Summary
Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .
Abstract
Fator de von Willebrand (VWF) é um fator de coagulação multiméricas glicoproteína que medeia adesão plaquetária e agregação em locais de dano endotelial e que transporta o fator VIII na circulação. VWF é sintetizada pelas células endoteliais e também é lançado constitutivamente para o plasma ou é armazenada em organelas especializadas, chamadas corpos de Weibel-Palade (WPBs), para a liberação sob demanda em resposta ao desafio hemostática. Procoagulante e proinflammatory estímulos podem induzir rapidamente exocitose WPB e lançamento do VWF. A maioria de VWF liberado pelas células endoteliais circula no plasma; no entanto, uma proporção de VWF é ancorada à superfície da célula endotelial. Sob condições de cisalhamento fisiológica, VWF ancorada endotelial pode vincular a plaquetas, formando uma cadeia de caracteres de VWF-plaquetas que pode representar o nicho da formação de trombos. Um sistema de câmara de fluxo pode ser usado para observar visualmente a liberação de VWF de células endoteliais e a subsequente plaqueta de capturar em uma maneira que seja reprodutível e relevantes para a fisiopatologia da formação de trombos VWF-mediada. Usando esta metodologia, as células endoteliais são cultivadas em uma câmara de fluxo e são posteriormente estimuladas com secretagogues de induzir exocitose WPB. As plaquetas lavadas então são pintadas sobre o endotélio ativado. As plaquetas são ativadas e posteriormente ligam a sequências VWF alongadas na direção do fluxo do fluido. Usando os histones extracelulares como um estímulo procoagulante e proinflammatory, observamos maior formação de sequência de caracteres VWF-plaquetas células endoteliais histona-tratadas em comparação com as células endoteliais não tratadas. Este protocolo descreve uma avaliação quantitativa, visual e em tempo real da ativação de interações VWF-plaquetas em modelos de trombose e hemostasia.
Introduction
Trombose é a principal causa de mortalidade no mundo1 e pode se desenvolver em resposta todysregulated plaquetária ativação e trombina geração em ambas as artérias veinsand. Os níveis plasmáticos de VWF são um regulador chave de coagulação do sangue, segundo o qual a níveis baixos (< 50%) resultar no distúrbio hemorrágico, conhecido como von Willebrand (VWD) de doença2 e níveis elevados (> 150%) estão associados com um risco aumentado de venosa3 e trombose arterial4 .
VWF é uma glicoproteína multiméricas sintetizada pelos megacariócitos e células endoteliais e armazenado em plaquetas α-grânulos e WPBs, respectivamente. Desafio hemostático, VWF pode ser liberado da endoteliais WPBs para amarrar as plaquetas circulantes de células endoteliais ativadas5 ou colágeno exposto no vaso parede6. Ancoragem de VWF para células endoteliais foi mostrado para ser mediado pelo P-selectina7 e integrinas αvβ38. A subsequente liberação de plaquetas α-grânulo lojas pode aumentar ainda mais as concentrações de VWF localizadas para estabilizar as interações de plaquetas-plaquetas para a formação de plaquetas plug, o andaime necessário para a propagação da cascata de coagulação e fibrina deposição. A atividade de plaquetas-ligação do VWF é regulada pela sua estrutura multiméricas, com oriundas de alto peso molecular, possuindo maior atividade hemostática9,10. Em circulação, VWF também atua como um portador para o factor VIII de coagulação.
Tensão de cisalhamento de fluido é um regulador essencial da fisiologia do VWF. Na ausência de tensão de cisalhamento, VWF existe sob uma forma globular, ocultando os domínios de ligação para a glicoproteína plaquetária Ib adesão11. Quando a tensão de cisalhamento está presente, o local de clivagem para uma metalloprotease, uma Desintegrina e metalloprotease com motivo thrombospondin (ADAMTS13), é exposto. ADAMTS13 cliva nuas e plaquetas-decorado VWF sequências de caracteres para regular o tamanho do multimer, reduzindo sua atividade hemostática12.
