Summary
In questo articolo, descriviamo un metodo per valutare endoteliale von Willebrand fattore rilascio e la successiva della piastrina catturare sotto sollecitazione di taglio fluido in risposta a stimoli infiammatori, utilizzando un sistema di alloggiamento del flusso in vitro .
Abstract
Fattore di von Willebrand (VWF) è un fattore di coagulazione di glicoproteina multimerica che media l'adesione della piastrina e l'aggregazione in siti di danno endoteliale e che trasporta il fattore VIII nella circolazione. VWF è sintetizzato dalle cellule endoteliali e viene rilasciato sia costitutivamente nel plasma o viene memorizzato in organelli specializzati, chiamati corpi di Weibel-Palade (disfunzione), per il rilascio su richiesta in risposta alla sfida emostatica. Stimoli proinfiammatori e procoagulant possono indurre rapidamente WPB esocitosi e rilascio VWF. La maggior parte del VWF rilasciato dalle cellule endoteliali circola nel plasma; Tuttavia, una proporzione di sindrome di Raynaud è ancorata alla superficie delle cellule endoteliali. In condizioni di taglio fisiologico, endoteliali ancorato VWF possibile associare alle piastrine, formando una stringa di VWF-piastrine che può rappresentare il nidus della formazione di trombi. Un sistema dell'alloggiamento di flusso può essere utilizzato per osservare visivamente il rilascio di VWF da cellule endoteliali e la successiva della piastrina catturare in un modo che è riproducibile e pertinenti alla patofisiologia della formazione dell'embolo VWF-mediata. Utilizzando questa metodologia, le cellule endoteliali sono coltivate in una camera di flusso e sono successivamente stimolate con secretagoghi per indurre esocitosi WPB. Piastrine lavate sono perfusi quindi sopra l'endotelio attivato. Le piastrine sono attivate e successivamente associare a stringhe di VWF allungate in direzione di flusso del fluido. Usando gli istoni extracellulari come stimolo procoagulante e proinflammatory, abbiamo osservato formazione aumentata di stringa VWF-piastrine sulle cellule endoteliali istone-trattati rispetto alle cellule endoteliali non trattate. Questo protocollo descrive una valutazione quantitativa, visual e in tempo reale di attivazione dell'interazione VWF-piastrine in modelli di trombosi ed emostasi.
Introduction
La trombosi è delle cause principali di mortalità nel mondo1 e può svilupparsi in risposta todysregulated generazione della piastrina attivazione e trombina in entrambe le arterie varicosee. I livelli del plasma di sindrome di Raynaud sono un regolatore chiave della coagulazione del sangue, per cui bassi livelli (< 50%) provocare i disturbi emorragici conosciuto come von Willebrand (VWD) la malattia2 e livelli elevati (> 150%) sono associati con un rischio aumentato di venosa3 e trombosi arteriosa4 .
Sindrome di Raynaud è una glicoproteina multimerica sintetizzato dalle cellule endoteliali e megacariociti e archiviati in α-granuli della piastrina e disfunzione, rispettivamente. Al momento di sfida emostatica, VWF può essere liberato dalla disfunzione endoteliale Tether piastrine circolanti a cellule endoteliali attivate5 o collagene esposto sulla nave parete6. Ancoraggio del VWF alle cellule endoteliali ha dimostrato di essere mediato daP-selectin 7 e integrina αvβ38. Il rilascio successivo di negozi α-granuli delle piastrine può aumentare ulteriormente le concentrazioni localizzate di VWF per stabilizzare le interazioni della piastrina-piastrina per formazione della spina della piastrina, l'impalcatura necessaria per la propagazione della cascata della coagulazione e della fibrina deposizione. L'attività della piastrina-associazione di sindrome di Raynaud è regolata dalla relativa struttura multimerica, con multimeri ad alto peso molecolare che possiede maggiore attività emostatiche9,10. In circolazione, VWF funge anche da un elemento portante per il fattore VIII della coagulazione.
Sollecitazione di taglio fluido è un regolatore essenziale della fisiologia VWF. In assenza di sollecitazione di taglio, VWF esiste in una forma globulare, celando domini di legame per la glicoproteina piastrinica Ib adesione11. Quando la sollecitazione di taglio è presente, il sito di clivaggio per un metalloprotease, un disintegrin e metalloprotease con motivo trombospondina (ADAMTS13), è esposto. ADAMTS13 fende le stringhe VWF nude e decorato della piastrina per regolare la dimensione del multimer, riducendo così la sua attività emostatiche12.
