Summary
Dans cet article, nous décrivons une méthode pour évaluer endothéliales von Willebrand libération du facteur et les plaquettes suivantes de saisie sous la contrainte de cisaillement fluide en réponse à des stimuli inflammatoires à l’aide d’un système de chambre in vitro flux.
Abstract
Le facteur von Willebrand (VWF) est un facteur de coagulation de glycoprotéine multimère qui intervient dans l’adhésion des plaquettes et agrégation sur les sites des lésions endothéliales et qui transporte le facteur VIII dans la circulation. VWF est synthétisé par les cellules endothéliales et est libéré soit constitutivement dans le plasma ou est stocké dans des organites spécialisés, appelés corps de Weibel-Palade (WPBs), à la demande de libération en réponse au défi hémostatique. Procoagulant et pro-inflammatoires des stimuli peuvent induire rapidement l’exocytose WPB et libération VWF. La majorité du VWF libéré par les cellules endothéliales circule dans le plasma ; Toutefois, une proportion de VWF est ancrée à la surface des cellules endothéliales. Dans des conditions de cisaillement physiologique, endothéliales ancrées VWF peut lier aux plaquettes, formant une chaîne de VWF-plaquettaire qui peut-être représenter le nidus de la formation du thrombus. Un système de chambre de flux permet d’observer visuellement la libération de VWF des cellules endothéliales et les plaquettes ultérieures capturer de manière reproductible et adaptée à la physiopathologie de la formation du thrombus par l’intermédiaire du VWF. En utilisant cette méthode, les cellules endothéliales sont cultivés dans une chambre à flux et sont stimulés par la suite avec les sécrétagogues induire l’exocytose WPB. Plaquettes lavées sont ensuite perfusés sur l’endothélium activé. Les plaquettes sont activés et par la suite se lient à des chaînes de VWF allongées dans le sens d’écoulement du fluide. Utilisant des histones extracellulaires comme un stimulus procoagulant et pro-inflammatoires, nous avons observé de formation de chaîne de VWF-plaquettes accrue sur les cellules endothéliales histone traités par rapport aux cellules endothéliales non traitées. Ce protocole décrit une évaluation quantitative et visuelle en temps réel de l’activation des interactions de VWF-plaquettes dans des modèles de thrombose et hémostase.
Introduction
La thrombose est des principales causes de mortalité dans le monde1 et peut se développer en réponse todysregulated plaquettaire d’activation et de thrombine génération dans les deux artères veinsand. Des niveaux de plasma de VWF sont un régulateur clé de coagulation du sang, auquel cas les niveaux bas (< 50 %) causer le trouble de la coagulation dite von Willebrand disease (maladie de von Willebrand)2 et niveaux élevés (> 150 %) sont associés à un risque accru de veineux3 et thrombose artérielle4 .
VWF est une glycoprotéine multimère synthétisée par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes et stockées dans les granules α plaquettaire et WPBs, respectivement. Après provocation hémostatique, VWF peut être libéré de WPBs endothéliales pour attacher des plaquettes circulantes des cellules endothéliales activées5 ou collagène exposée sur le mur de navire6. Ancrage du VWF aux cellules endothéliales s’est avéré être médiée par la P-sélectine7 et intégrine αvβ38. La libération subséquente de plaquettes granules α magasins pouvez encore accroître les concentrations de VWF localisées pour stabiliser les interactions plaquettes plaquettes pour la formation de bouchon plaquettaire, l’échafaudage nécessaire pour la propagation de la cascade de coagulation et de la fibrine dépôts. L’activité de liaison plaquettaire du VWF est régie par sa structure multimériques, avec multimères de poids moléculaire élevé possédant une plus grande activité hémostatique9,10. En circulation, le VWF agit également comme un support pour le facteur VIII de coagulation.