VWF é uma proteína de fase aguda, e inúmeros estímulos, incluindo hipoxia13, infecção14e cytokines proinflammatory, foram mostrados para mediar a liberação VWF de células endoteliais. Semelhante a outros agentes inflamatórios, histonas extracelulares também foram mostrados para induzir liberação sistêmica de VWF ratos15,16 e a ativação de plaquetas em vitro17,18, 19. isto foi mostrado para ser dependente de subtipo de histona, como diferenças de lisina e conteúdo de arginina pode influenciar a função15. Nossa estudo visa estabelecer uma câmara de fluxo modelo para investigar a influência do rico em lisina (HK) e ricos em arginina subtipos de histona (HR) e secretagogues na liberação VWF endotelial e plaquetária em tempo real de captura, potenciais eventos precoce em trombose induzida por inflamação.
Esta metodologia de câmara de fluxo recapitula em vivo de interações entre as plaquetas, células endoteliais, VWF e colágeno subendotelial em um sistema em vitro que é visual, reprodutível e quantificáveis. Permite a avaliação em tempo real de todos os aspectos do percurso que regula as interações VWF-plaquetas, incluindo secreção WPB, Ativação plaquetária e proteólise VWF. Estudos de VWF sob condições controladas de tensão de cisalhamento têm sido utilizados para avaliar as mutações do VWD que prejudicam a liberação do VWF e plaqueta-ligação função20, WPB fisiologia21e clivagem VWF por ADAMTS135. Nós usamos esta metodologia para quantificar a formação de cadeia de caracteres VWF-plaquetas como consequência de um estímulo inflamatório: histonas extracelulares.
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Protocol
Estes estudos foram aprovados pelo University, Canadá da investigação ética Board da rainha.
1. endothelial da pilha estimulação
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Uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de colágeno-casaco.
- 24 h de antecedência, casaco, uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 37 ° C, com 1 mL de colágeno de buffer (50 µ g/mL rato cauda colágeno tipo 1 com 0,02 M de ácido acético glacial).
- Lave os poços duas vezes com 2 mL de Hank está equilibrado sal solução (HBSS).
Nota: As placas podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas em um saco de plástico hermético a 4 ° C.
- Sementes em uma densidade de 1 x 106 células por poço em 2 mL de crescimento médio contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), as células endoteliais. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C (5% CO2).
Nota: Aqui, sangue consequência células endoteliais (BOECs) entre 5 e 15 passagens foram usadas. BOECs foram isoladas de voluntários saudáveis com uma sequência VWF sua usando um método referenciado em Starke et al 22 , de uma forma semelhante a um descrito anteriormente por JoVE23. - Retire o meio após 24 h e lave as células com HBSS.
- Adicionar 1 mL de meio livre de soro (meio de crescimento essencial mínimo sem FBS) contendo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA; 100 nM), fluida histona (UH) e HK ou HR (todos em 25 µ g/mL) para as células por 2 h a 37 ° C (5% CO2).
Nota: Esta concentração de histona foi baseada em vitro citotoxidade relatórios anteriores de Xu et al . 24 e Abrams et al. 25 que usado 50 µ g/mL. - Recolher o meio após 2h e armazená-lo a-20 ° C até análise.
2. VWF quantificação por ensaio enzima-lig da imunoabsorção (ELISA)
- Revestir uma microplaca com 100 µ l de revestimento anticorpo tampão (10mm dibásico fosfato de sódio e 145 mM de cloreto de sódio, pH 7,2) contendo policlonal anti-VWF 10 µ g/mL durante a noite a 4 ° C.
- Lavar a placa 3 vezes com 250 µ l de tampão de lavagem (10 mM de fosfato de sódio dibásico, cloreto de sódio 500 mM e 0,1% Tween 20, pH 7,2).
- Diluir as amostras médias 1:2 e 1:4 com tampão de lavagem e usar plasma de referência normal para uma curva padrão, começando em um 01:10 diluição.
- Placa de 100 µ l de amostras diluídas e normas durante a noite a 4 ° C.
- Lave a placa 3 vezes com 250 µ l de tampão de lavagem.
- Adicione 100 µ l de anti-VWF diluído, anticorpo conjugado HRP deteção (1.1 µ g / µ l de tampão de lavagem) para a placa e incubar por 1h à temperatura ambiente.
- Lave a placa e incubar durante 10 minutos com O-fenilenodiamina dicloridrato (OPD) reagente, conforme as instruções do fabricante.
- Parar a reação com 100 µ l de 1 M H2então4 e leia a placa em 492 nm.
3. fase sólida histona-VWF ensaio
- Revestir uma microplaca com histonas diluídas em 0,5% de sódio deoxycholate 50mm carbonato de buffer (pH 9.6) 10 µ g/mL durante a noite a 4 ° C.
