Summary
En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.
Abstract
Factor de von Willebrand (VWF) es un factor de coagulación de glicoproteína multimérica que media la adherencia plaquetaria y agregación en los sitios de daño endotelial y que lleva factor VIII en la circulación. FvW es sintetizado por las células endoteliales y constitutivamente o se libera en el plasma o se almacena en organelos especializados, llamados cuerpos de Weibel-Palade (WPBs), para el lanzamiento de la demanda en respuesta al reto hemostático. Estímulos procoagulantes y proinflamatorias rápidamente pueden inducir exocitosis WPB y liberación de FvW. La mayoría de los liberados por las células endoteliales de FvW circula en el plasma; sin embargo, una proporción de VWF está anclada a la superficie de la célula endotelial. Bajo condiciones de corte fisiológico, FvW endotelial anclado puede enlazar a las plaquetas, formando una cadena de FvW plaquetario que puede representar el nido de formación de trombos. Un sistema de cámaras de flujo puede utilizarse para observar visualmente la liberación de FvW de las células endoteliales y las plaquetas subsecuente captura de manera reproducible y relevante en la fisiopatología de la formación del trombo mediada por el VWF. Utilizando esta metodología, las células endoteliales son cultivadas en una cámara de flujo y posteriormente estimuladas con secretagogos para inducir la exocitosis WPB. Plaquetas lavadas son perfundidas entonces sobre el endotelio activado. Las plaquetas se activan y posteriormente se unen a secuencias VWF alargadas en la dirección del flujo de fluidos. Utilizando las histonas extracelulares como un estímulo procoagulantes y proinflamatorias, se observó formación de cadena creciente del VWF-plaqueta en las células endoteliales tratadas con histonas en comparación con las células endoteliales no tratadas. Este protocolo describe una evaluación cuantitativa, visual y en tiempo real de la activación de las interacciones de VWF-plaqueta en modelos de trombosis y hemostasia.
Introduction
La trombosis es la principal causa de mortalidad en todo el mundo1 y puede convertirse en respuesta todysregulated plaqueta activación trombina generación y en ambas arterias veinsand. Niveles del plasma del VWF están un regulador clave de la coagulación sanguínea, por el que baja los niveles (< 50%) como resultado del desorden de la sangría conocido como von Willebrand (VWD) la enfermedad2 y altos niveles (> 150%) están asociados con un mayor riesgo de venosa3 y trombosis arterial4 .
FvW es una glicoproteína multimérica sintetizada por células endoteliales y megacariocitos y almacenado en α-gránulos de la plaqueta y WPBs, respectivamente. Sobre desafío hemostático, VWF puede liberarse de WPBs endoteliales para atar las plaquetas circulantes a las células endoteliales activadas5 o colágeno expuesto en la pared de vaso6. Anclaje del VWF a las células endoteliales se ha demostrado para ser mediado por P-selectin7 y la integrina αvβ38. El lanzamiento subsecuente de tiendas de α-gránulos de plaquetas puede aumentar concentraciones localizadas de VWF para estabilizar la interacción de plaquetas-plaquetas para la formación de tapón de plaquetas, el andamio necesario para la propagación de fibrina y la cascada de coagulación deposición. La actividad de unión a plaquetas de VWF está regulada por su estructura multimérica, con Multímeros de peso molecular alto que poseen mayor actividad hemostática9,10. En circulación, VWF también actúa como un portador para el factor VIII de coagulación.
Líquido tensión de esquileo es un regulador esencial de la fisiología VWF. En la ausencia de tensión de esquileo, VWF existe en una forma globular, encubrimiento de dominios de unión de la glicoproteína plaquetaria Ib adhesión11. Cuando existe tensión de esquileo, el sitio de la hendidura para una metaloproteinasa, una conclusión y metalloprotease con motivo del thrombospondin (ADAMTS13), se expone. ADAMTS13 hiende desnudas y plaquetas decoradas VWF cadenas de regular tamaño de multimer, reduciendo su actividad hemostática12.
VWF es una proteína de fase aguda, y numerosos estímulos, incluyendo hipoxia13, infección14y citoquinas proinflamatorias, se ha demostrado para mediar la liberación de FvW de las células endoteliales. Similar a otros agentes inflamatorios, las histonas extracelulares también han demostrado para inducir la liberación de FvW sistémica en ratones15,16 y la activación de las plaquetas en vitro17,18, 19. esto fue demostrado para ser dependiente sobre el subtipo de histonas, como diferencias en lisina y contenido de arginina puede influir en la función15. Nuestro estudio pretende establecer una cámara de flujo modelo para investigar la influencia de los ricos en lisina (HK) y captura de ricos en arginina (HR) los subtipos histona y secretagogos en la liberación de FvW endotelial y plaquetaria en tiempo real, posibles acontecimientos tempranos en trombosis inducida por inflamación.
