウム 85 ミリメートル、111 mM D-グルコースと 71 mM クエン酸、pH 4.5) の 300 μ L を追加します。
- 次のベルナルドら26刊に類似したプロトコル (抗血小板作用と非ステロイド性抗炎症薬から 7 日間無料) 健常者から穿刺 (3 mL の 3 つの管) で全血を収集します。
- 静脈穿刺に関連する初期組織の損傷は自発的な血小板の活性化を引き起こすことができます最初のチューブを破棄します。
- 優しくする血液の抗凝固剤を混ぜて 3 回、vacutainers を反転します。
- 遠心分離機の 24 ° C (常温) で 15 分の 150 x g で vacutainers。
- ゆっくりと生物学的安全キャビネットのピペット (清) 血小板豊富な血しょうを削除し、慎重に 15 mL の円錐管にそれを転送します。潜在的なクロス活性化を避けるために単一の円錐管に各バキュテナーの血小板豊富なボリュームを転送します。
注: 血小板分離は、生物学的安全性の細菌汚染と潜在的な人工血小板や血管内皮活性化を防ぐためにキャビネットで実行する必要があります。 - 血小板をペレットに 24 ° C (常温) で 10 分の 900 x g で円錐管を遠心します。
- ピペットし、血小板貧しい上澄みを廃棄します。
- 1 mL のクエン酸グルコース ナトリウム (CGS) バッファー (クエン酸ナトリウム 13 mM、30 mM D-グルコースおよび 120 mM 塩化ナトリウム、pH 7.0) で慎重にペレットを洗浄します。
注: CGS バッファーが追加され、ペレットは優しく再停止されると、血小板が wisp のようなフォーメーションで表示をされます。血小板の活性化によって汚染されたサンプルで血小板が簡単に再懸濁しますないと固まりが表示されます。 - 完全に再停止一度遠心分離機の 24 の ° C (常温) で 10 分の 900 x g でサンプル。
- CGS 洗浄バッファーを削除し、タイロード バッファー (塩化ナトリウム 138 mM、5.5 mM 0.36 mM 塩基リン酸ナトリウム 2.9 mM の塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム 12 mM D-グルコース pH 7.4) の 3 mL にペレットを再懸濁します。血小板の完全な再懸濁を確保し、集計が観察される場合、サンプルは廃棄します。
- 最終濃度 1 μ M の洗浄血小板の各 3 mL の円錐管に 20 mM DiOC6 原液 (57.25 mg 5 mL のメタノールに溶解) から 1.5 μ L を追加します。
注: DIOC6 は緑蛍光ミトコンドリア染料ラベル血小板この実験で使用されています。 - 3 1.5 mL 遠心チューブに洗浄血小板溶液の分注 1 mL。
注: この実験に必要な血小板容積が流れ区域、目的のせん断応力と実験 (ステップ 6.5) の長さのサイズに基づいて計算されます。このプロトコルは、流体の流れの十分な量があることを確認に状況の変化に応じて調整できます。 - 分離の 2 h 内洗浄血小板を使用します。
6. 流動装置アセンブリ
- 一端おすエルボ ルアーロック コネクタと他の女性のルアーロック ロック アダプター (1.6 mm の内部の直径) をチューブ滅菌シリコーン 70 cm 部分を添付します。
- 20 mL の注射器をチューブに接続されている女性のルアーロック ロック アダプターを接続します。
- 6.1 と 6.2 二度 3 つの同一のシリンジ チューブ接続を生成する手順を繰り返します。
-
シリンジ ポンプを使用すると、流体の流れを生成できます。シリンジ ポンプに次の設定を入力: 注射器とフロー レートの内部の直径。
メモ: 20 mL シリンジ 19.55 の mm の内部の直径があります。流量は、所望せん断率/せん断応力とフロー チャンバーの寸法に基づいて計算されます。1 dyn/cm2 (で観測された低静脈傾斜) を達成するために現在の研究で使用されるフロー チャンバー 9.37 μ L/分の流量が必要です。静脈血栓症へのヒストンのリンクの証拠のため 4.45 dyn/cm2の適度な静脈のせん断強度が選択されます。これはまた水に同じような粘度をバッファーには仮定に基づいています。流量 41.7 μ L/分方程式様々 なフロー槽寸法の流量はで見つけることができますを計算するために使用と等しいです。- シリンジ ポンプのボタン オプションを使用して流体を撤回するためにポンプを設定します。
- シリンジ ポンプのチューブに接続されている 3 つの注射器を読み込み、シリンジとプランジャーの前後にかっこをしっかりと保護します。