- Lavar a placa 3 vezes com 250 µ l de PBS suplementado com 0,1% Tween 20, incubando durante 10 min entre lavagens.
- Bloquear a placa com 200 µ l de PBS suplementado com 0,1% Tween 20 e 1% albumina de soro bovino (BSA) por 1h à temperatura ambiente.
- Repita a etapa 3.2.
- Diluir em série derivada de plasma humano VWF/fator VIII complexo de 200 mU/mL a 25 mU/mL no tampão salino (cloreto de sódio de 500 mM de fosfato de sódio dibásico, de 10mm e 0.1% Tween 20, pH 7,2). Adicione 100 µ l para a placa para 2 h à temperatura ambiente.
- Repita a etapa 3.2.
- Detecta a ligação do VWF a histona imobilizada usando 100 µ l de uma solução contendo PBS-0.1% Tween 20 e 1:1,000 coelho policlonal anti-VWF anticorpo conjugado com HRP por 1h à temperatura ambiente.
- Repita a etapa 3.2.
- Incubar a placa por 30 min com 100 µ l de reagente OPD e parar a reação com 100 µ l de 1 M H2então4. Medir a densidade óptica em 492 nm.
4. semeadura de células endoteliais em câmaras de fluxo
- Carrega a 0,5 mL de tampão de colágeno-revestimento (descrito no passo 2.1) em uma seringa de 1 mL Luer-lock.
- Torça a extremidade do conector Luer-lock da seringa para o reservatório de um slide de câmara de fluxo.
- Pressione o êmbolo lentamente até a pista inteira é revestida e cada reservatório estiver cheio. Repita para cada raia e incubar a câmara a 37 ° C por 24 h.
- Aspire o buffer de colágeno-revestimento com uma pipeta de 200 μL. Carregar outra seringa com 1 mL HBSS e pressione o êmbolo lentamente para lavar cada raia da câmara de fluxo. Aspire a lavagem com uma pipeta μL 200 na extremidade oposta da câmara de fluxo. Repita duas vezes.
- Pipetar cerca de 100 µ l de uma solução de células endoteliais (BOEC) 3 x 106 células/mL em meio de cultura com 10% FBS para a pista de uma câmara de fluxo.
Nota: A densidade de semeadura de células endoteliais excede a capacidade da câmara. Isso é para garantir a cobertura máxima do canal; as células não-aderentes são removidas na etapa de lavagem posterior. - Incube a câmara a 37 ° C por 24 h. mudança de meio de cada 8-12 h usando seringas Luer-lock (como na etapa 4.4). Certifique-se de que não há nenhuma bolha visível nas pistas.
5. isolar as plaquetas de sangue total humano
- Em uma câmara de segurança biológica com uma agulha 30G, adicione 300 µ l de tampão ácido-citrato dextrose (citrato trissódico 85mm, 111 mM D-glicose e ácido cítrico de 71 mM, pH 4.5) para um vacutainer de coleta de sangue sem aditivos 3 mL.
- Colete sangue total de voluntários saudáveis (livres de anti-plaquetários e não-esteroides anti-inflamatórios não esteroides por sete dias) por punção venosa (três tubos de 3ml cada), seguindo um protocolo semelhante ao publicado por Bernardo et al.26.
- Descarte o primeiro tubo, pois o dano no tecido inicial associado com a punção venosa pode causar Ativação plaquetária espontânea.
- Inverta suavemente o Vacu três vezes para misturar o sangue com anticoagulante.
- Centrifugue o Vacu a 150 x g, durante 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
- Remova lentamente o plasma rico em plaquetas (sobrenadante) com uma pipeta em uma câmara de segurança biológica e cuidadosamente, transferi-lo para um tubo cônico de 15 mL. Transferi o volume rico em plaquetas de cada vacutainer para um único tubo cônico para evitar potencial Cruz-ativação.
Nota: O isolamento de plaquetas deve ser realizado em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação bacteriana e potencial plaquetas artificiais e/ou ativação endotelial. - Centrifuga os tubos cónicos a 900 x g durante 10 minutos a 24 ° C (temperatura ambiente) para as plaquetas de Pelotas.
- Pipetar e descartar o sobrenadante pobre em plaquetas.
- Lave o pellet cuidadosamente com 1 mL de tampão de citrato-glicose-sódio (CGS) (citrato de sódio de 13 mM, 30 mM D-glicose e cloreto de sódio 120 mM, pH 7,0).