Esta metodología de la cámara de flujo recapitula en vivo las interacciones entre el colágeno subendotelial, células endoteliales, FvW y plaquetas en un sistema en vitro que es cuantificables, reproducibles y visual. Permite la evaluación en tiempo real de todos los aspectos de la vía que regula la interacción VWF-plaqueta, incluyendo secreción de WPB, activación plaquetaria y proteólisis VWF. Estudios de VWF bajo condiciones de estrés de cizallamiento controlados se han utilizado para evaluar mutaciones de VWD que afectar la liberación de FvW y Unión a plaquetas función20, WPB fisiología21y escote VWF por ADAMTS135. Utilizamos esta metodología para cuantificar la formación de cadena de FvW plaquetas como consecuencia de un estímulo inflamatorio: las histonas extracelulares.
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Protocol
Estos estudios fueron aprobados por la Universidad de Canadá de la investigación ética Junta de Reina.
1. endotelial celular estimulación
-
Capa de colágeno una placa de cultivo de tejidos bien 6.
- 24 horas por adelantado, una placa de cultivo de tejidos bien 6 a 37 ° C con 1 mL de colágeno de capa del almacenador intermediario (50 μg/mL rata cola colágeno tipo 1 con 0.02 M de ácido acético glacial).
- Lavar los pozos dos veces con 2 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS).
Nota: Las placas pueden ser envuelto en papel de aluminio y almacenadas en una bolsa hermética de plástico a 4 ° C.
- Semilla de las células endoteliales con una densidad de 1 x 106 células por pocillo en 2 mL de crecimiento medio con 10% suero bovino fetal (FBS). Incube las células durante 24 h a 37 ° C (5% CO2).
Nota: Aquí, se utilizaron sangre consecuencia las células endoteliales (BOECs) entre 5 y 15 pasos. BOECs fueron aisladas de voluntarios sanos con una secuencia VWF wildtype usando un método de referencia en Starke et al. 22 de una manera similar a la descrita por Zeus23. - Retire el medio después de 24 h y lavan las células con HBSS.
- Añadir 1 mL de medio sin suero (medio de cultivo esencial mínimo sin SFB) con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; 100 nM), histonas no fraccionada (UH) y Hong Kong o HR (todos en 25 μg/mL) a las células por 2 h a 37 ° C (5% CO2).
Nota: Esta concentración de la histona se basó en anteriores informes en vitro la citotoxicidad por Xu et al. 24 y Abrams et al. 25 que 50 μg/mL. - Recoger el medio después de 2 h y almacenar a-20 ° C hasta su análisis.
2. VWF cuantificación de enzima-ligó análisis del inmunosorbente (ELISA)
- Capa de una microplaca con 100 μl de la capa buffer (10 mM dibásico fosfato de sodio y 145 mM cloruro de sodio, pH 7,2) que contiene 10 μg/mL policlonal anticuerpo anti-VWF durante la noche a 4 ° C.
- Lave la placa tres veces con 250 μl de tampón de lavado (fosfato dibásico de sodio 10 mM, 500 mM cloruro sódico y 0,1% Tween 20, pH 7,2).
- Diluir las muestras medianas 1:2 y 1:4 con solución de lavado y utilizar el plasma normal de referencia para una curva estándar, empezando en un 1:10 dilución.
- Placa de 100 μl de muestras diluidas y normas durante la noche a 4 ° C.
- Lave la placa tres veces con 250 μl de tampón de lavado.
- Añadir 100 μl de anti-VWF diluido, anticuerpo de detección conjugado con HRP (1,1 μg/μl de tampón de lavado) en la placa e incubar 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la placa e incubar durante 10 minutos con el reactivo de O-fenilendiamina dihidrocloruro (OPD), según las instrucciones del fabricante.
- Detener la reacción con 100 μl de 1 M H2hasta4 y leer la placa a 492 nm.
3. fase sólida histona-VWF obligatorio análisis
- Capa de una microplaca con histonas, diluidas en 0,5% sodio desoxicolato 50 mM carbonato tampón (pH 9.6 a 10 μg/mL durante la noche a 4 ° C.)