Sindrome di Raynaud è una proteina della fase acuta, e numerosi stimoli, compreso ipossia13, infezione14e citochine proinfiammatorie, sono stati indicati per mediare il rilascio VWF dalle cellule endoteliali. Simile ad altri agenti infiammatori, gli istoni extracellulari inoltre sono stati indicati per indurre il rilascio sistemico di VWF in topi15,16 e l'attivazione delle piastrine in vitro17,18, 19. questo è stato indicato per essere dipendente da sottotipo dell'istone, come differenze di lisina e contenuto di arginina può influenzare la funzione15. Nostro studio si propone di istituire una camera di flusso modello per studiare l'influenza del ricco di lisina (HK) e acquisizione di ricchi di arginina sottotipi dell'istone (HR) e secretagoghi sulla liberazione endoteliale di VWF e piastrine in tempo reale, eventi potenziali precoci in trombosi indotta da infiammazione.
Questa metodologia di camera di flusso ricapitola in vivo interazioni tra collagene subendoteliale, cellule endoteliali, VWF e piastrine in un sistema in vitro che è visivo, riproducibili e quantificabili. Esso consente la valutazione in tempo reale di tutti gli aspetti del pathway che regola l'interazione VWF-piastrine, compreso secrezione WPB, attivazione piastrinica e proteolisi VWF. Studi di sindrome di Raynaud in condizioni di sollecitazione di taglio controllato sono stati utilizzati per valutare le mutazioni di VWD che compromettere il rilascio di sindrome di Raynaud e di funzione della piastrina-associazione20, WPB fisiologia21e scissione VWF di ADAMTS135. Usiamo questa metodologia per quantificare la formazione stringa VWF-piastrine in conseguenza di uno stimolo infiammatorio: istoni extracellulari.
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Protocol
Questi studi sono stati approvati dalla University, Canada ricerca etica Consiglio della Regina.
1. endothelial delle cellule stimolazione
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Collagene-cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
- 24 ore in anticipo, cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti a 37 ° C con 1 mL di collagene (50 µ g/mL del ratto coda collagene di tipo 1 con 0,02 M di acido acetico glaciale) del buffer.
- Lavare i pozzetti due volte con 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS).
Nota: Piastre possono essere avvolto in carta stagnola e memorizzati in un sacchetto di plastica ermetico a 4 ° C.
- Seme le cellule endoteliali ad una densità di 1 x 106 cellule per pozzetto in 2 mL di crescita media contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C (5% CO2).
Nota: Qui, cellule endoteliali escrescenza del sangue (BOECs) tra passaggi 5 e 15 sono state utilizzate. BOECs sono stati isolati dai volontari sani con una sequenza VWF wildtype utilizzando un metodo di riferimento in Starke et al. 22 in un modo simile a quello precedentemente descritto da Giove23. - Rimuovere il supporto dopo 24 h e lavare le cellule con HBSS.
- Aggiungere 1 mL di medium senza siero (minimal essenziale crescita medio senza FBS) contenenti phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; 100 nM), non frazionata dell'istone (UH) e HK o HR (tutti a 25 µ g/mL) per le cellule per 2 h a 37 ° C (5% CO2).
Nota: Questa concentrazione dell'istone era basata su rapporti precedenti in vitro citotossicità di Xu et al. 24 e Abrams et al. 25 che usato 50 µ g/mL. - Raccogliere il mezzo dopo 2 h e conservare a-20 ° C fino all'analisi.
2. VWF quantificazione di enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA)
- Rivestire una micropiastra con 100 µ l di rivestimento anticorpo contenente del policlonale anti-VWF di 10 µ g/mL di tampone (10mm bibasico cloruro di sodio fosfato di sodio e 145 mM, pH 7,2) durante la notte a 4 ° C.
- Lavare la piastra tre volte con 250 µ l di tampone di lavaggio (fosfato di sodio bibasico 10 mM, 500 mM di cloruro di sodio e 0.1% Tween 20, pH 7,2).
- Diluire i campioni medi 1:2 e 1:4 con tampone di lavaggio e utilizzare plasma di riferimento normali per una curva standard, iniziando da un 01:10 diluizione.
- Piastra di 100 µ l dei campioni diluiti e norme durante la notte a 4 ° C.
- Lavare la piastra tre volte con 250 µ l di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 100 µ l di anti-VWF diluito, anticorpo di rilevazione HRP-coniugato (1,1 µ g / µ l di tampone di lavaggio) alla piastra e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare la piastra ed incubare per 10 min con O-fenilendiammina dicloridrato (OPD) reagente, secondo le istruzioni del produttore.
- Fermare la reazione con 100 µ l di 1 M H2così4 e leggere la piastra a 492 nm.
