Summary
В настоящем документе мы описываем метода для оценки эндотелиальной Виллебранда коэффициент выпуска и последующие тромбоцитов захвата под жидкости касательное напряжение в ответ на воспалительные раздражителей, с помощью системы камеры потока в пробирке .
Abstract
Фактор Виллебранда (VWF) является фактор свертывания гликопротеин multimeric которая опосредует тромбоцитов адгезии и агрегации в местах повреждения эндотелия и что несет фактора VIII в циркуляции. VWF синтезируется эндотелиальных клеток и конститутивно высвобождается в плазме или хранится в специализированные органеллы, называется Weibel-Паладе органов (WPBs), для выпуска по требованию в ответ на вызов гемостаза. Быстро procoagulant и провоспалительных раздражителей может вызвать WPB экзоцитоз и VWF выпуска. Большинство VWF выпущенное эндотелиальных клеток циркулирует в плазме; Однако доля VWF привязанный к поверхности эндотелиальных клеток. В условиях физиологического сдвига эндотелиальные якорь VWF можно связать тромбоцитов, образуя VWF-тромбоцитов строку, которая может представлять очагов тромбообразованию. Камерная система потока может использоваться визуально наблюдать за освобождение VWF из эндотелиальных клеток и последующие тромбоцитов захватить образом, воспроизводимые и отношение к патофизиологии VWF-опосредованной тромбообразованию. Используя эту методологию, эндотелиальные клетки культивировали в камере потока и впоследствии стимулируются с secretagogues побудить WPB экзоцитоз. Промывают тромбоцитов затем увлажненную над активированные эндотелия. Тромбоциты активируются и впоследствии связать удлиненные VWF строки в направлении потока жидкости. С помощью внеклеточного гистонами как procoagulant и провоспалительных стимул, мы наблюдали повышенное образование строку VWF-тромбоцитов на лечение гистона эндотелиальных клеток, по сравнению с необработанными эндотелиальных клеток. Этот протокол описывает количественные, визуальные и реального времени оценки активации VWF-тромбоцитов взаимодействий в моделях тромбоза и гемостаз.
Introduction
Тромбоз является ведущей причиной смертности во всем мире1 и может развиваться в ответ todysregulated тромбоцитов активации и тромбина поколения в обоих расширение артерий. Плазменные уровни VWF являются ключевым регулятором свертывающей системы крови, при котором низкий уровень (< 50%) привести в нарушение свертываемости крови, известный как Виллебранда болезни (VWD)2 и высокие уровни (> 150%), связанные с повышенным риском венозного3 и тромбоз артерий4 .
VWF это гликопротеин multimeric синтезированы megakaryocytes и эндотелиальных клеток и хранится в α-гранулы тромбоцитов и WPBs, соответственно. После гемостаза вызов VWF могут быть освобождены от эндотелия WPBs привязать циркулирующих тромбоцитов активированные эндотелиальные клетки5 или подвергаются коллагена на судно стены6. Анкеровка VWF эндотелиальных клеток было показано, быть опосредовано P селектина7 и Интегрин альфаvβ38. Последующий релиз магазинов α-гранулы тромбоцитов может еще больше повысить локализованных VWF концентрации для стабилизации тромбоцитов тромбоцитов взаимодействий для формирования вилка тромбоцитов, леска, необходимые для распространения каскад свертывания крови и фибрин осаждения. Тромбоциты привязки активность VWF регулируется по своей структуре multimeric, высокомолекулярный вес мультимеры, обладающие большей кровоостанавливающее действие9,10. В обращении VWF также выступает в качестве носителя для коагуляционного фактора VIII.
Жидкости касательное напряжение является важным регулятором VWF физиологии. В отсутствие напряжения сдвига VWF существует в шарообразную форму, сокрытие связывания доменов для тромбоцитов гликопротеина Ib адгезии11. Когда присутствует напряжение сдвига, расщепление сайт для metalloprotease, Дизинтегрин и metalloprotease с мотивом тромбоспондин (ADAMTS13), подвергается. ADAMTS13 расщепляет голый и тромбоцитов оформленный VWF строк регулировать размер multimer, тем самым уменьшая его кровоостанавливающее действие12.