- Lave la placa tres veces con 250 μl de PBS suplementado con 0,1% Tween 20, incubando durante 10 min entre lavados.
- Bloque de la placa con 200 μL de PBS suplementado con 0,1% Tween 20 y 1% albúmina de suero bovino (BSA) por 1 h a temperatura ambiente.
- Repita el paso 3.2.
- Diluir en serie derivados de plasma VWF/factor humano VIII complejo de 200 mU/mL a 25 mU/mL en tampón salino (cloruro de sodio de 500 mM de 10 mM fosfato sódico dibásico, y 0,1% Tween 20, pH 7,2). Adicionar 100 μl a la placa por 2 h a temperatura ambiente.
- Repita el paso 3.2.
- Detectar el atascamiento del VWF a las histonas inmovilizados con 100 μl de una solución que contiene PBS-0.1% Tween 20 y 1:1,000 conejo policlonales anti-VWF anticuerpo conjugado con HRP por 1 h a temperatura ambiente.
- Repita el paso 3.2.
- Incubar la placa por 30 min con 100 μl de reactivo OPD y detener así la reacción con 100 μl de 1 M H24. Medir la densidad óptica a 492 nm.
4. siembra de células endoteliales en cámaras de flujo
- Coloque 0,5 mL de tampón de recubrimiento de colágeno (descrito en el paso 2.1) en una jeringa de 1 mL Luer-lock.
- Gire el extremo de la jeringa de Luer-lock en el depósito de una diapositiva de la cámara de flujo.
- Presione el émbolo lentamente hasta que está cubierto el carril entero y cada depósito está lleno. Repita para cada carril e incubar la cámara a 37 ° C durante 24 h.
- Aspire el búfer de la capa de colágeno con una pipeta de 200 μL. Carga otra jeringa con 1 mL HBSS y presionar el émbolo lentamente para lavar cada carril de la cámara de flujo. Aspire el lavado con pipeta 200 μL en el extremo opuesto de la cámara de flujo. Repetir dos veces.
- Pipeta aproximadamente 100 μl de una solución de células endoteliales (BOEC) 3 x 106 células/mL en un medio con 10% FBS en el carril de una cámara de flujo.
Nota: La densidad de siembra de células endoteliales excede la capacidad de la cámara. Esto es para asegurar una cobertura máxima del canal; las células no adherentes se retiran en la etapa de lavado posterior. - Incubar la cámara a 37 ° C durante 24 h. cambio el medio cada 8-12 h utilizando jeringas Luer-lock (como en el paso 4.4). Asegúrese de que hay no hay burbujas visibles en los carriles.
5. aislando las plaquetas de sangre humana
- En un gabinete con una aguja de 30 G de seguridad biológica, añadir 300 μL de tampón de ácido citrato dextrosa (citrato trisódico 85 mM, 111 mM D-glucosa y ácido cítrico de 71 mM, pH 4.5) a un vacutainer de colección de sangre sin aditivos 3 mL.
- Recoger sangre de voluntarios sanos (libres de medicamentos antiplaquetarios y no esteroideos durante siete días) por venopunción (tres tubos de 3 mL cada uno), siguiendo un protocolo similar a la publicada por Bernardo et al26.
- Deseche el primer tubo, ya que el daño del tejido inicial asociado a la venopunción puede causar activación plaquetaria espontánea.
- Invertir suavemente los vacutainers tres veces para mezclar la sangre con anticoagulante.
- Centrifugue los vacutainers a 150 x g durante 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
- Lentamente retire el plasma rico en plaquetas (sobrenadante) con una pipeta en un gabinete de seguridad biológica y cuidadosamente transferirlo a un tubo cónico de 15 mL. Transferir el volumen rico en plaquetas de cada vacutainer a un tubo cónico único para evitar la potencial activación de Cruz.
Nota: Aislamiento de plaquetas debe realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación bacteriana, potencial artificial plaquetas y activación endotelial de seguridad biológica. - Centrifugar los tubos cónicos a 900 x g por 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente) para que sedimenten las plaquetas.
- Pipeta y descarte el sobrenadante pobre en plaquetas.
- Lavar el pellet con 1 mL de tampón de citrato glucosa de sodio (CGS) (citrato de sodio 13 mM, 30 mM D-glucosa y cloruro de sodio de 120 mM, pH 7.0).