Fluide de cisaillement est un régulateur essentiel de la physiologie VWF. En l’absence de contrainte de cisaillement, VWF existe sous une forme globulaire, dissimulant des domaines de liaison pour la glycoprotéine plaquettaire Ib adhérence11. Lorsque la contrainte de cisaillement est présente, le site de clivage pour une métalloprotéase, un disintegrin et métalloprotéase avec motif thrombospondine (ADAMTS13), est exposé. ADAMTS13 Clive chaînes VWF nues et décorés en plaquettes pour réguler la taille des multimères, réduisant ainsi son activité hémostatique12.
VWF est une protéine de phase aiguë, et de nombreux stimuli, notamment hypoxie13infection14et des cytokines pro-inflammatoires, auraient dû être divulgués à la médiation de sortie VWF des cellules endothéliales. Semblable à d’autres agents inflammatoires, histones extracellulaires ont également montrés pour induire la libération systémique de VWF souris15,16 et l’activation des plaquettes in vitro17,18, 19. cela a été montré à dépendre de sous-type d’histone, que les différences en lysine et teneur en arginine peut influencer la fonction15. Notre étude vise à établir une chambre à flux modèle pour étudier l’influence des riches en lysine (HK) et riches en arginine sous-types d’histone (HR) et sécrétagogues sur des rejets VWF endothéliales et des plaquettes en temps réel de capture, éventuels événements précoces l’inflammation induite par la thrombose.
Cette méthodologie de chambre de flux récapitule en vivo interactions entre collagène sous-endothélial, cellules endothéliales, du VWF et plaquettes dans un système in vitro qui est visuel, reproductible et quantifiables. Il permet l’évaluation en temps réel de tous les aspects de la voie qui régule les interactions du VWF-plaquettes, dont la sécrétion WPB, l’activation plaquettaire et protéolyse VWF. Études de VWF dans des conditions contrôlées de cisaillement ont été utilisés pour évaluer les mutations VWD qui nuisent communiqué de VWF et plaquettes-liaison fonction20, WPB physiologie21et clivage VWF par ADAMTS135. Nous utilisons cette méthode pour quantifier la formation de chaîne de VWF-plaquettes suite à un stimulus inflammatoire : histones extracellulaires.
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Protocol
Ces études ont été approuvées par University, au Canada Research Ethics Board de la Reine.
1. endothélial Stimulation
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Collagène-manteau une plaque 6 puits culture de tissus.
- 24h à l’avance, manteau une plaque 6 puits tissue culture à 37 ° C avec 1 mL de collagène de la mémoire tampon (50 µg/mL rat queue du collagène de type 1 avec l’acide acétique glacial 0,02 M).
- Laver les puits deux fois avec 2 mL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS).
NOTE : Plaques peuvent être enveloppés dans du papier d’aluminium et stockés dans un sac plastique hermétique à 4 ° C.
- Graine de cellules endothéliales à une densité de 1 x 106 cellules / puits dans 2 mL de croissance moyenne contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF). Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C (5 % CO2).
NOTE : Ici, cellules endothéliales excroissance sanguines (BOECs) entre 5 et 15 passages ont été utilisés. BOECs ont été isolés chez des volontaires sains avec une séquence VWF type sauvage en utilisant une méthode référencée dans Starke al. 22 d’une manière semblable à celle déjà décrite par JoVE23. - Retirez le support après 24h et laver les cellules avec HBSS.
- Ajouter 1 mL de milieu sans sérum (milieu de croissance essentielle minimale sans FBS) contenant phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA ; 100 nM), l’histone (UH) et HK ou HR (tous à 25 µg/mL) aux cellules pendant 2 h à 37 ° C (5 % CO2).
NOTE : Cette concentration de l’histone reposait sur les précédents rapports de cytotoxicité in vitro de Xu et al. 24 et Abrams et al. 25 utilisé 50 µg/mL. - Recueillir le milieu après 2 h et conserver à-20 ° C jusqu'à l’analyse.