VWF — белок острой фазы, и было показано, что многочисленные стимулы, включая гипоксии13, инфекции14и провоспалительных цитокинов, посреднические VWF освобождения из эндотелиальных клеток. Похож на другие воспалительные агенты, внеклеточная гистонами также было показано, побудить системных VWF выпуска в мышей15,16 и активации тромбоцитов в vitro17,18, 19. это было показано зависел гистона подтип, как различия в лизине и содержание аргинина может повлиять на функции15. Наши исследования стремится создать камеру потока модели в том, чтобы исследовать влияние лизин-богатые люди (HK) и аргинин богатые подтипы гистонов (HR) и secretagogues на эндотелиальных VWF выпуска и тромбоцитов в реальном времени захвата, потенциал раннего события воспаление индуцированной тромбоза.
Эта методология камеры потока резюмирует в естественных условиях взаимодействия между субэндотелиальном коллагена, эндотелиальные клетки, VWF и тромбоцитов в системе в пробирке , визуальные, воспроизводимые и поддающихся количественной оценке. Это позволяет в реальном времени оценки всех аспектов путь, который регулирует VWF-тромбоцитов взаимодействия, включая WPB секреции, активации тромбоцитов и VWF протеолиза. ADAMTS135использовали для оценки VWD мутации, которые ослабляют VWF выпуска и тромбоцитов привязки функции20, WPB физиологии21и VWF расщепления исследования VWF при сдвиге в контролируемых условиях. Мы используем эту методологию количественной оценки формирования строки VWF-тромбоцитов вследствие воспалительных стимул: внеклеточная гистонами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эти исследования были утверждены исследовательской этики Совет королевы университет, Канада.
1. эндотелиальных клеток стимуляция
-
Коллаген слой пластины 6-ну тканевые культуры.
- 24 часа заранее, Пальто плиты 6-ну тканевые культуры при 37 ° C с 1 мл раствора коллагена буфера (50 мкг/мл крысы хвост коллаген типа 1 с 0,02 М Ледниковая укусная кислота).
- Промойте лунки дважды с 2 мл из Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS).
Примечание: Пластины могут быть завернуты в фольгу олова и хранится в герметичной полиэтиленовый пакет на 4 ° C.
- Семя эндотелиальных клеток на плотности 1 х 106 клеток на скважину в 2 мл сыворотки роста средних содержащий 10% плода говядину (ФБС). Инкубируйте клетки для 24 ч при 37 ° C (5% CO2).
Примечание: Здесь, эндотелиальные клетки крови нарост (BOECs), между 5 и 15 проходы были использованы. BOECs были изолированы от здоровых добровольцев с wildtype VWF последовательности с помощью метода ссылки в Starke и др. 22 в аналогии с одной ранее описанных JoVE23. - Удалите носитель после 24 ч и вымыть клетки с HBSS.
- Добавить 1 мл сыворотки свободный среднего (минимальный существенный рост средних без FBS) содержащий phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA; 100 Нм), нефракционированного гистонов (UH) и HK или HR (все 25 мкг/мл) в клетки для 2 ч при 37 ° C (5% CO2).
Примечание: Эта концентрация гистона была основана на предыдущих докладах в vitro цитотоксичность Xu et al. 24 и Абрамс и др. 25 что используется 50 мкг/мл. - Собирать средства через 2 ч и храните его при 20 ° C до анализа.
2. VWF количественной оценки, энзим соединенный Assay иммуносорбента (ELISA)
- Слой микропланшетов с 100 мкл покрытия буфера (натрия хлорида для двуосновной фосфат натрия и 145 мм 10 мм, pH 7.2) содержащий 10 мкг/мл поликлональных анти VWF антитела на ночь при 4 ° C.
- Вымойте тарелку три раза с 250 мкл буфера мытья (10 мм двуосновной фосфат натрия, хлорид натрия 500 мм и 0,1% Tween-20, pH 7.2).
- Разбавить средних проб 1:2 и 1:4 с буфером мыть и использовать обычный ссылка плазмы для стандартной кривой, начало в 1:10 разрежения.
- Пластина 100 мкл разбавленного образцов и стандартов на ночь при 4 ° C.
- Вымойте тарелку три раза с 250 мкл буфера мытья.
- 100 мкл разбавленного анти VWF, ПХ конъюгированных обнаружения антител (1,1 мкг/мкл буфера мытья) к пластине и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
- Вымойте тарелку и проинкубируйте втечение 10 мин с O-фенилендиамином дигидрохлорид (OPD) реагента, в соответствии с инструкциями производителя.