- おすエルボ ルアーを滅菌シリコン チューブの 2 番目の 20 cm 部分の両端に接続します。
- 1 つ肘ルアーを鈍化 18 ゲージ針に接続します。
- 流れ区域の 3 つの車線のための 3 つの同じ摂取量システムの作成を 2 回、繰り返します。
注: シリコン チューブとルアーズ再利用前に蒸留水に続いて 10% 漂白剤で洗浄できます。フローの部屋を再利用することはお勧めしません。
7. 顕微鏡設定
- 完全に自動化されたステージを搭載した回転ディスク顕微鏡を使用します。633 nm レーザー線、543, 491 458 405 レーザー発射と照明を実行します。20 × 対物ですべての画像をキャプチャします。解析ソフトウェア (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) のすべてのパラメーターを調整します。
- チャンネル設定を選択 (排出フィルター: 520/35)、491 で励起による獲得のための nm。完全に動的なデータ範囲を取得する 200 ms の露光時間で 150、電子乗算増加に電荷結合素子を掛けて電子を設定します。
注: 血小板が緑色蛍光色素、DiOC6、波長マキシマと付け (励起, 482 nm; 排出, 504 nm)。 - 20 %491 nm レーザー パワーを調整します。
- すべての 3 つの車線の中心をマークし、z の範囲の 1 μ m、0.5 μ m 用ステップ サイズを選択します。選択時間ポイント (つまり時間) の数とイメージをキャプチャするイメージ (すなわち間隔) の間の時間ごとの 10 s。スライドあたり「60 時間ポイント」を選択します。3 つの車線からのイメージをキャプチャし、実験の指定フォルダーに保存する顕微鏡を設定します。
注: 流れ区域は 3 つの車線があるため顕微鏡必要があります、画像をキャプチャする 3 つの位置の間で切り替えます。
8. VWF 血小板文字列生成
- (手順 4) からの流れ区域から培養液を削除手順 4.4 のように同じ技術を使用して。
- いずれかのヒスタミン (25 μ M)、PMA の 100 μ L を追加 (100 nM)、UH、香港、または HR (25 μ G/ml ですべて) 室温と周囲 O2/CO2で 15 分の BOEC 膜を刺激するために (手順 1.4) のように無血清培地で希釈しました。
メモ: VWF リリースには必要ないは、VWF エキソサイトーシス27を高めることが 37 ° C でこの刺激を実行します。 - 確実につ 3 つの流れ区域の別のレーンに残る実験コントロールとして未処理。
- 1 mL の注射器を使用してメディアを削除し、内皮膜から分泌促進物質を洗浄する PBS の 100-200 μ L で置き換えます。
- 血管クリップを使用して場所に商工会議所を保護するスライド スタンドに流れ区域をマウントします。
- 流れ区域の貯水池へ (注射器に接続) 70 cm チューブの端に利用できる男性ルアーロック コネクタを取り付けます。2 その他流れ商工会議所レーンに繰り返します。
- PBS 洗浄を削除するシリンジ ポンプを起動します。反対の流れ商工会議所貯水池にピペット追加 PBS に車線がドライ実行しないように。
- すべての 3 つのレーンと等価フロー用フロー システムを観察し、シリンジ ポンプを一時停止します。
- 実験の間ほぼ同じエリアで、各レーンの中頃で画像をキャプチャする領域を選択します。
注: 人の顕微鏡で動作は実験条件に盲目にすることができます。この手順により、顕微鏡が血小板の流れの前に集中する (手順 7 を参照)。 - 女性ルアー カプラーを添付5 mL シリンジにし無料男性ルアーロック コネクタ (ステップ 6.8) 洗浄血小板溶液 (ステップ 5.13) 1.5 mL 遠心チューブに鈍い針を沈める。システム内で気泡がないようにチューブを介して血小板ソリューションをゆっくりと描画します。
- 5 mL シリンジを取り外し、流れ区域のオープンの貯水池に男性のルアーを取り付けます。3 つの車線に繰り返します。
- ・ シリンジ ポンプを再起動し、暗闇の中で 10 分間ステップ 7 から顕微鏡とプロトコルの設定を使用して血小板フロー中にイメージをキャプチャします。
- 10 分後流チャンバー貯水池で吸気管から、ルアーを外し、リザーバーは内皮細胞の膜上の流れを維持するために PBS。
(9) VWF 血小板文字列定量化