Nota: As plaquetas aparecerá em formações de wisp quando o buffer CGS é adicionado e o sedimento é resuspended suavemente. Amostras contaminadas por Ativação plaquetária, as plaquetas não serão facilmente Resuspenda em surgem agrupadas. - Uma vez totalmente resuspended, Centrifugar as amostras a 900 x g durante 10 minutos a 24 ° C (temperatura ambiente).
- Retire o tampão de lavagem CGS e resuspenda o pellet em 3 mL de tampão de Tyrode (cloreto de sódio 138 mM, 5.5 mM D-glicose, 12mm de bicarbonato de sódio, cloreto de potássio de 2,9 mM e 0,36 mM de fosfato de sódio dibásico, pH 7,4). Certifique-se de ressuspensão completa das plaquetas e, se forem observadas as agregações, descartar a amostra.
- Adicione 1,5 µ l de uma solução-mãe DiOC6 (dissolver 57,25 mg em 5 mL de metanol) de 20mm a cada tubo cónico de 3 mL de plaquetas lavadas para uma concentração final de 1 µM.
Nota: DIOC6 é um corante de mitocondrial verde fluorescente usado neste experimento para as plaquetas de rótulo. - Alíquota 1 mL da solução de plaquetas lavadas para três tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
Nota: O volume de plaquetas exigido para este experimento é calculado com base no tamanho da câmara de fluxo, a tensão de cisalhamento desejado e o comprimento do experimento (passo 6.5). Este protocolo pode ser ajustado conforme as condições mudam para garantir que não há volume suficiente para o fluxo de fluido. - Use as plaquetas lavadas até 2 horas de isolamento.
6. fluxo de montagem de aparelhos
- Prenda um pedaço de 70 cm de estéril silicone tubo (diâmetro interior de 1,6 mm) para um conector Luer de cotovelo macho em uma extremidade e um adaptador de bloqueio Luer fêmea na outra.
- Conecte o adaptador de bloqueio Luer fêmea anexado para o tubo a uma seringa de 20 mL.
- Repita as etapas de 6.1 e 6.2 duas vezes para gerar três conexões de seringa-tubo idênticas.
-
Use uma bomba de seringa para gerar fluxo de fluido. As seguintes configurações para a bomba de seringa de entrada: diâmetro interior da taxa de fluxo e seringa.
Nota: Uma seringa de 20 mL tem um diâmetro interior de 19,55 mm. A taxa de fluxo é calculada com base na tensão de taxa/cisalhamento cisalhamento desejado e as dimensões da câmara de fluxo. Câmara de fluxo usado no estudo atual, para alcançar 1 dyn/cm2 (observados em baixo cisalhamento venoso), é necessário um caudal de 9.37 µ l/min. Por causa da evidência ligando histonas para trombose venosa, é selecionado um cisalhamento moderado venoso de 4,45 dyn/cm2 . Isto também é baseado no pressuposto de que a reserva tem uma viscosidade semelhante à água. A taxa de fluxo é então igual a 41,7 equações µ l/min., usadas para calcular que a taxa de fluxo para várias dimensões de câmara de fluxo pode ser encontrada em:- Conjunto da bomba para retirar o líquido, usando a opção do botão da bomba de seringa.
- Carga três seringas anexado à tubulação da bomba de seringa e fixe firmemente colchetes em torno das seringas e êmbolos.
- Anexe um cotovelo macho Luer para ambas as extremidades de um segundo pedaço de 20 cm de tubo estéril do silicone.
- Conecte um cotovelo Luer uma agulha de calibre 18 embotada.
- Repita duas vezes, criando três sistemas de admissão idêntica para as três faixas da câmara de fluxo.
Nota: Os tubos de silicone e Luers pode ser lavado com água sanitária 10%, seguida por água destilada antes reusar. Não é aconselhável reutilizar as câmaras de fluxo.
7. microscópio configurações
- Use um microscópio de disco girando equipado com um palco totalmente automatizado. Realize a iluminação com um lançamento do laser que fornece 405, 458, 491, 543 e linhas de laser 633 nm. Capture todas as imagens com um objetivo X 20. Ajuste todos os parâmetros com o software de análise (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
- Selecione as configurações de canal (filtro de emissão: 520/35), com a excitação em 491 nm, para aquisição. Defina o elétron multiplicando o dispositivo de carga acoplada a um ganho de elétron-multiplicação de 150, com um tempo de exposição de 200 ms, para obter o intervalo de dados dinâmica plena.