- Так что остановить реакции с 100 мкл 1 М H24 и чтения пластину в 492 Нм.
3. твердофазный гистон VWF привязки Assay
- Пальто микропланшетов с гистонами, разбавленной в 0,5% натрия Дезоксихолат 50 мм карбонат буфере (рН 9,6) до 10 мкг/мл на ночь при 4 ° C.
- Промойте пластины три раза с 250 мкл PBS с 0.1% 20 анимации, инкубации за 10 мин между моет.
- Блокировать пластину с 200 мкл PBS с 0.1% 20 анимации и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) за 1 ч при комнатной температуре.
- Повторите шаг 3.2.
- Серийно разбавить плазмы производные человеческого VWF/фактора VIII комплекс из 200 му/мл 25 му/мл в буфере физиологический (хлорид натрия 500 мм 10 мм двуосновной фосфат натрия, и 0,1% Tween-20, pH 7.2). 100 мкл к пластине втечение 2 ч при комнатной температуре.
- Повторите шаг 3.2.
- Определять привязку VWF для иммобилизованных гистонов, с использованием 100 мкл раствора, содержащего PBS-0.1% 20 анимации и 1:1,000 кролик поликлональных анти VWF антитело проспряганное HRP для 1 ч при комнатной температуре.
- Повторите шаг 3.2.
- Инкубировать пластину для 30 мин с 100 мкл Реагента OPD и так остановить реакции с 100 мкл 1 М H24. Измеряют оптическую плотность на 492 Нм.
4. Заполнение эндотелиальных клеток на поток камеры
- Загрузите 0,5 мл буфера коллагена покрытия (описано в шаге 2.1) в шприц 1 мл Luer-lock.
- Твист Luer-lock конце шприца на водохранилище слайд камеры потока.
- Нажмите поршень медленно до тех пор, пока весь переулок покрытием и каждый резервуар заполнен. Повторите для каждого Лейн и инкубировать палата при 37 ° C в течение 24 ч.
- Аспирационная коллаген покрытие буфер с пипеткой 200 мкл. Загрузить другой шприц с 1 мл HBSS и нажмите поршень медленно, чтобы мыть каждый Лейн палаты потока. Аспирационная мыть с 200 мкл пипетки в сопротивляясь конце потока камеры. Повторите дважды.
- Пипетка приблизительно 100 мкл 3 х 106 клеток/мл раствора эндотелиальных клеток (боец) среднего роста с 10% FBS в майну камере потока.
Примечание: Плотность посева эндотелиальных клеток превышает возможности камеры. Это необходимо для обеспечения максимальной канала; Non Сторонник клетки будут удалены на шаге последующие стирки. - Инкубируйте палата при 37 ° C для 24 h. изменения средних каждые 8-12 ч, с помощью шприцах Luer-lock (как в шаге 4.4). Убедитесь, что есть нет видимых пузыри в полос.
5. изоляция тромбоцитов человека цельной крови
- В биологической безопасности кабинета с иглой 30 G добавьте добавка бесплатно 3 мл крови коллекции vacutainer 300 мкл буфера кислота цитрат декстрозы (85 мм тринатрия цитрат, 111 мм D-глюкозы и 71 мм лимонной кислоты, pH 4.5).
- Сбор цельной крови от здоровых добровольцев (бесплатно от анти-тромбоцитарный и нестероидные противовоспалительные препараты для семи дней), венепункции (три трубки 3 мл), после протокол аналогичен Опубликовано Бернардо et al26.
- Отказаться от первой трубки, как первоначальный ткани ущерб, связанный с венепункции может вызвать спонтанные тромбоцитов активации.
- Аккуратно Переверните вакутайнеров три раза для смешивания крови с антикоагулянтом.
- Центрифуга для вакутайнеров на 150 g x 15 мин при температуре 24 ° C (комнатной температуры).
- Медленно извлеките тромбоцитов богатые плазмы (супернатант) с пипеткой в биологической безопасности кабинета и тщательно передать 15 мл Конические трубки. Передать тромбоцитов богатый объем каждого vacutainer однотрубные конические, чтобы избежать потенциальных кросс активации.
Примечание: Тромбоцитов изоляции должно производиться в биологической безопасности кабинета для предотвращения бактериального загрязнения и возможных искусственных тромбоцитов и/или активации эндотелиальной. - Центрифуга конические трубы на 900 g x 10 мин при температуре 24 ° C (комнатной температуры) для гранулы тромбоцитов.