3. fase solida istone-VWF analisi obbligatoria
- Rivestire una micropiastra con gli istoni diluiti in 0,5% sodio desossicolato 50mm carbonato soluzione tampone (pH 9,6) a 10 µ g/mL durante la notte a 4 ° C.
- Lavare la piastra tre volte con 250 µ l di PBS supplementato con 0.1% Tween 20, incubare per 10 minuti tra i lavaggi.
- Bloccare la piastra con 200 µ l di PBS completati con 0.1% Tween 20 e 1% albumina di siero bovino (BSA) per 1 h a temperatura ambiente.
- Ripetere il punto 3.2.
- Diluire in serie derivati dal plasma umano VWF/fattore VIII complesso da 200 mU/mL a 25 mU/mL in tampone salino (cloruro di sodio di 10 mM fosfato di sodio bibasico, 500mm e 0.1% Tween 20, pH 7,2). Aggiungere 100 µ l alla piastra per 2 h a temperatura ambiente.
- Ripetere il punto 3.2.
- Rilevare l'associazione di sindrome di Raynaud Histone immobilizzato utilizzando 100 µ l di una soluzione contenente PBS-0.1% ' Tween 20 e 1:1,000 coniglio anticorpo policlonale anti-VWF coniugato a HRP per 1 h a temperatura ambiente.
- Ripetere il punto 3.2.
- Incubare la piastra per 30 min con 100 µ l di reagente OPD e interrompere la reazione con 100 µ l di 1 M H2così4. Misurare la densità ottica a 492 nm.
4. cellule endoteliali sul flusso Chambers di semina
- Caricare 0,5 mL di tampone di collagene-rivestimento (descritto al punto 2.1) in una siringa da 1 mL Luer-lock.
- Ruotare l'estremità Luer-lock della siringa sul serbatoio di una diapositiva di camera di flusso.
- Spingere lentamente lo stantuffo fino a quando l'intera corsia è rivestita e ciascun serbatoio è pieno. Ripetere per ogni corsia e incubare la camera a 37 ° C per 24 h.
- Aspirare il buffer di collagene-rivestimento con una pipetta 200 μL. Caricare un'altra siringa da 1 mL HBSS e premere lo stantuffo lentamente per lavare ogni corsia della camera del flusso. Aspirare il lavaggio con una pipetta 200 μL all'estremità opposte della camera del flusso. Ripetere due volte.
- Circa 100 µ l di una soluzione di 3 x 106 cellule/mL delle cellule endoteliali (BOEC) nel medium di crescita con 10% FBS sulla corsia di una camera di flusso.
Nota: La densità di semina delle cellule endoteliali supera la capacità della camera. Questo è per garantire la copertura massima del canale; cellule non aderenti vengono rimossi nel passaggio per i lavaggi successivi. - Incubare la camera a 37 ° C per 24 h. cambiamento medio ogni 8-12 h utilizzando siringhe Luer-lock (come descritto al punto 4.4). Assicurarsi che non siano nessun bolle visibile nei vicoli.
5. isolare le piastrine da sangue umano intero
- In un armadietto con un ago 30 G di sicurezza biologica, aggiungere 300 µ l di tampone acido citrato destrosio (citrato trisodico 85 mM, 111 mM D-glucosio e acido citrico di 71 mM, pH 4.5) per un additivo-libero 3 mL sangue raccolta vacutainer.
- Raccogliere sangue intero da volontari sani (gratuito da anti-piastrine e non-steroidei anti-infiammatori per sette giorni) mediante prelievo venoso (tre tubi da 3 ml), a seguito di un protocollo simile a quello pubblicato da Bernardo et al.26.
- Scartare il primo tubo, come il danno iniziale del tessuto connesso con l'iniezione in vena può causare l'attivazione piastrinica spontanea.
- Capovolgere delicatamente la consegnate tre volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante.
- Centrifugare la consegnate a 150 x g per 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
- Rimuovere lentamente il plasma ricco di piastrine (surnatante) con una pipetta in una cappa di sicurezza biologica e attentamente trasferirlo in una provetta conica da 15 mL. Trasferire il volume ricco di piastrina di ogni vacutainer una singola provetta conica per evitare potenziale inter-attivazione.
Nota: Isolamento delle piastrine deve essere eseguita in un armadietto per prevenire la contaminazione batterica e potenziali della piastrina artificiale e/o attivazione endoteliale di sicurezza biologica. - Centrifugare le provette coniche a 900 x g per 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente) a pellet le piastrine.
- Pipettare e scartare il surnatante della piastrina-poveri.
- Lavare la pallina con attenzione con 1 mL di tampone di citrato-glucosio-sodio (CGS) (citrato di sodio 13 mM, 30 mM D-glucosio e 120 mM di cloruro di sodio, pH 7.0).