注: PBS の連続的な流れは、画像解析の VWF 血小板文字列伸長を維持するために必要です。フローの停止が球状になる VWF と VWF 血小板文字列定量化を損ないます。イメージ キャプチャの間に PBS で各貯水池を先頭に不可欠です。このステップの間に細胞の縮小や剥離が発生した場合、HBSS は PBS を置き換えることができます。
- 第 1 レーンに始まり、スライドの中央周辺の 20 X 対物レンズを使用して重複なし 10 枚のスライドをキャプチャします。各レーンのこの手順を繰り返します。
注: 乱流せん断応力による貯水池周辺は避けてください。 - 画像処理ソフトウェアを使用すると、「画像」、「調整、」と「明るさ/コントラストです」をクリックして明るさを調整します。定量化のために十分によく付着血小板を見なすことができるまで、スクロール バーをドラッグします。
- 画像の 3 つ以上の一直線に並べられた血小板が観察されるときは、VWF 血小板文字列を記録します。イメージ内のすべての VWF 血小板文字列をカウントします。すべての 10 の画像の繰り返し、実験の平均します。
注: 定量化を行う人は実験条件に盲目にすることができます。これは、独立した研究8,28,29によって確認されて、VWF の共同染色する必要はありません。 - 最低 3 回各分泌促進物質を評価する実験を繰り返します。
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Representative Results
VWF リリース血管内皮細胞からのヒストンの影響を直接評価、2 h の無血清培地含む PMA (肯定的な制御)、UH、HR、および香港に合流 BOECs を公開しました。我々 は、HK 誘発処理血管内皮細胞 (図 1) の中の VWF 蛋白質 (VWF:Ag) の 2 倍増加したことを示した。興味深いことに、BOECs に UH と HR 刺激されたときが VWF:Ag 以下が検出されました未処理状態により中。培養液中の VWF:Ag 検出の妨げがあります特異的ヒストンは、VWF30に直接バインドすることができます、ので、我々 の仮説。VWF にヒストン結合を評価するには、固相結合の試金を使用しました。我々 は、UH と HR HK (図 2) より VWF により強くバインド検出干渉をサポートは、図 1に示すことを示した。
体外血小板19をアクティブにする細胞のヒストンが示されているし、示唆されたヒストンが内皮細胞から VWF リリースを仲介します。VWF 血小板の相互作用に及ぼすヒストンを特徴付ける、VWF 血小板文字列形成標識血小板が刺激血管内皮細胞灌流チャンバー モデルを使用しました。代表的な画像キャプチャの後流と VWF 血小板文字列数の定量を行った。
フロー条件の開始を受けて、未処理細胞は非常に少数の VWF 血小板の文字列を持っていたことがわかった (< レビュー フィールドあたり 1 つの文字列)、ヒスタミンと PMA 処理細胞それぞれ 2.10 と 3.10 文字列の平均があった。VWF 血小板文字列セルは、HK と扱われたときに形作られた大幅 (3.52 文字列、 P = 0.019)、HR (6.00 文字列、 P = 0.004)、および UH (5.51 文字列、 P = 0.012)。VWF 血小板文字列数のグラフィカル表現を図 3に示します。ビデオ 1 a、Bに UH 未処理細胞に比べてレスポンスにおけるリアルタイム VWF 血小板文字列を示します。
他のグループによる調査とともに、これらの研究を示すそのヒストン28やその他の炎症剤ヒスタミン5とサイトカイン31など刺激 VWF 血管内皮細胞から分泌後血小板を仲介します。体外をキャプチャします。内皮細胞の静的な刺激はバインドし、VWF を隔離するヒストンの機能により VWF リリースを明らかに不十分であると示しました。VWF と血小板接着のフロー チャンバー モデルの設計より完全に特徴付けるし、内皮細胞、VWF と血小板の生体内相互作用をモデルする必要したがってでした。
図 1: リジンが豊富なヒストン誘導培養内皮細胞から VWF リリース。BOECs が未分画ヒストン (UH) に刺激されたリジンが豊富な (香港) とアルギニン (HR) ヒストン画分。香港は、培地に VWF のリリースを刺激しました。UH と HR 処理無処理 (Untr) を基準にして内皮細胞培地で VWF:Ag の検出を減少しました。N 3 個々 の実験を行った。データは平均値 ± SE. として表示されます *P < 0.05 * *P < 0.01 と * * *P < 0.001 が未処理状態に相対的な重要性を示します。この図は、ミケルスら15から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: VWF 検出体外に干渉する VWF ヒストン結合します。