- Пипетка и удалить супернатант тромбоцитов плохой.
- Помойте лепешка тщательно с 1 мл раствора-натрий лимоннокислый глюкозы (РКУ) буфера (цитрат натрия 13 мм, 30 мм D-глюкозы и хлорида натрия 120 мм, pH 7.0).
Примечание: Тромбоциты появится в ДСПБ подобных образований, когда добавляется в буфер CGS и гранулы нежно высокомобильна. В образцах загрязненных активации тромбоцитов тромбоциты не будет легко Ресуспензируйте и появится глыбовые. - После того, как полностью высокомобильна Центрифугуйте образцы на 900 g x 10 мин при 24 ° C (комнатной температуры).
- Удаление буфера мытья CGS и Ресуспензируйте гранулы в 3 мл Tyrode в буфер (хлорид натрия 138 мм, 5,5 мм D-глюкоза, 12 мм бикарбонат натрия, хлорид калия 2,9 мм и 0,36 мм двуосновной фосфат натрия, рН 7,4). Обеспечить полный ресуспендирования тромбоцитов и, если наблюдаются агрегаты, отбросить образца.
- Мкл 1.5 от 20 мм DiOC6 раствор (растворить 57.25 мг в 5 мл метанола) для каждого 3 мл Конические трубки промывают тромбоцитов для конечной концентрации 1 мкм.
Примечание: DIOC6 является Зеленый флуоресцентный митохондриальной краситель, используемый в этом эксперименте на этикетке тромбоцитов. - Аликвота 1 мл раствора промывают тромбоцитов до 3 пробки microcentrifuge 1,5 мл.
Примечание: Объем тромбоцитов, необходимый для этого эксперимента рассчитывается на основе размера камеры потока, нужное напряжение сдвига и продолжительность эксперимента (шаг 6.5). Этот протокол может корректироваться при изменении условий, что обеспечивает достаточный объем для потока жидкости. - Используйте промывают тромбоцитов в течение 2 ч изоляции.
6. поток аппарата Ассамблеи
- Прикрепите 70 см кусок стерильной силиконовые трубки (внутренний диаметр 1,6 мм) Ввертное колено Luer разъем на одном конце и женский адаптер блокировки Luer на другой.
- Соединяйте женского Luer блокировки придает труб на 20 мл шприц.
- Повторите шаги 6.1 и 6.2 дважды, чтобы генерировать три идентичных шприц трубы соединения.
-
Используйте шприцевый насос для создания потока жидкости. Введите следующие параметры в шприцевой насос: внутренний диаметр шприц и потока.
Примечание: 20 мл шприц имеет внутренний диаметр 19.55 мм. Скорость потока рассчитывается на основе на желаемый курс/сдвига сдвиге и размеры камеры потока. Для потока камеры, используемые в текущем исследовании, для достижения 1 Дин/см2 (наблюдаемых в низкой венозной сдвиг) требуется скорость потока 9,37 мкл/мин. Силу доказательств, связывающих гистонов к венозного тромбоза выбран умеренный венозной сдвига 4.45 Дин/см2 . Это также основывается на предположении, что буфер имеет аналогичные вязкость воды. Скорость потока затем равны 41,7 мкл/мин уравнения, используемые для вычисления скорости потока для различных размеры камеры потока могут быть найдены в:- Установка насоса снять жидкости с помощью параметра кнопка на шприцевой насос.
- Загрузить три шприцы, придает труб на шприцевый насос и плотно зафиксируйте скобки вокруг шприцы и поршни.
- Прикрепите Ввертное колено Luer для обоих концах второй 20 см кусок стерильной силиконовые трубки.
- Подключите один локоть Luer притупляются 18-иглы.
- Повторите дважды, создание трех идентичных потребление систем для трех полос движения потока камеры.
Примечание: Силиконовой трубки и Люрс можно мыть с хлоркой 10% следуют дистиллированной воды перед повторным использованием. Не рекомендуется использовать камеры потока.
7. Микроскоп параметры
- Используйте спиннинг диска микроскоп оснащен полностью автоматизированный этап. Выполняют освещения с лазерной запуска, которая обеспечивает 405, 458, 491, 543 и 633 нм лазерные линии. Захватить все изображения с целью 20 X. Настройка всех параметров с программного обеспечения для анализа (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
- Выберите настройки канала (фильтр выбросов: 520/35), с возбуждением в 491 Нм, для приобретения. Установите электрон, умножая зарядовой к электронно умножения получить 150, с временем экспозиции 200 мс, чтобы получить полный динамический диапазон.