Nota: Le piastrine apparirà nelle formazioni di wisp-come quando il buffer CGS viene aggiunto e il pellet è risospeso delicatamente. Nei campioni contaminati da attivazione piastrinica, le piastrine non saranno facilmente Risospendere e appariranno disomogeneo. - Una volta completamente risospeso, centrifugare i campioni a 900 x g per 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
- Rimuovere il tampone di lavaggio CGS e risospendere il pellet in 3 mL di tampone di Tyrode (cloruro di sodio 138 mM, 5,5 mM D-glucosio, bicarbonato di sodio di 12mm, 2,9 mM di cloruro di potassio e fosfato di sodio bibasico 0,36 mM, pH 7.4). Garantire la completa risospensione delle piastrine e, se si osservano aggregazioni, scartare il campione.
- Aggiungere 1,5 µ l da un 20 mM DiOC6 soluzione di riserva (dissolvenza 57,25 mg in 5 mL di metanolo) in ogni provetta conica da 3 mL di piastrine lavate per una concentrazione finale di 1 µM.
Nota: DIOC6 è una tintura mitocondriale fluorescente verde utilizzata in questo esperimento alle piastrine di etichetta. - Aliquotare 1 mL della soluzione delle piastrine lavate a tre provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
Nota: Il volume piastrinico richiesto per questo esperimento è calcolato in base alle dimensioni del vano di flusso, la sollecitazione di taglio desiderata e la lunghezza dell'esperimento (passo 6.5). Questo protocollo può essere regolato al cambiamento delle condizioni per assicurare che non c'è abbastanza volume per flusso del fluido. - Utilizzare le piastrine lavate entro 2 h di isolamento.
6. apparato Portacella
- Attaccare un pezzo di tubo (diametro interno di 1,6 mm) ad un connettore Luer gomito maschio ad una estremità e un femmina adattatore Luer lock a altra in silicone sterile 70 cm.
- Collegare la femmina adattatore Luer lock collegato al tubo per una siringa da 20 mL.
- Ripetere i passaggi da 6.1 e 6.2 due volte per generare tre connessioni siringa identiche.
-
Utilizzare una pompa a siringa per generare il flusso del fluido. Le seguenti impostazioni nella pompa a siringa di ingresso: diametro interno del tasso di flusso e siringa.
Nota: Una siringa da 20 mL ha un diametro interno di 19,55 mm. La portata è calcolata in base la sollecitazione di tasso/cesoia di taglio desiderato e le dimensioni della camera del flusso. Per la camera di flusso utilizzata nello studio corrente, per raggiungere 1 dine/cm2 (osservati in taglio basso venoso), è necessaria una portata di 9,37 µ l/min. A causa di prova che collega gli istoni a trombosi venosa, è selezionata una distorsione venosa moderata di 4,45 dyn/cm2 . Anche questo si basa sul presupposto che il buffer ha una viscosità simile all'acqua. La portata è quindi pari a 41,7 µ l/min. equazioni utilizzate per calcolare che la portata per diverse dimensioni della camera di flusso può essere trovata alla:- Impostare la pompa per prelevare fluido utilizzando l'opzione pulsante nella pompa a siringa.
- Caricare le tre siringhe collegate alla tubazione della pompa siringa e fissare saldamente tra parentesi quadre le siringhe e tuffatori.
- Allegare un gomito maschio Luer a entrambe le estremità di un secondo pezzo di 20 cm di tubo in silicone sterile.
- Collegare un gomito Luer un ago calibro 18 smussato.
- Ripetere due volte, creando tre sistemi di aspirazione identico per le tre corsie della camera del flusso.
Nota: Il tubo in silicone e Luers può essere lavato con candeggina al 10% seguita da acqua distillata prima di riutilizzarli. Non si consiglia di riutilizzare gli alloggiamenti di flusso.
7. microscopio impostazioni
- Utilizzare un microscopio di disco rotante dotato di un palco completamente automatizzato. Eseguire l'illuminazione con un lancio di laser che fornisce 405, 458, 491, 543 e 633 nm laser linee. Catturare tutte le immagini con un obiettivo X 20. Regolare tutti i parametri con il software di analisi (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
- Selezionare le impostazioni di canale (filtro di emissione: 520/35), con eccitazione a 491 nm, per l'acquisizione. Impostare l'elettrone moltiplicando charge coupled device ad un guadagno di elettrone-moltiplicando di 150, con un tempo di esposizione di 200 ms, per ottenere l'intervallo di dati dinamica completa.
Nota: Le piastrine sono etichettate con un colorante fluorescente verde, DiOC6, con massimi di lunghezza d'onda (eccitazione, 482 nm; emissione, 504 nm). - Regolare la potenza del laser nm 491 al 20%.