Nota: As plaquetas são marcadas com um corante fluorescente verde, DiOC6, com maxima de comprimento de onda (excitação, 482 nm; emissão, 504 nm). - Ajuste a potência de laser 491 nm a 20%.
- Marque o centro de todas as três faixas e selecione 1 μm para faixa z e 0,5 μm de tamanho de passo. Selecione o número de pontos de tempo (ou seja, duração) e o tempo entre as imagens (ou seja, intervalo) para capturar uma imagem a cada 10 s; Selecione "60 pontos de tempo" por slide. Defina o microscópio para capturar imagens de três pistas e salvá-los para uma pasta designada experimento.
Nota: Porque a câmara de fluxo tem três faixas, o microscópio será necessário alternar entre três posições para capturar as imagens.
8. VWF-plaquetas String formação
- Remover o meio de cultura da câmara de fluxo (da etapa 4) usando a mesma técnica como na etapa 4.4.
- Adicione 100 µ l de qualquer histamina (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK ou HR (todos em 25 µ g/mL) diluído em meio livre de soro (como na etapa 1.4) para estimular a monocamada BOEC por 15 min a temperatura e O ambiente2/CO2.
Nota: Embora não seja necessário para a liberação do VWF, realizar esta estimulação a 37 ° C irá melhorar VWF exocitose27. - Certifique-se de que um dos três corredores separados da câmara de fluxo permanecem não tratados como um controle experimental.
- Remover o meio utilizando uma seringa de 1 mL e substituí-lo com 100-200 µ l de PBS para lavar os secretagogues fora a monocamada endotelial.
- Montagem da câmara de fluxo em um stand de slide usando grampos vasculares para fixar a câmara no lugar.
- Conecte o conector Luer macho disponível na extremidade do tubo de 70 cm (conectada à seringa) para o reservatório da câmara de fluxo. Repita para as duas outras fluxo câmara pistas.
- Ligue a bomba de seringa para remover a lavagem PBS. Pipeta PBS adicionais para o reservatório de câmara de fluxo opostos para garantir que as vias não secar.
- Observar o sistema de fluxo para o fluxo equivalente em todas as três faixas e então pausar a bomba de seringa.
- Selecione uma área para capturar as imagens em meados de cada raia, aproximadamente a mesma área entre experiências.
Nota: A pessoa que opera o microscópio pode ser cega às condições experimentais. Esta etapa garante que o microscópio é focado antes fluxo de plaquetas (consulte a etapa 7). - Anexar um acoplador fêmea luer a uma seringa de 5 mL e depois para o conector luer macho livre (etapa 6,8) e mergulhe a agulha cega no tubo microcentrifuga de 1,5 mL contendo a solução de plaquetas lavadas (etapa 5.13). Tirar lentamente a solução de plaquetas através do tubo para não garantir nenhuma bolha de ar dentro do sistema.
- Remova a seringa de 5 mL e anexar o conector Luer macho ao reservatório aberta da câmara de fluxo. Repita para as três faixas.
- Reiniciar a bomba de seringa e capturar imagens durante o fluxo de plaquetas usando as configurações de microscópio e protocolo da etapa 7 para 10 min no escuro.
- Depois de 10 min, desconecte o tubo de entrada no reservatório de câmara do fluxo o Luer e encher o reservatório com PBS para manter o fluxo sobre a monocamada endotelial.
9. VWF-plaquetas String quantificação
Nota: O fluxo contínuo de PBS é necessária para manter o alongamento de cadeia de caracteres de VWF-plaquetas para análise de imagem. Cessação do fluxo resultará no VWF tornando-se globular e prejudicará a quantificação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas. É essencial para completar cada reservatório com PBS durante a captura de imagem. HBSS pode substituir PBS se encolhendo de célula ou destacamento é observado durante esta etapa.
- Começando com a primeira pista, capture 10 imagens por slide sem sobreposição usando uma lente de objetiva X 20 em torno do meio do slide. Repita isto para cada raia.
Nota: As áreas em torno dos reservatórios devem ser evitadas devido à tensão de cisalhamento turbulenta. - Usando o software de processamento de imagem, ajustar o brilho, clicando em "Imagem", "Ajustar" e "Brilho/contraste." Arraste a barra de rolagem até que as plaquetas aderidas podem ser visualizadas bem o suficiente para quantificação.