血漿由来 VWF は固相結合の試金でリジンが豊富な (HK) ヒストンと比較して用量依存的 HR と UH により強くバインドします。データは、平均値 ± SE。 個々 の実験が行われた N≥3 として表示されます。この図は、ミケルスら15から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ヒストン VWF 血小板文字列の形成を仲介する。血管内皮細胞と未分画ヒストン (UH)、リジンが豊富な扱われたスライドの流れ区域でシード (HK)、またはアルギニンが豊富な (HR) ピストン分画またはヒスタミン/PMA (肯定的なコントロール)、10 分の 4.45 dyn/cm2のせん断応力で潅流されました。洗浄、蛍光に分類された血小板。代表的な画像は無処理 (A) ヒスタミン (B) ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) (C)、(D)、HK と細胞から後血小板フローを得られた HR (E) と (F) ハワイ大学。PMA 治療は 3.1 文字列フィールドのビュー、ヒスタミンに匹敵するごとの平均となりました。VWF 血小板文字列は 10 連続レビュー フィールドから定量化され、n≥3 個々 の実験 (G) の平均します。データは平均値 ± SE. として表示されます * P < 0.05 と * * P < 0.01 が未処理状態に相対的な重要性を示します。この図は、ミケルスら15から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
の補足動画です。VWF 血小板文字列における No の処置 (1) 未分画ヒストン (2) に比べてレスポンス:このビデオはミケルスら15.から変更されています。これらのビデオをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
サイトに VWF によって血小板募集の定量化の in vitroモデルとして仕えるまま VWF 切断プロテアーゼ ADAMTS13 の存在下で急速な分解のために論争は、文字列 VWF 血小板の生理学的な関連性を中血栓の存在下で形作るかもしれないローカライズ ヒストン レベル5の増加です。また、血栓性血小板減少性紫斑病 (TTP) として - または炎症性微小 - ADAMTS13 活性などに欠けている病態で ADAMTS13 活性は阻害 VWF 血小板文字列32 体内を観察できるし、ことがあります血小板ミクロ凝集と白血球の漏出、VWF33の止血、炎症性の関数をリンクに貢献します。最後に、それは仮定されたがその文字列が VWF 血小板生成開始イベントかもしれない静脈や動脈の血栓症、病的血栓の構築を nidus を形成します。
WPB エキソサイトーシス、ADAMTS13 胸の谷間と VWF の血小板結合能を検討する VWF 血小板文字列におけるフロー チャンバー方式を使用できます。これらの実験の実行にいくつかの重要な手順があります。しかし、プロトコルに、モデルのアプリケーションに応じて修正を行うことができます。
特定の血管ベッドから血管内皮細胞は、不均一な機械的および生化学的信号34への対応。したがって、この手法の適用に適した携帯型を選択すると便利かもしれません。BOECs 増殖潜在能力のため現在の研究で使用されました。全体の数 (10 +) 通路; 表現型のメンテナンス堅牢な VWF の表現、VWF エキソサイトーシスの定量化を容易にします。他の研究者は、ひと臍帯を使用して静脈血管内皮細胞 (Huvec)5,8,28 VWD の突然変異35 を表現する VWF Cdna をトランスフェクトした非血管内皮細胞 (人間の萌芽期の腎臓 293 の細胞).それは、VWF 式により異なります組織と血管生理学36間、実証されています。VWF の蛋白質の基底分泌37、観察可能な相違がある様々 なマイクロ ・ macrovasculature から生じる培養内皮細胞と内皮細胞のサブタイプのカルシウム チャンネル違い WPB に影響を与えることの証拠があります。分泌促進薬38に応えてエキソサイトーシス。