2. VWF Quantification par Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
- Enduire une microplaque avec 100 µL de revêtement tampon (dipotassique chlorure de sodium de phosphate de sodium et 145 mM 10 mM, pH 7,2) contenant 10 µg/mL polyclonaux anti-VWF anticorps durant la nuit à 4 ° C.
- Laver les plaques trois fois avec 250 µL de tampon de lavage (10 mM phosphate dibasique de sodium, chlorure de sodium 500 mM et 0,1 % Tween 20, pH 7,2).
- Diluer les échantillons moyens 1:2 et 1:4 avec tampon de lavage et l’utilisation de plasma normal de référence pour une courbe d’étalonnage, partant d’un 01:10 dilution.
- Plaque de 100 µL de sérums dilués et normes pour la nuit à 4 ° C.
- Laver les plaques trois fois avec 250 µL de tampon de lavage.
- Ajouter 100 µL de dilué anti-VWF, anticorps de détection HRP conjugué (1,1 µg/µL de tampon de lavage) sur la plaque et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver la plaque et incuber pendant 10 min avec le réactif de dichlorhydrate (DPO) de O-phénylènediamine, selon les instructions du fabricant.
- Arrêter la réaction avec 100 µL de 1 M H2SO4 et lire la plaque à 492 nm.
3. phase solide Histone-VWF essai de liaison
- Enduire une microplaque histones dilués à 0,5 % sodium Désoxycholate 50 mM tampon carbonate (pH 9,6) à 10 µg/mL pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver les plaques trois fois avec 250 µL de PBS additionné de 0,1 % Tween 20, incubation pendant 10 min entre les lavages.
- Bloquer la plaque avec 200 µL de PBS additionné de 0,1 % Tween 20 et 1 % albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à température ambiante.
- Répétez l’étape 3.2.
- Diluer en série des dérivés du plasma humain du VWF/facteur VIII complexe de 200 mU/mL à 25 mU/mL dans un tampon salin (phosphate dibasique de sodium, 10 mM 500 mM chlorure de sodium et 0,1 % Tween 20, pH 7,2). Ajouter 100 µL de la plaque pendant 2 h à température ambiante.
- Répétez l’étape 3.2.
- Détecter la liaison du VWF à histone immobilisé à l’aide de 100 µL d’une solution contenant un PBS-0.1% Tween 20 et 1 : 1 000 lapin anticorps de polyclonal anti-VWF conjugué à la HRP pendant 1 h à température ambiante.
- Répétez l’étape 3.2.
- Incuber la plaque pendant 30 min avec 100 µL de réactif de la PPO et arrêter la réaction avec 100 µL de 1 M H2SO4. Mesurer la densité optique à 492 nm.
4. ensemencement des cellules endothéliales sur flux Chambers
- Charger 0,5 mL de tampon de collagène-revêtement (décrit à l’étape 2.1) dans une seringue de 1 mL Luer lock.
- Torsader l’extrémité du raccord Luer-lock de la seringue sur le réservoir d’une coulée de chambre.
- Appuyez lentement sur le piston jusqu'à ce que la voie entière est recouvert et chaque réservoir est plein. Répétez pour chaque voie et incuber la chambre à 37 ° C pendant 24 h.
- Aspirer le tampon de collagène-revêtement avec une pipette de 200 μl. Charger une autre seringue 1 ml HBSS et appuyez sur le piston lentement se laver chaque couloir de la chambre de flux. Aspirer le lavage avec une pipette de 200 μL à l’extrémité opposée de la chambre de flux. Répéter deux fois.
- Pipetter environ 100 µL d’une solution de cellules endothéliales (BOEC) 3 x 106 cellules/mL dans le milieu de croissance avec 10 % FBS dans la voie d’une chambre à flux.
Remarque : La densité de semis de cellules endothéliales dépasse la capacité de la chambre. Il s’agit d’assurer une couverture maximale de canal ; les cellules non adhérentes sont supprimés à l’étape de lavage ultérieures. - Incuber la chambre à 37 ° C pendant 24 h. changement du milieu toutes les 8-12 h à l’aide de seringues Luer-lock (comme au point 4.4). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles visibles dans les ruelles.