- Segnare il centro di tutte e tre le corsie e selezionare 1 μm per gamma z e 0,5 μm per dimensione del passo. Selezionare il numero di intervalli di tempo (cioè, durata) e il tempo tra le immagini (cioè, intervallo) per acquisire un'immagine ogni 10 s; Selezionare "60 punti di tempo" per ogni diapositiva. Impostare il microscopio per catturare immagini da tre corsie e salvarli in una cartella designata esperimento.
Nota: Poiché la camera di flusso ha tre corsie, necessario alternare le tre posizioni di catturare le immagini al microscopio.
8. sindrome di Raynaud-PIASTRINOGENESI String
- Rimuovere il terreno di coltura dalla camera di flusso (dal passaggio 4) utilizzando la stessa tecnica come descritto al punto 4.4.
- Aggiungere 100 µ l di entrambi istamina (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK o HR (tutti a 25 µ g/mL) diluito in medium senza siero (come descritto al punto 1.4) per stimolare il monostrato BOEC per 15 min a temperatura ambiente O2Co2.
Nota: Anche se non necessario per il rilascio VWF, eseguendo questa stimolazione a 37 ° C migliorerà VWF esocitosi27. - Garantire che uno dei tre corsie separate della camera del flusso rimangono non trattate come un controllo sperimentale.
- Rimuovere il supporto utilizzando una siringa da 1 mL e sostituirlo con 100-200 µ l di PBS per lavare secretagogues fuori il monostrato endoteliale.
- Montare la camera di flusso su uno stativo di diapositiva utilizzando clip vascolari per fissare la camera a posto.
- Collegare il connettore Luer maschio disponibile sull'estremità del tubo di 70 cm (collegato alla siringa) al serbatoio della camera del flusso. Ripetere per le due altre flusso camera corsie.
- Avviare la pompa a siringa per rimuovere il lavaggio con PBS. Pipetta ulteriori PBS nel serbatoio dell'alloggiamento di flusso avversaria per garantire che le corsie non funzionare a secche.
- Osservare il sistema di flusso per flusso equivalente attraverso tutte le tre corsie e quindi sospendere la pompa a siringa.
- Selezionare un'area di catturare le immagini in circa la metà di ogni corsia, in più o meno la stessa zona fra gli esperimenti.
Nota: La persona che gestisce il microscopio può essere accecata delle condizioni sperimentali. Questo passaggio garantisce che il microscopio è focalizzato prima della portata delle piastrine (vedere il passaggio 7). - Allegare un accoppiatore femmina luer per una siringa da 5 mL e poi per il connettore luer maschio libero (passo 6,8) e immergere l'ago smussato nel tubo del microcentrifuge 1,5 mL contenente la soluzione di piastrine lavate (passo 5,13). Disegnare lentamente la soluzione piastrinica attraverso la tubazione per non garantire bolle d'aria all'interno del sistema.
- Rimuovere la siringa da 5 mL e collegare il Luer maschio al serbatoio aperto della camera del flusso. Ripetere per tre corsie.
- Riavviare la pompa a siringa e catturare le immagini durante il flusso della piastrina utilizzando le impostazioni di microscopio e protocollo dal passaggio 7 per 10 min al buio.
- Dopo 10 min, staccare il tubo di aspirazione del serbatoio di camera di flusso il Luer e riempire il serbatoio con PBS per mantenere il flusso sopra il monostrato endoteliale.
9. VWF-piastrine String quantificazione
Nota: Il flusso continuo di PBS è necessaria per mantenere l'allungamento di stringa VWF-piastrine per analisi di immagine. Cessazione di flusso comporterà il VWF diventando globulare e comprometterà la quantificazione di stringa VWF-piastrine. È necessario rabboccare ogni serbatoio con PBS durante la cattura dell'immagine. HBSS può sostituire PBS se riducendo la cella o distacco è osservato durante questo passaggio.
- Inizio con il primo vicolo, catturare 10 immagini per ogni diapositiva senza sovrapposizione utilizzando un 20 X obiettivo obiettivo intorno metà della diapositiva. Ripetere questa operazione per ogni corsia.
Nota: Le aree che circondano i serbatoi dovrebbero essere evitate a causa della turbolento shear stress. - Utilizzando il software di elaborazione delle immagini, regolare la luminosità facendo clic su "Immagine", "Regola" e "Luminosità/contrasto". Trascinare la barra di scorrimento fino a quando le piastrine aderite possono essere visti abbastanza bene per quantificazione.
- Registrare una stringa di VWF-piastrine quando tre o più allineate le piastrine sono osservate nell'immagine. Contare tutte le stringhe di VWF-piastrine in un'immagine. Ripetere per tutte le 10 immagini e media per l'esperimento.