Примечание: Тромбоциты обозначены зеленой флуоресцентные краски, DiOC6, с длиной волны Максима (возбуждение, 482 Нм; выбросов, 504 нм). - Отрегулируйте 491 Нм мощность лазера до 20%.
- Марк центр всех трех полос движения и выберите 1 мкм для z диапазон и 0,5 мкм для размера шага. Выберите число точек (то есть, продолжительность) время и время между изображениями (т.е. интервал), чтобы захватить изображение каждые 10 сек; Выберите «60 время точек» на слайд. Набор микроскоп для захвата изображений из трех полос движения и сохранять их в папке назначенных эксперимент.
Примечание: Поскольку поток палата имеет три полосы, Микроскоп нужно будет переключаться между тремя позициями для захвата изображения.
8. VWF-тромбоцитов строки формирования
- Удаление питательной среды из потока камеры (с шагом 4) используя ту же технику, как в шаге 4.4.
- 100 мкл либо гистамина (25 мкм), PMA (100 Нм), UH, HK или HR (все 25 мкг/мл) разводят в сыворотки свободной среде (как в шаге 1.4) для стимулирования боец монослоя за 15 мин при комнатной температуре и окружающего O2/CO2.
Примечание: Хотя и не обязательно для выпуска VWF, выполнение этой стимуляции при 37 ° C улучшит VWF экзоцитоз27. - Убедитесь, что один из трех отдельных полос движения потока камеры остаются необработанных как экспериментальный управления.
- Удалите средство, с помощью 1 мл шприца и заменить его на 100-200 мкл PBS мыть secretagogues офф эндотелиальной монослоя.
- Подключите камеру потока на слайд стенд с использованием сосудистых зажимов для защиты камеры в месте.
- Прикрепите доступных Luer штекер на конце трубы 70 см (подключенных к шприцу) в водохранилище палаты потока. Повторите для двух других потока камеры полос.
- Запустите шприцевый насос для удаления PBS мыть. Пипетка дополнительные PBS в сопротивляясь водохранилище камеры потока для обеспечения что полосы не работать всухую.
- Соблюдать системе потока для эквивалентных потока на всех трех полос и затем пауза шприцевой насос.
- Выберите область для захвата изображений в примерно в середине каждого Лейн, в приблизительно том же районе между экспериментов.
Примечание: Лица, действующего в Микроскоп можно ослепил в экспериментальных условиях. Этот шаг гарантирует, что Микроскоп сосредоточено до потока тромбоцитов (обратитесь к шагу 7). - Прикрепить женского luer стяжки шприц 5 мл, а затем бесплатно мужской люэровский коннектор (шаг 6.8) и погрузите притупляются иглы в 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая решение промывают тромбоцитов (шаг 5.13). Медленно нарисуйте решение тромбоцитов через трубку для обеспечения нет пузырьков воздуха в системе.
- Удалите шприц 5 мл и придаем мужской Luer открытые водохранилища палаты потока. Повторите для трех полос движения.
- Перезагрузите шприцевый насос и захвата изображения во время тромбоцитов потока с помощью микроскопа и протокол настройки от шаг 7 для 10 мин в темноте.
- После 10 минут отключите Luer от потребления труб на водохранилище камеры потока и заполнить водохранилище с PBS для поддержания потока через эндотелиальные монослоя.
9. VWF-тромбоцитов строки количественная оценка
Примечание: Непрерывный поток PBS требуется для поддержания VWF-тромбоцитов удлинение строки для анализа изображений. Прекращения потока приведет к VWF, став шаровых и нарушит VWF-тромбоцитов строки количественной оценки. Важно пополнять Каждый резервуар с PBS во время захвата изображения. HBSS можно заменить PBS, если на этом этапе наблюдается сокращение клеток или отряда.
- Начиная с первой полосе, захватить 10 изображения на слайд без перекрытия с использованием 20 X объектив середине слайда. Повторите это для каждой полосы.
Примечание: Окрестности резервуаров следует избегать из-за бурной касательное напряжение. - С помощью программного обеспечения для обработки изображений, отрегулируйте яркость, нажав кнопку «Изображения», «Настроить» и «Яркость/контрастность». Перетащите полосу прокрутки до тех пор, пока придерживался тромбоцитов может рассматриваться достаточно хорошо для количественной оценки.