5. isoler les plaquettes de sang total humain
- Dans une armoire avec une aiguille de 30 G de sécurité biologique, ajouter 300 µL de tampon d’acide-citrate dextrose (citrate trisodique 85 mM, 111 mM D-glucose et 71 mM, acide citrique, pH 4,5) à un vacutainer de collecte de sang sans additif 3 mL.
- Collecter le sang de volontaires en bonne santé (aucune anti-plaquettaire et non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens pendant sept jours) par ponction veineuse (trois tubes de 3 mL de chaque), suite à un protocole semblable à celui publié par Bernardo et al.26.
- Jeter le premier tube, car les dommages de tissu initial associé à la ponction veineuse peuvent provoquer l’activation plaquettaire spontanée.
- Retourner doucement la Vacutainer trois fois pour mélanger le sang avec l’anticoagulant.
- Centrifuger le Vacutainer à 150 g pendant 15 min à 24 ° C (température ambiante).
- Retirer lentement le plasma riche en plaquettes (surnageant) avec une pipette dans une armoire de sécurité biologique et soigneusement le transférer dans un tube conique de 15 mL. Transférer le volume riche en plaquettes de chaque vacutainer dans un tube conique unique afin d’éviter les éventuel Croix-activation.
NOTE : Isolement plaquettaire doit être effectuée sous une hotte pour prévenir la contamination bactérienne et plaquettes artificielles potentiels et/ou l’activation endothéliale de sécurité biologique. - Centrifuger les tubes coniques à 900 x g pendant 10 min à 24 ° C (température ambiante) pour granuler les plaquettes.
- Pipette et jeter le surnageant pauvre en plaquettes.
- Laver le culot soigneusement avec 1 mL de tampon (CGS) de glucose-citrate de sodium (pH 7.0 120 mM chlorure de sodium, citrate de sodium de 13 mM et 30 mM D-glucose).
NOTE : Les plaquettes paraîtra dans les formations de type feu follet quand le tampon de la CGS est ajouté et le culot est resuspendu doucement. Dans les échantillons contaminés par l’activation des plaquettes, les plaquettes ne seront pas facilement remettre en suspension et apparaîtront grumeleux. - Une fois entièrement remises en suspension, centrifuger les échantillons à 900 x g pendant 10 min à 24 ° C (température ambiante).
- Retirer le tampon de lavage CGS et Resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de Tyrode (chlorure de sodium 138 mM, 5,5 mM D-glucose, 12 mM bicarbonate de sodium, chlorure de potassium de 2,9 mM et 0,36 mM phosphate dibasique de sodium, pH 7,4). Assurer la complète remise en suspension des plaquettes et, si les agrégations sont observées, jeter l’échantillon.
- Ajouter 1,5 µL d’une solution mère de DiOC6 (dissoudre 57,25 mg dans 5 mL de méthanol) de 20 mM dans chaque tube conique de 3 mL de plaquettes lavées pour une concentration finale de 1 µM.
Remarque : DIOC6 est un colorant fluorescent mitochondrial vert, utilisé dans cette expérience aux plaquettes de l’étiquette. - Aliquote 1 mL de la solution des plaquettes lavées à trois tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
Remarque : Le volume plaquettaire requis pour cette expérience est calculé selon la taille de la chambre de flux, la contrainte de cisaillement souhaitée et la durée de l’expérience (étape 6.5). Ce protocole peut être réglé que les conditions changent pour s’assurer qu’il n’y a assez de volume pour l’écoulement du fluide. - Utiliser des plaquettes lavées après 2 h d’isolement.
6. débit appareil Assemblée
- Fixez un morceau de 70 cm de tuyau (diamètre intérieur de 1,6 mm) à un connecteur Luer de coude mâle à une extrémité et un adaptateur de verrouillage Luer femelle à l’autre de silicone stérile.