Nota: Las plaquetas aparecen en formaciones semejantes a wisp cuando se añade el buffer CGS y el pellet se resuspendió suavemente. En muestras contaminadas por activación de las plaquetas, las plaquetas no se suspender fácilmente y aparecerán clumpy. - Una vez completamente suspendidas, centrifugar las muestras a 900 x g por 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
- Extraiga el tampón de lavado CGS y resuspender el precipitado en 3 mL de solución de Tyrode (cloruro de sodio de 138 mM, 5.5 mM D-glucosa, bicarbonato de sodio de 12 mM, cloruro de potasio de 2,9 mM y 0,36 mM fosfato de sodio dibásico, pH 7.4). Asegurar la completa resuspensión de las plaquetas y, si se observan agregaciones, deseche la muestra.
- Añadir 1,5 μl de una solución madre DiOC6 (disolver 57,25 mg en 5 mL de metanol) de 20 mM a cada tubo cónico de 3 mL de plaquetas lavadas para una concentración final de 1 μm.
Nota: DIOC6 es un tinte mitocondrial fluorescente verde utilizado en este experimento a las plaquetas de la etiqueta. - Alícuota 1 mL de la solución de lavado de plaquetas a los tres tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
Nota: El volumen de plaquetas para este experimento se calcula basándose en el tamaño de la cámara de flujo, la tensión de esquileo deseada y la longitud del experimento (paso 6.5). Este protocolo puede ajustarse cuando cambian las condiciones para asegurar que haya suficiente volumen de flujo de fluidos. - Utilizar las plaquetas lavadas dentro de 2 h de aislamiento.
6. flujo aparato Asamblea
- Coloque una pieza de 70 cm de silicona estéril de la tubería (diámetro interior de 1,6 mm) a un conector de Luer macho codo en un extremo y un adaptador de cerradura de Luer hembra en el otro.
- Conecte el adaptador de cerradura de Luer hembra conectado a la tubería a una jeringa de 20 mL.
- Repita los pasos del 6.1 y 6.2 dos veces para generar tres idénticas conexiones de tubo de la jeringa.
-
Utilizar una bomba de jeringa para generar flujo de fluidos. De entrada los siguientes ajustes a la bomba de jeringa: diámetro interior de la tasa de flujo y jeringa.
Nota: Una jeringa de 20 mL tiene un diámetro interior de 19,55 mm. El caudal se calcula basándose en la deseada tasa/corte y las dimensiones de la cámara de flujo. La cámara de flujo utilizada en el estudio actual, para lograr 1 dyn/cm2 (venosa baja observada en corte), se requiere un caudal de 9,37 μl/min. Debido a pruebas que vinculen a las histonas a la trombosis venosa, se selecciona un esquileo venoso moderado de 4.45 dyn/cm2 . Esto también se basa en el supuesto de que el buffer tiene una viscosidad similar al agua. El caudal es entonces igual a 41,7 ecuaciones μl/min permite calcular que el caudal para varias dimensiones de cámara de flujo se puede encontrar en:- Ajustar la bomba para retirar el líquido utilizando la opción de botón de la bomba de jeringa.
- Carga las tres jeringas conexión a la tubería de la bomba de jeringa y sujete firmemente los soportes alrededor de las jeringas y émbolos.
- Conecte un codo macho Luer a ambos extremos de una segunda pieza de 20 cm de tubo de silicona estéril.
- Conecte un codo de Luer a una aguja de calibre 18 blunted.
- Repetir dos veces, creando tres sistemas de consumo idéntico para los tres carriles de la cámara de flujo.
Nota: El tubo de silicona y Luer se puede lavar con lejía 10% seguido de agua destilada antes de reutilizarlos. No se recomienda reutilizar las cámaras de flujo.
7. microscopio ajustes
- Usar un microscopio de disco giratorio equipado con una etapa totalmente automatizada. Realizar la iluminación con un lanzamiento de láser que ofrece 405 458, 491, 543 y líneas de láser de 633 nm. Captura todas las imágenes con el objetivo 20 X. Ajustar todos los parámetros con el software de análisis (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
- Seleccione los ajustes del canal (filtro de emisión: 520/35), con excitación a 491 nm, para la adquisición. Fijar el electrón multiplicando el dispositivo de carga acoplada a una ganancia de electrones multiplicando de 150, con un tiempo de exposición de 200 ms, para obtener el rango de datos dinámico completo.
Nota: Las plaquetas están etiquetadas con un colorante fluorescente verde, DiOC6, con máximos de longitud de onda (excitación, 482 nm, emisión, 504 nm). - Ajustar la potencia del láser nm 491 al 20%.