- Запись строки VWF-тромбоцитов, когда три или более унифицированных тромбоцитов наблюдаются в изображении. Подсчет всех строк VWF-тромбоцитов в изображении. Повторите для всех 10 изображений и средняя для эксперимента.
Примечание: Лицо, выполняющее количественная оценка может ослепить в экспериментальных условиях. Это не необходимо совместно пятно для VWF, как это было подтверждено независимые исследования8,,2829. - Повторите эксперимент как минимум три раза для оценки каждого secretagogue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы непосредственно оценить влияние гистонами VWF освобождения из эндотелиальных клеток, мы подвергаемся вырожденная BOECs сыворотки бесплатно средних содержащие PMA (положительный контроль), UH, HR и HK за 2 ч. Мы показали, что HK индуцированной 2 раза увеличение VWF белка (VWF:Ag) в среде очищенных эндотелиальных клеток (рис. 1). Интересно, что при BOECs были стимуляции с UH и HR, там меньше VWF:Ag обнаружена в среде чем в состоянии необработанных. Мы предположили, что потому что гистонами может напрямую связывать VWF30, они могут мешать дифференциально VWF:Ag обнаружения в среде культуры. Для оценки гистона привязки VWF, мы использовали пробирного твердофазный привязки. Мы показали, что UH и HR более сильно привязаны к VWF чем HK (рис. 2), поддержка обнаружения вмешательства показал на рисунке 1.
Внеклеточные гистонами было показано для активации тромбоцитов в vitro19, и наши данные позволяют предположить, что гистонами посреднические VWF освобождения из эндотелиальных клеток. Охарактеризовать влияние гистонами VWF-тромбоцитов взаимодействия, мы использовали модель камеры потока формирования строки VWF-тромбоцитов, в котором помечены тромбоциты были увлажненную на стимулированных эндотелиальных клеток. Представитель изображения были захваченных после потока, и количество строк VWF-бляшки были количественно.
Мы отметил, что, после начала условий потока, неочищенные клетки очень мало тромбоцитов VWF строки (< 1 строку в поле обзора), в то время как гистамин и PMA-лечение клетки в среднем 2.10 и 3.10 строк, соответственно. Значительно больше VWF-тромбоцитов строки были сформированы, когда клетки были относиться с HK (3.52 строк, P = 0,019), HR (6.00 строк, P = 0,004) и UH (5,51 строк, P = 0,012). Графическое представление строки VWF-тромбоцитов показан на рисунке 3 g. Реальном времени формирования строки VWF-тромбоцитов в ответ на UH, по сравнению с необработанными клетки показано в видео 1A и B.
Эти исследования, наряду с расследования, проводимые другими группами, показывают, что гистонами28 и другие провоспалительных агентов, таких как гистамин5 и цитокины31 стимулируют секрецию VWF из эндотелиальных клеток, посредничество последующих тромбоцитов захват в пробирке. Мы продемонстрировали, что не достаточно для выяснения VWF выпуска из-за возможности гистонами связывать и секвестр VWF статические стимуляции эндотелиальных клеток. Дизайн камеры модели потока VWF выпуска и тромбоцитов адгезии был поэтому требуется более полностью характеризуют и модели в естественных условиях взаимодействия между эндотелия, VWF и тромбоцитов.