- Grave uma sequência de caracteres de VWF-plaquetas quando três ou mais alinhadas plaquetas são observadas na imagem. Conte todas as cordas de VWF-plaquetas em uma imagem. Repita para todas as 10 imagens e média para o experimento.
Nota: A pessoa que realizar a quantificação pode ser cego para as condições experimentais. Não é necessário ficar manchado co para VWF, como isto foi confirmado por estudos independentes de28,8,29. - Repeti o experimento um mínimo de três vezes para avaliar cada secretagogue.
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Representative Results
Para avaliar diretamente o efeito das histonas na liberação VWF de células endoteliais, estamos expostos a confluentes BOECs de PMA contendo soro livre médio (controle positivo), UH, HR e HK por 2 h. Nós mostramos que a HK induziu um aumento de 2 vezes em proteínas VWF (VWFAg) no meio de células endoteliais expostas (Figura 1). Curiosamente, quando BOECs foram estimulados com UH e RH, lá era menos VWFAg detectado no meio do que na condição de não tratada. Formulamos a hipótese que porque histonas podem vincular diretamente a VWF30, eles diferencialmente podem interferir com a deteção de VWFAg em meio de cultura. Para avaliar a vinculação de histona de VWF, usamos um ensaio de fase sólida ligação. Nós mostramos que UH e HR ligado mais fortemente a VWF que HK (Figura 2), a interferência de deteção de apoio demonstraram na Figura 1.
Histonas extracelulares têm sido mostradas para ativar as plaquetas em vitro19, e nossos dados sugerem que as histonas mediam a liberação VWF de células endoteliais. Para caracterizar o efeito das histonas em interações VWF-plaquetas, usamos um modelo de câmara de fluxo de formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas no qual rotulados de plaquetas foram perfundidas estimulado em células endoteliais. Imagens representativas foram capturado pós fluxo, e o número de sequências de caracteres VWF-plaquetas foram quantificado.
Observamos que, após o início das condições de fluxo, células não tratadas tinham muito poucas sequências VWF-plaquetas (< 1 sequência por campo de revisão), enquanto a histamina e células tratadas PMA tinham uma média de 2,10 e 3.10 sequências de caracteres, respectivamente. Significativamente mais cordas VWF-plaquetas foram formadas quando as células foram tratadas com HK (3,52 sequências de caracteres, P = 0,019), HR (6,00 sequências de caracteres, P = 0,004) e UH (5,51 sequências de caracteres, P = 0,012). Uma representação gráfica de contagem de caracteres o VWF-plaquetas é mostrada na Figura 3. Formação de sequência de caracteres em tempo real VWF-plaquetas em resposta a UH em comparação com células não tratadas é mostrada em vídeos 1A e B.
Estes estudos, juntamente com as investigações por outros grupos, mostram que histones28 e outros agentes de proinflammatory como histamina5 e citocinas31 estimulam a secreção de células endoteliais, VWF mediando plaquetas subsequentes Capture em vitro. Demonstrámos que o estímulo estático de células endoteliais não foi suficiente para elucidar a liberação VWF devido a capacidade das histonas bind e sequestrar VWF. O design de um modelo de câmara de fluxo de adesão de lançamento e plaquetas VWF era portanto necessário mais completamente caracterizar e modelar as interações na vivo entre o endotélio, VWF e plaquetas.