Nota: La persona che effettua la quantificazione può essere accecata delle condizioni sperimentali. Non è necessario co-macchia per VWF, come questo è stato confermato da studi indipendenti8,28,29. - Ripetere l'esperimento un minimo di tre volte per valutare ogni secretagogo.
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Representative Results
Per valutare direttamente l'effetto degli istoni sul VWF rilascio dalle cellule endoteliali, siamo esposti confluenti BOECs medium privo di siero contenente PMA (controllo positivo), UH, HR e HK per 2 h. Abbiamo mostrato che HK ha indotto un aumento di 2 volte in proteina VWF (FvW: AG) nel mezzo delle cellule endoteliali trattate (Figura 1). È interessante notare che, quando BOECs sono stati stimolati con UH e HR, c'è stato meno FvW: AG rilevato in mezzo più nella condizione di non trattato. Abbiamo supposto che perché gli istoni possono associare direttamente a sindrome di Raynaud30, differenzialmente potrebbero interferire con il rilevamento di FvW: AG nel terreno di coltura. Per valutare l'associazione dell'istone di VWF, abbiamo usato un'analisi obbligatoria di fase solida. Abbiamo mostrato che UH e HR più fortemente associato a sindrome di Raynaud di HK (Figura 2), sostenendo l'interferenza di rilevamento ha dimostrato in Figura 1.
Gli istoni extracellulari sono stati indicati per attivare le piastrine in vitro19, e i nostri dati suggeriscono che gli istoni mediano il rilascio VWF dalle cellule endoteliali. Per caratterizzare l'effetto degli istoni sulla interazione VWF-piastrine, abbiamo usato un modello di flusso di camera di VWF-stringa PIASTRINOGENESI in cui piastrine coniugate sono state irrorate sulle cellule endoteliali stimolate. Immagini rappresentative sono state catturate post-gas, e il numero di stringhe di VWF-piastrine sono stato quantificato.
Abbiamo osservato che, a seguito dell'inizio delle condizioni di flusso, le cellule non trattate avevano pochissimi VWF-piastrine corde (< 1 stringa per ogni recensione campo), mentre l'istamina e cellule trattate con PMA avevano una media di stringhe 2.10 e 3.10, rispettivamente. Significativamente più stringhe di VWF-piastrine sono formate quando le cellule sono state trattate con HK (3,52 stringhe, P = 0,019), HR (6,00 stringhe, P = 0,004) e UH (5,51 stringhe, P = 0,012). Una rappresentazione grafica del conteggio di stringa del VWF-piastrine è mostrata in Figura 3. Formazione di stringa VWF-piastrine in tempo reale in risposta a UH rispetto alle cellule non trattate è mostrata nel video 1A e B.
Questi studi, insieme con le indagini da parte di altri gruppi, mostrano che quello di istoni28 e altri agenti proinfiammatori quali istamina5 e citochine31 stimolano la secrezione di VWF da cellule endoteliali, mediando successive della piastrina catturare in vitro. Abbiamo dimostrato che la stimolazione statica delle cellule endoteliali non era sufficiente per delucidare il rilascio VWF dovuto alla capacità degli istoni di legare e sequestrare il VWF. La progettazione di un modello di flusso di camera di adesione della piastrina e rilascio di sindrome di Raynaud è stato pertanto necessario più completamente caratterizzare e modellare le interazioni in vivo tra l'endotelio, VWF e piastrine.