Рисунок 1: Лизин богатые гистонами индуцирует VWF релиз от культивируемых клеток эндотелия. BOECs были стимулируется с нефракционированного гистонов (UH), лизин-богатые люди (HK) и аргинин-богатые люди (HR) гистоновых фракции. HK стимулировали VWF выпуска в питательной среды. UH и HR лечения уменьшилась обнаружения VWF:Ag в среде эндотелиальных клеток относительно необработанных элемента управления (Untr). N ≥3 отдельные эксперименты были проведены. Данные представлены как средние значения ± SE. *P < 0,05, **P < 0.01, и ***P < 0,001 указывают значение по сравнению с необработанными условие. Эта цифра была изменена Михельс et al15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Привязка VWF-гистона вмешивается VWF обнаружения в Vitro. Плазма производные VWF связывает более сильно HR и UH в зависимости от дозы моды, по сравнению с гистонов (HK) Лизин-богатые люди в assay твердофазный привязки. Данные представлены как средние значения ± SE. N≥3 были проведены отдельные эксперименты. Эта цифра была изменена Михельс et al15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: гистонами посреднические VWF-тромбоцитов формирования строки. Эндотелиальные клетки посеян на камере потока слайды лечили нефракционированного гистонов (UH), лизин-богатые люди (HK), или аргинин богатые фракций гистонов (HR) или гистамин/PMA (позитивные элементы управления) и были увлажненную в сдвиге 4.45 Дин/см2 за 10 мин с промывают, дневно обозначенные тромбоцитов. Представитель изображения были получены после тромбоцитов поток из необработанной управления (A) и клетках, обработанных с гистамина (B), Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) (C), HK (D), HR (E) и (F) UH. PMA лечения привело к в среднем 3,1 строк в поле зрения, сопоставимые с гистамин. VWF-тромбоцитов строки были количественно из 10 полей подряд обзора и в среднем для n≥3 отдельных экспериментов (G). Данные представлены как средние значения ± SE. * P < 0,05 и ** P < 0.01 указывают значение по сравнению с необработанными условие. Эта цифра была изменена Михельс et al15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительного видео. Формирование строки VWF-тромбоцитов в ответ нефракционированного гистонов (2) по сравнению с No лечение (1): это видео было изменено от Михельс et al15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эти видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как физиологические актуальность VWF-тромбоцитов строк остается спорным из-за их быстрое растворение в присутствии VWF-раскалывание протеазы ADAMTS13, они служат модель количественно в vitro тромбоцитов вербовки VWF на сайт на которые могли тромба в присутствии из локализованных увеличение уровня гистон5. Кроме того, в патологии не хватает ADAMTS13 деятельности, такие как тромботических тромбоцитопеническая пурпура (ТТП) - или воспалительных микросреды - где ADAMTS13 деятельность препятствует VWF-тромбоцитов строки можно наблюдать в vivo32 и может способствовать тромбоцитов microaggregation и лейкоцитов кровоподтек, связывание гемостаза и провоспалительных функции VWF33. Наконец, он был предположил что формирование строки VWF-тромбоцитов может быть инициирующее событие в венозного или артериального тромбоза, формирование очагов, вокруг которого строится патологических тромбов.
Формирование строки VWF-тромбоцитов в системе камеры потока может использоваться для изучения WPB экзоцитоз, ADAMTS13 расщепления и тромбоцитов связывающая способность VWF. Есть несколько важных шагов для успешного выполнения этих экспериментов. Однако в зависимости от модели, изменения могут быть сделаны к протоколу.
Эндотелиальные клетки от конкретных сосудистой кровати являются разнородными в их реакции на сигналы механической и биохимических34. Поэтому, может быть полезным для выбора типа ячейки, подходит для применения этой методологии. BOECs были использованы в текущем исследовании из-за их пролиферативный потенциал; техническое обслуживание фенотипа через несколько (10 +) проходов; и надежные VWF выражение, облегчения количественной оценки VWF экзоцитоз. Другие исследователи использовали человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVECs)5,8,28 и transfected-эндотелиальные клетки (клетки человеческого эмбриона почек 293) с VWF cDNAs выражая VWD мутации35 . Было продемонстрировано, что выражение VWF значительно варьируется между ткани и судно физиологии36. Культивированный эндотелиальных клеток, вытекающих из различных микро - и macrovasculature имеют наблюдаемые различия в VWF белки базальной секреции37, и есть доказательства того, что кальций канала различия между эндотелиальных клеток подтипы влияние WPB экзоцитоз в ответ на secretagogues38.
Гистоны были использованы в этом исследовании как Роман secretagogue. Они были по сравнению с положительный контроль, гистамин, часто описывается физиологических стимуляторов VWF релиза. Элиза VWF:Ag использовался для проверки VWF освобождения из эндотелиальных клеток в статических условиях. Существует два внутриклеточных механизмов, которые вызывают освобождение VWF: высота внутриклеточного кальция39 или pf ЦАМФ уровнях40. Дифференциальный активации этих путей может быть индуцированная на secretagogues например тромбина/гистамина или адреналин/вазопрессина (или отношение к VWD, Десмопрессин), соответственно, и это может быть интересно сравнить эти два пути, с помощью этой камеры потока модель формирования строки VWF-тромбоцитов. В контексте измерители воспалительные заболевания далее поощряется разяснения биомаркеров воспалительных, например цитокинов41 или повреждение/патоген связанные молекулярные структуры (DAMPS/PAMPS), и их роли в формировании строки VWF-тромбоцитов.