Figura 1: rico em lisina histonas induz liberação VWF de culturas de células endoteliais. BOECs foram estimulados com histona fluida (UH), rico em lisina (HK) e frações de histona ricos em arginina (HR). HK estimulou a introdução VWF em meio de cultura. UH e HR tratamento diminuíram a detecção de VWFAg no meio de células endoteliais em relação ao controle (Untr) não tratado. Foram realizados experimentos individuais do N ≥3. Os dados são mostrados como os valores médios ± SE. *P < 0.05, * *P < 0,01, e * * *P < 0,001 indicam a importância em relação a condição de não tratada. Esta figura foi modificada de Michels et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ligação do VWF-histona interfere com VWF deteção em Vitro. Derivado de plasma VWF liga mais fortemente a HR e UH de forma dose-dependente em comparação com histonas de rico em lisina (HK) em um ensaio de fase sólida ligação. Os dados são mostrados como os valores médios ± SE. N≥3 foram realizados experimentos individuais. Esta figura foi modificada de Michels et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: histonas mediam a formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetária. Células endoteliais semeadas em câmara de fluxo slides foram tratados com fluida histona (UH), rico em lisina (HK), ou ricos em arginina (HR) frações de histona ou histamina/PMA (controles positivos) e foram pintadas em uma tensão de cisalhamento de 4,45 dyn/cm2 para 10 min com plaquetas lavadas, fluorescente etiquetadas. Imagens representativas foram obtidas plaquetário pós fluxo do controle não tratado (A) e células tratadas com histamina (B), Phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) (C), HK (D), RH (E) e UH (F). Tratamento de PMA resultou em uma média de 3,1 cordas por campo de visão, comparável à histamina. Cordas de VWF-plaquetas foram quantificadas de 10 campos de avaliação consecutivas e em média para experiências individuais de n≥3 (G). Os dados são mostrados como os valores médios ± SE. * P < 0,05 e * * P < 0,01 indicam significância em relação a condição de não tratada. Esta figura foi modificada de Michels et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeos suplementares. Formação de cadeia de caracteres VWF-plaquetas em resposta a Unfractionated histona (2) comparado ao tratamento n (1): este vídeo foi modificado de Michels et al.15. Clique aqui para baixar esses vídeos.
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Discussion
Enquanto a relevância fisiológica do VWF-plaquetas cordas permanece controverso devido a sua rápida dissolução na presença da VWF-cleaving protease ADAMTS13, eles servem como um modelo quantificável em vitro de recrutamento de plaquetas pelo VWF para um site em que um trombo pode formar na presença de localizadas aumentos nos níveis de histona5. Além disso, em patologias falta ADAMTS13 atividade-tais como púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) - ou no microambiente inflamatório - onde ADAMTS13 atividade é inibida-VWF-plaquetas sequências de caracteres podem ser observadas na vivo32 e pode contribui para o extravasamento de microaggregation e leucócitos plaquetas, vinculando as funções hemostático e proinflammatory do VWF33. Finalmente, ele tem sido a hipótese daquela formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas pode ser um evento iniciante em trombose venosa e/ou arterial, formando nicho em torno do qual é construído um trombo patológico.
Formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas no sistema de câmara de fluxo pode ser usada para estudar a exocitose WPB, ADAMTS13 clivagem e a capacidade de ligação de plaquetas de VWF. Existem várias etapas críticas para executar com êxito estes experimentos. No entanto, dependendo da aplicação do modelo, podem ser feitas modificações no protocolo.
Células endoteliais de leitos vasculares específicas são heterogêneas em sua resposta a sinais mecânicos e bioquímicos34. Portanto, pode ser útil selecionar um tipo de célula adequado para a aplicação desta metodologia. BOECs foram utilizados no estudo atual, por causa de seu potencial proliferativo; manutenção do fenótipo do outro lado várias (10 +) passagens; e a expressão de VWF robusto, facilitando a quantificação de exocitose VWF. Outros investigadores utilizaram umbilical humano veia endotelial células (HUVECs)5,8,28 e células não-endotelial (células de rim humano embrionário 293) transfected com VWF cDNAs expressando mutações VWD35 . Foi demonstrado que a expressão VWF varia significativamente entre tecido e embarcação de Fisiologia36. Células endoteliais culturas, decorrentes de várias micro e macrovasculature têm diferenças observáveis no VWF proteína secreção basal37, e há evidências de que as diferenças de canal de cálcio entre subtipos de células endoteliais influenciam WPB exocitose em resposta a secretagogues38.
Histonas foram utilizadas neste estudo como uma novela secretagogue. Eles foram comparados com o controle positivo, histamina, um estimulante fisiológico frequentemente descrito de lançamento do VWF. Um VWFAg ELISA foi utilizado para verificar a liberação VWF de células endoteliais, em condições estáticas. Existem dois mecanismos intracelulares que desencadear a liberação de VWF: a elevação do cálcio intracelular39 ou pf AMP cíclico níveis40. Ativação diferencial destas vias pode ser induzida por secretagogues como trombina/histamina ou epinefrina/vasopressina (ou relevantes para VWD, desmopressina), respectivamente, e pode ser interessante comparar estas duas vias usando esta câmara de fluxo modelo de formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas. No contexto da doença inflamatória-crise, ainda mais elucidação de biomarcadores inflamatórios, tais como citocinas41 ou dano/patógeno-associado padrões moleculares (represas/PAMPS) e seus papéis na formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas é incentivada.