- Branchez l’adaptateur de verrouillage Luer femelle attachée au tuyau à une seringue de 20 mL.
- Répétez les étapes 6.1 et 6.2 deux fois pour générer les trois raccords de seringue-conduite identiques.
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Un pousse-seringue permet de générer des flux de fluide. Entrez les paramètres suivants dans le pousse-seringue : diamètre intérieur de la seringue et le débit.
Remarque : Une seringue de 20 mL a un diamètre intérieur de 19,55 mm. Le débit est calculé sur la taux de cisaillement désiré/cisaillement et les dimensions de la chambre de flux. Pour la chambre de flux utilisée dans la présente étude, pour atteindre 1 dyn/cm2 (observées à faible cisaillement veineux), il faut un débit de 9,37 µL/min. En raison de preuves liant les histones de la thrombose veineuse profonde, un cisaillement veineux modéré de 4,45 dynes/cm2 est sélectionné. Cela repose aussi sur l’hypothèse que la mémoire tampon a une viscosité semblable à l’eau. Le débit est alors égal à 41,7 µL/min. équations permettant de calculer que le débit pour différentes dimensions de chambre de flux peut être trouvé à :- Mettre la pompe de retirer le liquide à l’aide de l’option de bouton sur le pousse-seringue.
- Charger les trois seringues attachés à un tube sur le pousse-seringue et serrez les crochets entourant les seringues et les plongeurs.
- Attacher un coude mâle Luer aux deux extrémités d’un deuxième morceau de 20 cm de tube silicone stérile.
- Connecter un coude Luer à une aiguille de calibre 18 émoussée.
- Répéter deux fois, créant trois systèmes d’admission identique pour les trois voies de la chambre de flux.
Remarque : Le tube de silicone et les Luers peuvent être lavés avec 10 % de Javel suivie de l’eau distillée avant des réutiliser. Il n’est pas recommandé de réutiliser les chambres de l’écoulement.
7. microscope paramètres
- Utiliser un microscope de disque rotatif équipé d’un stade entièrement automatisé. Réaliser un éclairage avec le lancement d’un laser qui fournit 405, 458, 491, 543 et lignes de laser 633 nm. Capturer toutes les images avec un objectif 20 X. Ajuster tous les paramètres avec le logiciel d’analyse (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
- Sélectionnez les paramètres de canal (filtre d’émission : 520/35), avec une excitation à 491 nm, pour l’acquisition. Définir l’électron multipliant dispositif à couplage de charge pour un gain d’électron-multipliant de 150, avec un temps d’exposition de 200 ms, pour obtenir la plage dynamique complète.
Remarque : Les plaquettes sont pourvus d’un colorant fluorescent vert, DiOC6, avec des maxima de longueur d’onde (excitation, 482 nm ; émission, 504 nm). - Ajuster la puissance du laser 491 nm à 20 %.
- Marquer le centre de toutes les trois voies et sélectionnez 1 μm pour la gamme z et 0,5 μm pour la taille de palier. Sélectionnez le nombre de points dans le temps (i.e., durée) et le temps entre les images (c.-à-d. dans un intervalle) pour capturer une image toutes les 10 s ; Sélectionnez « 60 points dans le temps » par diapositive. Régler le microscope à capturer des images des trois voies et les enregistrer dans un dossier désigné experiment.
Remarque : Parce que la chambre de flux a trois voies, le microscope devra alterner entre trois positions pour capturer les images.
8. du VWF-plaquettes chaîne Formation
- Retirer le milieu de culture de la chambre de flux (de l’étape 4) en utilisant la même technique qu’à l’étape 4.4.
- Ajouter 100 µL de l’histamine (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK ou HR (tous à 25 µg/mL) dilué dans un milieu sans sérum (comme dans l’étape 1.4) pour stimuler la monocouche BOEC pendant 15 min à température ambiante et ambiant O2/co2.