Жидкости касательное напряжение имеет важное значение, когда шаровидных VWF разворачивается подвергать А1 домена привязки сайта для гликопротеина Ib тромбоцитов11. Было продемонстрировано, что минимум жидкости касательное напряжение около 0,73 Дин/см2 требуется для связывания тромбоцитов до VWF строки42. Кроме того эти строки формы на эндотелиальных клеток в относительно низких напряжений сдвига (2,5 дин/см2), но могут быть смещены на касательные напряжения 20 Дин/см2 или выше8. В ходе текущего расследования мы выбрали венозной касательное напряжение (4.45 Дин/см2), что позволило для взаимодействия между эндотелия, VWF и тромбоцитов при сохранении перфузии буфер для эксперимента 10 мин.
Для оценки ADAMTS13 расщепление VWF-тромбоцитов строк с использованием этой системы камеры потока требует увеличение аэрогидродинамических касательные напряжения через те, которые используются в этом эксперименте. Максимальная ADAMTS13 расщепление VWF-тромбоцитов строк происходит между 10 и 30 Дин/см212, диапазон, который включает в себя высокий венозной умеренной артериальной касательное напряжение43. Изменение скорости сдвига в этой системе могут быть полезны для сравнения VWF-тромбоцитов строка образования и распада, факторов в развитии венозной, артериальной или микрососудистой тромбоза.
Можно внести дополнительные изменения этой техники перфузии материал и поток камеры. Secretagogues можно применять в условиях потока напоминают в естественных условиях среды. Грунтовка с агонистами оценить их реактивность тромбоцитов или включая лейкоцита населения являются расширения этой техники. Кроме того включая терапевтические ориентации VWF multimer длины, связывающая способность тромбоцитов или реактивность тромбоцитов может прояснить важные механизмы, которые регулируют начало развития тромбов. Другие исследователи использовали либо доме44 или приобрели стекла coverslip потока камеры45, в отличие от полимерных слайды используемые в данном исследовании и кажется, чтобы получить сопоставимые результаты.
Критического рассмотрения в протоколе VWF-тромбоцитов строка является подготовка промывают тромбоцитов. Не рекомендуется использовать цельную кровь в этом протоколе связано с наличием ADAMTS13. Агенты, предотвращение активации тромбоцитов, таких как простациклин или apyrase, следует избегать, поскольку это может впоследствии отрицательно влиять адгезии тромбоцитов к VWF. Обеспечение того, что буферы были привлечены к комнатной температуре перед тромбоцитов изоляции и с помощью тщательного пипетки техники (т.е., избегая пузыри и суровых касательные напряжения) являются ключевыми для поддержания тромбоцитов в неактивном состоянии. Кроме того маркировка тромбоцитов с митохондриальных пятном, например DIOC6 или родамин 6 G, предпочтительнее мешая внеклеточных доменов, которые могут быть важны для VWF привязки. Однако как DIOC6 является проницаемой мембраны красителем, он может также быть рассмотрен в небольших количествах, эндотелиальных клеток в течение эксперимента. В отсутствие флуоресцентный Микроскоп другие исследования наблюдали VWF-тромбоцитов строк, с помощью микроскопии светлые области46.
В заключение этот поток камеры методологии формирования строки VWF-тромбоцитов может обеспечить механистической, в реальном времени данные для поддержки наблюдений в естественных условиях в патогенезе тромбоза. Как воздействия сдвига сильно влияет патофизиологические роль VWF измерители воспалительные заболевания, модель камеры потока является жизненно важным исследовательским инструментом для любой лаборатории, заинтересованных в понимании взаимодействия эндотелиальных клеток тромбоцитов в этом контекст.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Элисон Михельс является получателем Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии от канадской институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ). Лаура л Swystun является получателем стипендий КНИИЗ. Дэвид Lillicrap является получателем Канада исследований кафедры в молекулярной гемостаз. Это исследование финансировалось частично КНИИЗ действующих грантов (СС-97849).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
- Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
- Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
- Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
- Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
- Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
- Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
- Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
- Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
- Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
- Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
- Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
- Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
- Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
- Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
- Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
- Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
- Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
- Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
- Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
- Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
- Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
- Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
- Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
- Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
- Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
- Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
- Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
- Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
- Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
- De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
- Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
- Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
- Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
- Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
- Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
- Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
- Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
- Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
- Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
- Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
- De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
- Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
- Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).