- El centro de todos los tres carriles y seleccione 1 μm para la gama z y 0.5 μm de tamaño de paso. Seleccione el número de puntos de tiempo (es decir, duración) y el tiempo entre imágenes (es decir, intervalo) para capturar una imagen cada 10 s; Seleccione "60 puntos de tiempo" por diapositiva. Ajuste del microscopio para capturar imágenes de los tres carriles y guardarlos en una carpeta designada experimento.
Nota: Debido a que la cámara de flujo tiene tres carriles, el microscopio necesitará alternar entre tres posiciones para capturar las imágenes.
8. VWF-plaqueta cadena formación
- Retire el medio de cultivo de la cámara de flujo (del paso 4) utilizando la misma técnica como en el paso 4.4.
- Añada 100 μl de cada histamina (25 μm), PMA (100 nM), UH, Hong Kong o HR (todos en 25 μg/mL) diluido en medio libre de suero (como en el paso 1.4) para estimular la monocapa BOEC durante 15 min a temperatura ambiente y ambiente O2/CO2.
Nota: Aunque no es necesario para la liberación de FvW, realizar esta estimulación a 37 ° C mejorará la VWF exocitosis27. - Asegúrese de que uno de los tres carriles separados de la cámara de flujo siguen siendo no tratados como control experimental.
- Retire el medio utilizando una jeringa de 1 mL y reemplazarlo con 100-200 μL de PBS para lavar los secretagogos de la monocapa endotelial.
- Monte la cámara de flujo en un stand portaobjetos usando clips vasculares para asegurar la cámara en el lugar.
- Fije el disponible conector Luer macho en el extremo de la tubería de 70 cm (conectado a la jeringa) para el depósito de la cámara de flujo. Repita para los dos otros flujo cámara carriles.
- Arrancar la bomba de jeringa para eliminar el lavado de PBS. Pipeta PBS adicionales al depósito de cámara de flujo opuesto para asegurar que los carriles no funcione en secos.
- Observar el sistema de flujo para el flujo equivalente a través de todos los tres carriles y luego detener la bomba de jeringa.
- Seleccione un área para capturar las imágenes en la mitad de cada carril, en áspero la misma área entre experimentos.
Nota: La persona que utilice el microscopio puede ser ciego a las condiciones experimentales. Este paso asegura que el microscopio está enfocado antes de flujo plaquetas (consulte el paso 7). - Conectar un acoplador de hembra luer a una jeringa de 5 mL y luego al conector luer macho libre (paso 6.8) y sumergir la aguja blunted en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene la solución de plaquetas lavadas (paso 5.13). Sacar lentamente la solución de plaquetas a través de la tubería para no asegurar burbujas de aire dentro del sistema.
- Retire la jeringa de 5 mL y conectar el Luer masculino al depósito abierto de la cámara de flujo. Repita para los tres carriles.
- Reiniciar la bomba de la jeringuilla y capturar imágenes durante el flujo de plaquetas utilizando la configuración de microscopio y protocolo del paso 7 para 10 min en la oscuridad.
- Después de 10 minutos, desconectar el Luer del tubo de aspiración en el depósito de la cámara de flujo y llene el depósito con PBS para mantener el flujo sobre la monocapa endotelial.
9. VWF-plaqueta cadena cuantificación
Nota: El flujo continuo de PBS es necesaria para mantener la elongación de la cadena de VWF-plaqueta para análisis de imagen. Cese de flujo resultará en el VWF ser globulares y afectará cuantificación de cadena de VWF-plaqueta. Es esencial para recargar en cada depósito con PBS durante la captura de la imagen. HBSS puede reemplazar PBS si se observa contracción de la célula o desprendimiento durante este paso.
- Empezando por el primer carril, captura 10 imágenes por diapositiva sin superposición con un objetivo X 20 alrededor de mitad de la diapositiva. Repita esto para cada carril.
Nota: Las áreas que rodean los embalses deben evitarse debido a la turbulenta. - Utilizando software de procesamiento de imagen, ajustar el brillo haciendo clic en "Imagen", "Ajuste" y "Luminosidad." Arrastre la barra de desplazamiento hasta que las plaquetas adheridas se pueden ver lo suficientemente bien como para la cuantificación.
- Grabar una cadena de FvW plaquetario cuando tres o más alineadas plaquetas se observan en la imagen. Contar todas las cadenas de VWF-plaqueta en una imagen. Repita para todas las 10 imágenes y media para el experimento.