Remarque : Bien que pas nécessaire pour la libération VWF, effectuant cette stimulation à 37 ° C s’améliorera VWF exocytose27. - Veiller à ce que l’une des trois voies séparées de la chambre de flux restent non traitées comme un contrôle expérimental.
- Enlever le support à l’aide d’une seringue de 1 mL et remplacez-le par 100-200 µL de PBS pour laver les sécrétagogues hors de la monocouche endothéliale.
- Monter la chambre flow sur un support de diapositive à l’aide de clips vasculaires pour garantir la chambre en place.
- Attacher le Luer mâle disponible sur l’extrémité de la tubulure de 70 cm (reliée à la seringue) vers le réservoir de la chambre de flux. Répétez pour les deux autres flux chambre voies.
- Démarrer la pompe seringue pour enlever le lavage de PBS. Pipette PBS supplémentaires dans le réservoir de chambre de flux adverse pour s’assurer que les voies pas fonctionner à secs.
- Observer le système de flux pour débit équivalent à travers tous les trois voies et puis mettez en pause le pousse-seringue.
- Sélectionnez une zone pour capturer les images dans le milieu de chaque couloir, dans à peu près la même zone entre les expériences.
Remarque : La personne qui conduisait le microscope peut être aveuglée les conditions expérimentales. Cette étape garantit que le microscope se concentre avant écoulement plaquettaire (voir étape 7). - Fixez un raccord luer femelle à une seringue de 5 mL, puis au connecteur luer mâle libre (étape 6,8) et submerger l’aiguille mitigée dans le tube de microtubes de 1,5 mL contenant la solution de plaquettes lavées (point 5.13). Lentement, dessiner la solution de plaquettes par l’intermédiaire de la tubulure de n’assurer aucune bulle d’air au sein du système.
- Retirez la seringue de 5 mL et fixez le Luer mâle vers le réservoir ouvert de la chambre de flux. Répétez pour les trois voies.
- Redémarrer la pompe seringue et capturer des images durant l’écoulement de plaquettes utilise les paramètres de microscope et protocole de l’étape 7 pour 10 min dans l’obscurité.
- Après 10 min, débrancher le tuyau d’aspiration sur le réservoir de chambre de flux de la Luer et remplir le réservoir avec du PBS pour maintenir le flux au cours de la monocouche endothéliale.
9. VWF-plaquettes String Quantification
Remarque : Le flux continu de PBS est nécessaire pour maintenir l’allongement de chaîne de VWF-plaquettes pour l’analyse de l’image. Cessation de l’écoulement se traduira par le VWF devenant globulaire et compromettra quantification de chaîne de VWF-plaquettaire. Il est essentiel de compléter chaque réservoir avec du PBS lors de la capture de l’image. HBSS peut remplacer PBS si le rétrécissement de la cellule ou de détachement est observée au cours de cette étape.
- En commençant par la première voie, capturer des 10 images par lame sans chevauchement à l’aide d’une lentille d’objectif 20 X vers le milieu de la diapositive. Répétez cette procédure pour chaque voie.
Remarque : Les zones entourant les réservoirs doivent être évitées en raison de la contrainte de cisaillement turbulente. - À l’aide de logiciels de traitement d’image, régler la luminosité en cliquant sur « Image », « Adjust » et « Luminosité/contraste. » Faites glisser la barre de défilement jusqu'à ce que les plaquettes adhérentes peuvent être consultés suffisamment bien pour la quantification.
- Enregistrer une chaîne de VWF-plaquettes lorsque trois ou plusieurs plaquettes alignées sont observés dans l’image. Compter toutes les ficelles du VWF-plaquettes dans une image. Répétez pour tous les 10 images et la moyenne pour l’expérience.
Remarque : La personne qui effectue la quantification peut être aveuglée les conditions expérimentales. Il n’est pas nécessaire de colorer conjointement de VWF, comme cela a été confirmé par des études indépendantes8,28,29. - Réitérer l’expérience au moins trois fois pour évaluer chaque sécrétagogue.