ヒストンは、本研究では新規の分泌促進剤として使用されました。肯定的な制御、ヒスタミン、VWF リリースの頻繁に記述されている生理学的覚醒剤を比較しました。VWF:Ag ELISA は、静的条件下での血管内皮細胞から VWF リリースを確認に使用されました。VWF のリリースをトリガーする 2 つの細胞内メカニズムがある: 細胞内カルシウム39または pf サイクリック AMP の昇格レベル40。これらの経路の活性の違い、トロンビン/ヒスタミンなどエピネフリン/バソプレシン分泌刺激によって誘導 (または、デスモプレシン VWD に関連する)、それぞれ、この流れ区域を使用してこれらの 2 つの経路を比較して興味深いものがあります。VWF 血小板文字列形成のモデル。血栓炎症性疾患においては、さらにサイトカイン41または損傷/病原体関連分子パターン (DAMPS/PAMPS) などの炎症性マーカーと VWF 血小板文字列形成における役割の解明が奨励されます。
流体のせん断応力は、球状の VWF 展開血小板11の Ib 糖タンパク質の A1 ドメイン結合部位を公開するときに重要です。それは約 0.73 dyn/cm2の最小流体剪断応力は VWF 文字列42血小板結合に必要な実証されています。さらで血管内皮細胞にこれらの文字列のフォームは比較的低剪断応力 (2.5 dyn/cm2) が8以上 20 dyn/cm2のせん断応力で外れすることができます。現在の調査では、10 分実験用灌流のバッファーを節約しながら、内皮、VWF と血小板の相互作用を許可する静脈せん断応力 (4.45 dyn/cm2) を選択されています。
ADAMTS13 VWF 血小板文字列の胸の谷間を評価するこのフロー チャンバー システムを使用すると、この実験で使われたものを流体のせん断応力の増加が必要です。10 と 30 の dyn/cm212高を包含する範囲間 VWF 血小板文字列の最大 ADAMTS13 胸の谷間で発生中等度の動脈せん断応力43静脈。このシステムではせん断速度を変更する VWF 血小板文字列形成と溶解、静脈、動脈、または微小血管の血栓症の開発の要因を比較するのに役立ちます。
灌流と流れ区域はこの手法の追加変更が可能です。分泌促進物質は、生体内環境のように流れの中で管理できます。その反応を評価するアゴニストの血小板をプライミングまたは白血球ポピュレーションをなどは、この手法の拡張です。さらに、ターゲット VWF 多量体の長さ、血小板結合能、血小板反応性治療薬を含む血栓開発の開始を調節する重要なメカニズムの解明があります。他の研究者がいずれかの社内44を使用またはフロー室45、ポリマー ベースのスライドではなくこの研究で使用され、同等の結果を取得するように見えるガラス基板を購入しました。
VWF 血小板文字列プロトコルの重要な考慮事項は、洗浄血小板の調製です。ADAMTS13 の存在のためにこのプロトコルでは全血を使用することはお勧めできません。これは後で悪影響 VWF に、血小板粘着に影響を与える可能性がありますと、プロスタサイクリンやエンドウアピラーゼなどの血小板の活性化を防止剤を避けてください。バッファーが血小板分離前に部屋の温度に持って来られることを確認注意ピペット技術 (すなわち泡や過酷なせん断応力を避けること) を使用して、アクティブでない状態で血小板を維持するためのキー。さらに、DIOC6 やローダミン 6 G などのミトコンドリア染色で血小板をラベリングは VWF の結合に重要なことができる細胞外ドメインとの干渉です。ただし、DIOC6 は膜透過性の色素で、それがまたで取り上げられる血管内皮細胞による少量実験の経過。蛍光顕微鏡がない場合は、他の研究は、明視野顕微鏡46を使用して VWF 血小板文字列を観察しています。
結論としては、VWF 血小板文字列が生成のこの流れの商工会議所の方法論は、血栓症の病因における生体内での観察をサポートする機構、リアルタイムのデータを提供できます。強くせん断露出 VWF 血栓炎症性疾患の病態生理学的役割に影響を与える、フロー チャンバー モデルはこれで血管内皮細胞が血小板の相互作用を理解する上で興味のある研究室の重要な調査ツールコンテキスト。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
アリソン ・ ミッシェルは、フレデリック ・ バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金から、カナダ研究所の健康研究 (機構) の受信者です。ローラ ・ l ・ Swystun は、機構の交わりの受信者です。デビッド Lillicrap は、分子止血のカナダの研究の椅子の受信者です。本研究は、営業許可 (モップ 97849) 機構によって一部で賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
References
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