Nota: La persona que realiza la cuantificación puede ser ciego a las condiciones experimentales. No es necesario Co mancha para VWF, como esto ha sido confirmado por estudios independientes8,28,29. - Repetir el experimento un mínimo de tres veces para evaluar cada secretagogo.
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Representative Results
Evaluar directamente el efecto de las histonas en la liberación de FvW de las células endoteliales, que expuestos BOECs confluentes y medio libre de suero que contienen PMA (control positivo), UH, HR, HK por 2 h. Hemos mostrado que HK indujo un aumento de 2 dobleces en proteína VWF (VWF:Ag) en el medio de las células endoteliales tratadas (figura 1). Curiosamente, cuando BOECs fueron estimuladas con UH y HR, hay menos VWF:Ag se detectó en el medio que en la condición sin tratamiento. Presumimos que debido a las histonas pueden enlazar directamente a VWF30, diferencialmente puede interferir con la detección de VWF:Ag en el medio de cultivo. Para evaluar la Unión de las histonas a VWF, se utilizó un ensayo de fase sólida encuadernación. Nos demostró que UH y HR más fuertemente limitado al VWF que HK (figura 2), apoyo a la interferencia de detección demostraron en la figura 1.
Las histonas extracelulares se han demostrado para activar las plaquetas en vitro19, y nuestros datos sugieren que las histonas median en liberación de FvW de las células endoteliales. Para caracterizar el efecto de las histonas en las interacciones de VWF-plaqueta, se utilizó un modelo de cámara de flujo de la formación de la cadena de VWF-plaqueta que fueron perfundidas con plaquetas en las células endoteliales estimuladas. Imágenes representativas fueron capturado poste-fluye, y se cuantificó el número de cuerdas de FvW plaquetario.
Observamos que, tras la apertura de las condiciones de flujo, las células no tratadas tenían muy pocas cadenas de FvW plaquetario (< 1 cadena por revisión de campo), mientras que la histamina y células tratadas con PMA tenían un promedio de 2.10 y 3.10 cuerdas, respectivamente. Significativamente más cuerdas de FvW plaquetario se formaron cuando las células fueron tratadas con HK (3,52 cuerdas, P = 0.019), HR (6,00 cuerdas, P = 0.004) y UH (5,51 cuerdas, P = 0.012). Una representación gráfica de la cuenta de plaqueta de VWF cadena se muestra en la figura 3. Formación de cadena de FvW plaquetario en tiempo real en respuesta a UH en comparación con las células no tratadas se muestra en Videos 1A y B.
Estos estudios, junto con las investigaciones realizadas por otros grupos, muestran que las histonas28 y otros agentes proinflamatorios como histamina5 y citoquinas31 estimulan la secreción de FvW de las células endoteliales, mediando plaquetaria posterior capturar in vitro. Hemos demostrado que la estimulación estática de las células endoteliales no fue suficiente para aclarar la versión VWF debido a la capacidad de las histonas para atar y retener VWF. El diseño de un modelo de la cámara de flujo de VWF liberación y plaqueta adherencia por lo tanto, era necesaria más completamente caracterizar y modelar las interacciones en vivo entre el endotelio, FvW y plaquetas.