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Representative Results
Pour évaluer directement l’effet des histones sur la libération VWF de cellules endothéliales, nous avons exposé BOECs anastomosés au milieu sans sérum contenant PMA (contrôle positif), UH, RH et HK pendant 2 h. Nous avons montré que HK a induit une augmentation de 2 fois en protéines VWF (VWF:Ag) au milieu des cellules endothéliales traitées (Figure 1). Fait intéressant, lorsque BOECs sont stimulées avec UH et RH, il a été moins VWF:Ag détectée dans le milieu que dans l’état non traitée. Nous avons supposé que parce que les histones peuvent lier directement à VWF30, elles risquent d’interférer différemment avec détection de VWF:Ag dans le milieu de culture. Pour évaluer la liaison histone de VWF, nous avons utilisé une analyse obligatoire de la phase solide. Nous avons montré que UH et HR lie plus fortement à la VWF que HK (Figure 2), soutenant l’interférence de détection ont démontré à la Figure 1.
Les histones extracellulaires auraient dû être divulgués pour activer les plaquettes in vitro19, et nos données suggèrent que les histones médient communiqué de VWF des cellules endothéliales. Pour caractériser l’effet des histones sur les interactions du VWF-plaquettaire, nous avons utilisé un modèle de chambre de flux de VWF-plaquettes chaîne formation où des plaquettes marquées ont été perfusés sur les cellules endothéliales stimulées. Images représentatives ont été capturée post-gaz, et le nombre de chaînes de VWF-plaquettes ont été quantifié.
Nous avons observé que, après le lancement des conditions d’écoulement, cellules non traitées avaient très peu de chaînes du VWF-plaquettes (< 1 chaîne par champ d’examen), tandis que l’histamine et les cellules traitées PMA avaient une moyenne de 2,10 à 3,10 cordes, respectivement. Significativement plus de cordes du VWF-plaquettes se sont formés lorsque les cellules ont été traitées avec HK (3,52 cordes, P = 0,019), HR (6,00 cordes, P = 0,004) et UH (5,51 cordes, P = 0,012). Une représentation graphique de la VWF-chaîne taux de plaquettes est illustrée à la Figure 3. Formation de chaîne du VWF-plaquettes en temps réel en réponse à UH par rapport aux cellules non traitées est montrée dans les vidéos 1 a et B.
Ces études, ainsi que d’enquêtes par d’autres groupes, montrent que les histones28 et autres agents pro-inflammatoires telles que l’histamine5 et cytokines31 stimulent la sécrétion de VWF des cellules endothéliales, médiation ultérieure plaquettaire capture in vitro. Nous avons démontré que la stimulation statique des cellules endothéliales ne suffisait pas à élucider communiqué de VWF en raison de la capacité des histones à lier et à séquestrer du VWF. La conception d’un modèle de chambre de flux d’adhérence de libération et les plaquettes VWF devait donc plus complètement caractériser et modéliser les interactions in vivo entre l’endothélium, du VWF et plaquettes.