Figura 1: ricco di lisina istoni induce il rilascio VWF dalle cellule endoteliali coltivate. BOECs sono stati stimolati con istone non frazionata (UH), frazioni di istone (HR) ricche di arginina e ricco di lisina (HK). HK ha stimolato il rilascio VWF nel terreno di coltura. UH e HR trattamento ha fatto diminuire il rilevamento di FvW: AG nel medium delle cellule endoteliali rispetto al controllo non trattato (Untr). Sono stati effettuati esperimenti individuali di N ≥ 3. I dati sono mostrati come i valori medi ± SE. *P < 0,05, * *P < 0.01, e * * *P < 0,001 indicano il significato riguardante lo stato non trattato. Questa figura è stata modificata da Michels et al15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Associazione di sindrome di Raynaud-istone interferisce con il rilevamento VWF In Vitro. Plasma-derivato VWF si lega più fortemente a HR e UH in modo dose-dipendente rispetto agli istoni di (HK) lisina-ricco in un'analisi obbligatoria di fase solida. I dati sono mostrati come i valori medi ± SE. N≥3 singoli esperimenti sono stati eseguiti. Questa figura è stata modificata da Michels et al15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: istoni mediano VWF-PIASTRINOGENESI String. Cellule endoteliali seminate su camera di flusso diapositive sono stati trattati con istone non frazionata (UH), ricco di lisina (HK), o ricchi di arginina (HR) istone frazioni o istamina/PMA (controlli positivi) e sono stati irrorati a una sollecitazione di taglio di 4,45 dyn/cm2 per 10 min con le piastrine lavate, fluorescente contrassegnate. Immagini rappresentative sono state ottenute delle post-piastrine flusso dal controllo non trattato (A) e le cellule trattate con istamina (B), forbolo miristato 12 13-acetato (PMA) (C), HK (D), HR (E) e UH (F). Trattamento di PMA è provocato da una media di 3,1 stringhe per campo di vista, paragonabile ad istamina. Stringhe di VWF-piastrine sono state quantificate da 10 recensione consecutivi campi e una media per n≥3 singoli esperimenti (G). I dati sono mostrati come i valori medi ± SE. * P < 0.05 e * * P < 0.01 indicare importanza riguardante lo stato non trattato. Questa figura è stata modificata da Michels et al15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementari. Formazione di stringa di VWF-piastrine in risposta a non frazionata dell'istone (2) rispetto a nessun trattamento (1): questo video è stato modificato da Michels et al15. Per favore clicca qui per scaricare questi video.
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Discussion
Mentre la rilevanza fisiologica di VWF-piastrine stringhe rimane discutibile a causa della loro rapida dissoluzione in presenza di VWF-fendendo proteasi ADAMTS13, servono come modello quantificabili in vitro di reclutamento della piastrina di VWF un sito all'indirizzo che potrebbe formare un embolo in presenza di localizzato aumenti nei livelli di istone5. Inoltre, nelle patologie carente ADAMTS13 attività-tale come purpura thrombocytopenic thrombotic (TTP) - o in microambienti infiammatorie - dove attività ADAMTS13 è inibito-VWF-piastrine stringhe possono essere osservate in vivo32 e può contribuire allo stravaso del leucocita e microaggregation delle piastrine, che collega le funzioni emostatici e proinflammatory di VWF33. Infine, è stato supposto quello formazione di stringa VWF-piastrine potrebbe essere un evento d'inizio nella trombosi venosa o arteriosa, formando il nidus attorno al quale è costruito un trombo patologico.
Formazione di stringa di VWF-piastrine nel sistema di alloggiamento di flusso può essere utilizzata per studiare l'esocitosi WPB, ADAMTS13 clivaggio e la capacità delle piastrine di sindrome di Raynaud. Ci sono diversi passaggi critici per l'esecuzione con successo di questi esperimenti. Tuttavia, a seconda dell'applicazione del modello, le modifiche possono essere apportate al protocollo.
Le cellule endoteliali da specifici letti vascolari sono eterogenee nella loro risposta a segnali meccanici e biochimici34. Pertanto può essere utile selezionare un tipo di cellula adatto per l'applicazione di questa metodologia. BOECs sono stati utilizzati nello studio corrente a causa della loro potenziale proliferativo; mantenimento del fenotipo attraverso parecchi (10 +) passaggi; e robusta espressione di sindrome di Raynaud, facilitando la quantificazione dell'esocitosi VWF. Altri ricercatori hanno utilizzato ombelicale umano cellule endoteliali di vena (HUVECs)5,8,28 e non endoteliali cellule (cellule embrionali umane del rene 293) trasfettate con il cDNA di sindrome di Raynaud che esprimono mutazioni VWD35 . È stato dimostrato che l'espressione di VWF varia significativamente tra tessuto e nave fisiologia36. Cellule endoteliali in coltura derivanti da vari micro - e macrovasculature hanno differenze osservabili nella sindrome di Raynaud proteina secrezione basale37, e c'è prova che il calcio canale differenze tra sottotipi delle cellule endoteliali influenzano WPB esocitosi in risposta a secretagogues38.
Gli istoni sono stati utilizzati in questo studio come un secretagogo romanzo. Essi sono stati confrontati con il controllo positivo, istamina, spesso descritto stimolante fisiologico del rilascio VWF. Un ELISA di FvW: AG è stata utilizzata per verificare il rilascio VWF dalle cellule endoteliali in condizioni statiche. Ci sono due meccanismi intracellulari che innescano il rilascio di VWF: l'elevazione del calcio intracellulare39 o pf AMP ciclico livelli40. Attivazione differenziale di queste vie può essere indotta da secretagoghi quali trombina/istamina o epinefrina/vasopressina (o, pertinenti al VWD, desmopressina), rispettivamente, e può essere interessante confrontare queste due vie utilizzando questa camera di flusso modello di formazione stringa VWF-piastrine. Nel contesto della malattia thrombo-infiammatoria, ulteriore delucidazione dei biomarcatori infiammatori, quali citochine41 o pattern molecolari associati danni / (DAMPS/PAMPS) e il loro ruolo nella formazione di VWF-piastrine stringa è incoraggiata.