Figura 1: las histonas ricas en lisina induce liberación de FvW de las células endoteliales cultivadas. BOECs fueron estimuladas con histonas no fraccionada (UH), rica en lisina (HK) y fracciones de las histonas ricas en arginina (HR). HK estimula liberación de FvW en el medio de cultivo. UH y HR tratamiento disminuyeron la detección de VWF:Ag en el medio de la célula endotelial con respecto al tratamiento control (Untr). Se realizaron experimentos individuales de N ≥ 3. Los datos se muestran como los valores promedio ± SE. *P < 0.05, **P < 0.01, y ***P < 0.001 indican la importancia en relación con la condición sin tratamiento. Esta figura ha sido modificada de Michels et al15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Atascamiento del VWF-histona interfiere con VWF detección In Vitro. Derivado del plasma VWF se une más fuertemente al HR y UH de manera dosis dependiente comparada con histonas de ricos en lisina (HK) en un ensayo de fase sólida encuadernación. Los datos se muestran como los valores promedio ± SE. N≥3 se realizaron experimentos individuales. Esta figura ha sido modificada de Michels et al15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: las histonas median VWF-plaqueta cadena formación. Las células endoteliales sembradas en cámara de flujo diapositivas fueron tratadas con histonas no fraccionada (UH), rica en lisina (HK), o ricos en arginina (HR) histona fracciones o histamina/PMA (controles positivos) y se perfunde en una tensión de esquileo de 4.45 dyn/cm2 durante 10 min. con las plaquetas lavadas, fluorescencia marcadas. Imágenes representativas se obtuvieron flujo posterior de la plaqueta del control sin tratar (A) y las células tratadas con histamina (B), forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (C), HK (D), HR (E) y UH (F). PMA tratamiento dio lugar a un promedio de 3,1 cadenas por campo de visión, similar a la histamina. VWF-plaqueta las cuerdas fueron cuantificadas de 10 campos de informe consecutivo y promediadas para n≥3 experimentos individuales (G). Los datos se muestran como los valores promedio ± SE. * P < 0.05 y ** P < 0.01 indican significación en relación con la condición sin tratamiento. Esta figura ha sido modificada de Michels et al15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Videos adicionales de . Formación de cadena de VWF-plaqueta en respuesta a la histona no fraccionada (2) en comparación con ningún tratamiento (1): este video ha sido modificado de Michels et al15. Haga clic aquí para descargar estos videos.
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Discussion
Mientras que la relevancia fisiológica de VWF-plaqueta cadenas sigue siendo polémico debido a su rápida disolución en presencia de la proteasa hiende VWF ADAMTS13, sirven como un modelo cuantificable en vitro de reclutamiento de plaquetas por VWF a un sitio en que puede formar un trombo en la presencia de localizada aumento de histona niveles5. Por otra parte, en patologías falta ADAMTS13 actividad, tales como púrpura thrombocytopenic trombótica (TTP) - o en microambientes inflamatorios - donde la actividad de ADAMTS13 es inhibido-VWF-plaqueta cuerdas pueden observarse en vivo32 y puede contribuir a la extravasación diphosphate y leucocitos plaquetas, a las funciones hemostáticas y proinflamatorias de VWF33. Por último, se ha presumido que VWF-plaqueta cadena la formación puede ser un acontecimiento de iniciación en la trombosis venosa o arterial, formando el nido alrededor de la cual se construye un trombo patológico.
Formación de cadena de FvW plaquetas en el sistema de cámara de flujo puede utilizarse para estudiar la exocitosis WPB, ADAMTS13 escote y la capacidad de unión de la plaqueta del VWF. Hay varios pasos fundamentales a la ejecución con éxito de estos experimentos. Sin embargo, dependiendo de la aplicación del modelo, pueden hacerse modificaciones al Protocolo.
Las células endoteliales de las camas vasculares específicos son heterogéneas en su respuesta a las señales mecánicas y bioquímicas34. Por lo tanto puede ser útil seleccionar un tipo de célula adecuado para la aplicación de esta metodología. BOECs fueron utilizados en el presente estudio debido a su potencial proliferativo; mantenimiento del fenotipo a través de varios pasajes de (10 +); y expresión de VWF robusto, facilitando la cuantificación de la exocitosis VWF. Otros investigadores han utilizado umbilical humano (HUVECs)5,8,28 de las células endoteliales de la vena y no endoteliales (células de riñón embrionario humano 293) transfected con cDNAs VWF que expresan mutaciones de VWD35 . Se ha demostrado que la expresión de VWF varía considerablemente entre el tejido y los vasos fisiología36. Las células endoteliales cultivadas derivadas de diversos micro - y macrovasculature tienen diferencias observables en el VWF proteína secreción basal37, y hay evidencia de que las diferencias de canal de calcio entre subtipos de células endoteliales influyen en WPB exocitosis en respuesta a secretagogos38.
Las histonas se utilizaron en este estudio como un secretagogo de la novela. Ellos fueron comparados con el control positivo de histamina, descrito con frecuencia estimulante fisiológico de la liberación de FvW. Un ELISA de VWF:Ag se utilizó para verificar la liberación de FvW de las células endoteliales en condiciones estáticas. Hay dos mecanismos intracelulares que desencadenan la liberación de FvW: la elevación del calcio intracelular39 o pf AMP cíclico niveles40. Activación diferencial de estas vías puede ser inducida por secretagogos como la trombina/histamina o epinefrina/vasopresina (o relevantes para VWD, desmopresina), respectivamente, y puede ser interesante comparar estas dos vías utilizando esta cámara de flujo modelo de formación de cadena de FvW plaquetario. En el contexto de enfermedad thrombo-inflamatoria, más aclaración de marcadores inflamatorios, como citoquinas41 o patrones moleculares asociado a patógenos/daño (humedades/PAMPS) y su papel en la formación de la cadena de FvW plaquetario se anima.