Tensão de cisalhamento fluido é importante quando a VWF globular se desdobra para expor o sítio de ligação do domínio A1 para glicoproteína Ib em plaquetas11. Foi demonstrado que uma tensão de cisalhamento mínima fluida de aproximadamente 0,73 dyn/cm2 é necessária para a ligação de plaquetas com VWF cordas42. Além disso, estes formam cadeias de caracteres em células endoteliais em relativamente baixa tensões de cisalhamento (2,5 dyn/cm2) mas pode ser desalojada em tensões de cisalhamento de 20 dyn/cm2 ou acima de8. No presente inquérito, selecionamos uma tensão de cisalhamento venosa (4,45 dyn/cm2) permitidos para as interações entre o endotélio, VWF e plaquetas, preservando a reserva de perfusão para uma experiência de 10 min.
Usando este sistema de câmara de fluxo para avaliar ADAMTS13 clivagem de sequências de caracteres VWF-plaquetas requer um aumento das tensões de cisalhamento fluídico sobre aqueles utilizados neste experimento. Clivagem de ADAMTS13 máxima de sequências de caracteres VWF-plaquetas ocorre entre 10 e 30 dyn/cm212, um intervalo que abrange alta venoso a arterial moderada tensão de cisalhamento43. Modificando a taxa de cisalhamento neste sistema pode ser útil para comparar a formação de cadeia de caracteres de VWF-plaquetas e dissolução, contribuindo fatores no desenvolvimento de trombose venosa, arterial ou microvascular.
Modificações adicionais desta técnica podem ser feitas para o material da perfusão e da câmara de fluxo. Secretagogues podem ser administradas sob condições de fluxo assemelhar-se a ambientes em vivo . Escorva plaquetas com agonistas para avaliar sua reatividade ou incluindo populações de leucócitos são extensões desta técnica. Além disso, incluindo agentes terapêuticos visando VWF multimer comprimento, capacidade de ligação de plaquetas ou reatividade plaquetária pode elucidar mecanismos importantes que regulam o início do desenvolvimento do trombo. Outros investigadores têm usado ou in-house44 ou comprado lamela de vidro câmaras fluxo45, em oposição os slides baseados no polímero utilizado neste estudo e parecem obter resultados comparáveis.
Uma consideração crítica no protocolo de sequência de caracteres de VWF-plaquetas é a preparação de plaquetas lavadas. Não é recomendável usar sangue total neste protocolo devido à presença de ADAMTS13. Agentes, impedindo a ativação plaquetária, tais como a prostaciclina ou Apirase, devem ser evitados, como isto pode influenciar mais tarde negativamente adesão plaquetária ao VWF. Garantindo que os buffers são trazidos à temperatura ambiente antes de isolamento de plaquetas e usando técnicas de cuidado pipeta (i.e., evitando bolhas e duras tensões de cisalhamento) são a chave para manter as plaquetas no seu estado inativo. Além disso, rotular as plaquetas com uma mancha mitocondrial, como DIOC6 ou rodamina 6G, é preferido por interferir com domínios extracelulares que podem ser importantes para o emperramento do VWF. No entanto, como DIOC6 é uma membrana permeável ao corante, isso pode também ser retomado em pequenas quantidades pelas células endoteliais ao longo do experimento. Na ausência de um microscópio fluorescente, outros estudos observaram sequências VWF-plaquetas usando microscopia de campo claro46.
Em conclusão, esta metodologia de câmara de fluxo de formação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas pode fornecer dados mecanicistas, em tempo real para oferecer suporte na vivo observações na patogênese da trombose. Como exposição de cisalhamento fortemente influencia o papel fisiopatológico que VWF desempenha na doença inflamatória trombo, o modelo de câmara de fluxo é uma ferramenta de investigação vital por qualquer laboratório interessado em compreender as interações da célula endotelial-plaquetas neste contexto.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Alison Michels é um destinatário de um Frederick Banting e Charles Best Canadá graduação bolsa de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Laura L. Swystun é o destinatário de uma comunhão CIHR. David Lillicrap é o destinatário de uma cadeira de pesquisa do Canadá na hemostase Molecular. Este estudo foi financiado em parte por um CIHR grant (MOP-97849) de funcionamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
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