Sollecitazione di taglio fluido è importante quando globulare VWF si dispiega per esporre il sito di legame del dominio di A1 per la glicoproteina Ib su piastrine11. È stato dimostrato che una minima sollecitazione di taglio fluida di circa 0.73 dyn/cm2 è necessaria per il legame della piastrina VWF stringhe42. Inoltre, questi formano stringhe sulle cellule endoteliali a relativamente basse sollecitazioni di taglio (2,5 dyn/cm2) ma può essere sloggiato alle sollecitazioni di taglio di 20 dyn/cm2 o superiore a8. Nella ricerca attuale, abbiamo selezionato una sollecitazione di taglio venosa (4.45 dyn/cm2) che ha permesso per le interazioni tra l'endotelio, VWF e piastrine conservando il buffer di perfusione per un esperimento di 10 min.
Utilizzando questo sistema di alloggiamento di flusso per valutare ADAMTS13 clivaggio di stringhe di VWF-piastrine richiede un aumento nel fluidiche sollecitazioni di taglio rispetto a quelli utilizzati in questo esperimento. Maximal ADAMTS13 clivaggio di stringhe di VWF-piastrine si verifica tra 10 e 30 dyn/cm212, una gamma che comprende alta venoso a sollecitazione di taglio arteriosa moderata43. Modificare la velocità di taglio in questo sistema può essere utile per confrontare il VWF-piastrine stringa formazione e la dissoluzione, fattori nello sviluppo della trombosi venosa, arteriosa o microvascolare.
Ulteriori modifiche di questa tecnica possono essere fatto per il materiale di aspersione e l'alloggiamento di flusso. Secretagoghi possono essere somministrati in condizioni di flusso per assomigliare ad ambienti in vivo . Piastrine di adescamento con agonisti per valutare la loro reattività o tra cui popolazioni leucocitarie sono le estensioni di questa tecnica. Inoltre, tra cui agenti terapeutici targeting lunghezza multimerica VWF, capacità legante della piastrina o reattività piastrinica può delucidare importanti meccanismi che regolano l'inizio dello sviluppo di trombi. Altri ricercatori hanno utilizzato sia in-House44 o acquistato vetrino coprioggetti chambers flusso45, in contrasto con le diapositive a base di polimeri utilizzati in questo studio e sembrano ottenere risultati comparabili.
Una considerazione critica nel protocollo stringa VWF-piastrine è la preparazione delle piastrine lavate. Non è consigliabile utilizzare sangue intero in questo protocollo per la presenza di ADAMTS13. Agenti impedendo l'attivazione della piastrina, come prostaciclina o apyrase, dovrebbero essere evitati, come questo può influenzare più tardi avversamente l'adesione della piastrina di VWF. Garantendo che i buffer sono portati a temperatura ambiente prima dell'isolamento della piastrina e utilizzando tecniche di pipetta attento (cioè, evitando bolle e dure sollecitazioni di taglio) sono fondamentali per mantenere le piastrine in loro stato inattivo. Inoltre, l'etichettatura piastrine con una macchia mitocondriale, ad esempio DIOC6 o rodamina 6g, è preferibile rispetto interferire con domini extracellulari che possono essere importanti per l'associazione di sindrome di Raynaud. Tuttavia, come DIOC6 è una tintura membrana permeabile, esso può anche essere preso in piccole quantità dalle cellule endoteliali nel corso dell'esperimento. In assenza di un microscopio a fluorescenza, altri studi hanno osservato stringhe di VWF-piastrine mediante microscopia in campo chiaro46.
In conclusione, questa metodologia di camera di flusso PIASTRINOGENESI VWF-stringa. può fornire dati meccanicistici, in tempo reale per supportare in vivo osservazioni nella patogenesi della trombosi. Come esposizione di taglio fortemente influenza il ruolo fisiopatologico che VWF svolge nella malattia thrombo-infiammatoria, il modello di camera di flusso è uno strumento investigativo vitale per qualsiasi laboratorio interessato a comprendere le interazioni delle cellule endoteliali-piastrina in questo contesto.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Alison Michels è un destinatario di un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Laura L. Swystun è il destinatario di una borsa di studio CIHR. David Lillicrap è il destinatario di un Canada Research Chair in Hemostasis molecolare. Questo studio è stato finanziato in parte da un CIHR sovvenzione (MOP-97849) di funzionamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
References
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