Tensión de esquileo líquido es importante cuando globular VWF se despliega para exponer el sitio de unión del dominio A1 para la glicoproteína Ib en plaquetas11. Se ha demostrado que una mínima tensión de esquileo líquida de aproximadamente 0.73 dyn/cm2 se requiere para el atascamiento de la plaqueta a VWF cadenas42. Además, éstos forman cadenas de células endoteliales en relativamente bajo tensiones de esquileo (2,5 dyn/cm2) pero puede ser desalojada en tensiones de esquileo de 20 dyn/cm2 o por encima de8. En la presente investigación, se seleccionaron una venoso tensión de esquileo (4.45 dyn/cm2) que permitió las interacciones entre el endotelio, FvW y plaquetas conservando el búfer de perfusión para un experimento de 10 minutos.
Con este sistema de cámara de flujo para evaluar la ADAMTS13 escote de cadenas de FvW plaquetas requiere un aumento en las tensiones de esquileo fluídicas sobre los que se utilizan en este experimento. Escote de ADAMTS13 máxima de cadenas de FvW plaquetario se produce entre 10 y 30 dyn/cm212, una gama que abarca alta venosa a moderada tensión de esquileo arterial43. Modificación de la tarifa del esquileo en este sistema puede ser útil para comparar VWF-plaqueta cadena formación y disolución, que contribuyen en el desarrollo de trombosis venosa, arterial o microvascular.
Modificaciones de esta técnica es posible para el material de perfusión y la cámara de flujo. Secretagogos pueden administrarse bajo condiciones de flujo que se asemejan a entornos de en vivo . Cebado de las plaquetas con agonistas para evaluar su reactividad o incluso poblaciones leucocitarias son extensiones de esta técnica. Además, como agentes terapéuticos dirigidos a VWF multimer longitud, capacidad de fijación de plaqueta o reactividad plaquetaria puede dilucidar mecanismos importantes que regulan la iniciación del desarrollo del trombo. Otros investigadores han utilizado sea interno44 o comprado vidrio cubreobjetos cámaras de flujo45, en comparación con los portaobjetos con polímeros utilizados en este estudio y parecen obtener resultados comparables.
Una consideración crítica en el protocolo de cadena de FvW plaquetario es la preparación de plaquetas lavadas. Se recomienda no utilizar sangre entera en este protocolo debido a la presencia de ADAMTS13. Agentes de prevención de la activación de las plaquetas, como la prostaciclina o apyrase, deben evitarse, como esto más tarde negativamente puede influir en la adhesión de plaquetas al VWF. Asegurando que los buffers son traídos a temperatura ambiente antes de aislamiento de la plaqueta y técnicas pipeta cuidado (es decir, evitando burbujas y fuertes tensiones de esquileo) son clave para mantener las plaquetas en su estado inactivo. Además, las plaquetas con una mancha mitocondrial, como DIOC6 o rodamina 6 G, de etiquetado se prefiere sobre interferir con dominios extracelulares que pueden ser importantes para el atascamiento del VWF. Sin embargo, como DIOC6 es un colorante permeable a la membrana, se puede también ser tomado en pequeñas cantidades por las células endoteliales en el transcurso del experimento. En la ausencia de un microscopio de fluorescencia, otros estudios han observado cadenas de FvW plaquetario mediante microscopía de campo brillante46.
En conclusión, esta metodología de la cámara de flujo de formación cadena de VWF-plaqueta puede proporcionar datos mecanicistas, en tiempo real para apoyar observaciones en vivo en la patogenia de la trombosis. Como exposición a distorsionar fuertemente influencias el papel fisiopatológico que VWF en enfermedad thrombo-inflamatoria, el modelo de la cámara de flujo es una herramienta de investigación vital para cualquier interesado en la comprensión de las interacciones de la célula endotelial-plaqueta en este laboratorio contexto.
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Alison Michels es un recipiente de Frederick Banting y Charles Best Canadá becas postgrado de los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Laura L. Swystun es el recipiente de una beca CIHR. David Lillicrap es el receptor de una Cátedra de investigación de Canadá en Molecular de la hemostasia. Este estudio fue financiado en parte por un subvención (MOP-97849) de funcionamiento el CIHR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
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