Figure 1 : Histones riches en Lysine induit la libération VWF des cellules endothéliales cultivées. BOECs ont été stimulés par l’histone (UH), riche en lysine (HK) et les fractions d’histones riches en arginine (HR). HK stimule la libération VWF dans le milieu de culture. UH et HR traitement diminuent la détection des VWF:Ag dans le milieu de la cellule endothéliale par rapport aux témoins non traités de (Untr). N ≥ 3 expériences individuelles ont été réalisées. Les données sont indiquées les valeurs moyennes ± SE. *P < 0,05, **P < 0,01, et ***P < 0,001 indiquent l’importance par rapport à l’état non traitée. Ce chiffre a été modifié par Michels et al.15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Liaison VWF-histone interfère avec le VWF détection In Vitro. Dérivés du plasma VWF lie plus fortement à HR et UH de façon dose-dépendante par rapport aux histones (HK) riche en lysine dans une analyse obligatoire de la phase solide. Les données sont indiquées les valeurs moyennes ± SE. N≥3 a réalisé des expériences individuelles. Ce chiffre a été modifié par Michels et al.15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : les Histones médient Formation de chaîne de VWF-plaquettes. Les cellules endothéliales ensemencées sur chambre à flux diapositives ont été traités avec l’histone (UH), riche en lysine (HK), ou riches en arginine fractions d’histones (HR) ou l’histamine/PMA (témoins positifs) et sont perfusés sous une contrainte de cisaillement de 4,45 dynes/cm2 pour 10 min avec des plaquettes lavées, fluorescent étiquetés. Images représentatives ont été obtenus des plaquette après écoulement du témoin (A) et les cellules traitées avec l’histamine (B), Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (C), HK (D), RH (E) et UH (F). Traitement de PMA a une moyenne de 3,1 chaînes par champ de vision, comparable à l’histamine. Chaînes de VWF-plaquettes ont été quantifiés de 10 champs consécutifs examen et en moyenne pour n≥3 expériences individuelles (G). Les données sont indiquées les valeurs moyennes ± SE. * P < 0,05 et ** P < 0,01 mention portée par rapport à l’état non traitée. Ce chiffre a été modifié par Michels et al.15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéos supplémentaires. Formation de chaîne de VWF-plaquettes en réponse à Histone non fractionnée (2) comparé à aucun traitement (1) : cette vidéo a été modifiée par Michels et al.15. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces vidéos.
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Discussion
Alors que la pertinence physiologique de VWF-plaquettes cordes reste controversé en raison de leur dissolution rapide en présence de la protéase clivant de VWF ADAMTS13, ils servent de modèle quantifiables in vitro du recrutement de plaquettes de VWF vers un site au qui un thrombus peut former en présence de localisé des augmentations histone niveaux5. En outre, dans les pathologies dénuées d’ADAMTS13 telle activité comme le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) - ou dans des micro-environnements inflammatoires - lorsque l’activité ADAMTS13 est inhibée-VWF-plaquettes cordes peut être observées in vivo32 et qu’il peut contribuer à l’extravasation de microaggregation et de leucocytes plaquettaire, qui relie les fonctions hémostatique et pro-inflammatoires de VWF33. Enfin, il a émis l’hypothèse que la formation du VWF-plaquettes de chaîne peut être un événement déclencheur dans la thrombose veineuse ou artérielle, formant le nidus autour desquels s’articule un thrombus pathologique.
Formation de chaîne de VWF-plaquettaire dans le système de chambre de flux peut être utilisée pour étudier l’exocytose WPB ADAMTS13 clivage et la capacité de fixation des plaquettes de VWF. Il y a plusieurs étapes essentielles à l’exécution avec succès de ces expériences. Toutefois, selon l’application du modèle, les modifications peuvent être effectuées au protocole.
Les cellules endothéliales des lits vasculaires spécifiques sont hétérogènes dans leur réponse à des signaux mécaniques et biochimiques34. Il peut donc être utile sélectionner un type de cellule approprié pour l’application de cette méthodologie. BOECs ont été utilisés dans la présente étude en raison de leur potentiel prolifératif ; entretien du phénotype à travers plusieurs (10 +) passages ; et robuste expression de VWF, faciliter la quantification de l’exocytose VWF. Autres enquêteurs ont utilisé ombilicale humaine (HUVEC)5,8,28 des cellules endothéliales de veine et non-endothéliales (cellules rénales embryonnaires humaines 293) transfectées avec l’ADNc VWF exprimant les mutations35 de la maladie de von Willebrand . Il a été démontré qu’expression de VWF varie considérablement entre les tissus et navire physiologie36. Les cellules endothéliales cultivées découlant de différentes micro - et macrovasculature présentent des différences observables de VWF protéine sécrétion basale37, et il n’y a preuve que les différences de canal de calcium entre sous-types de cellules endothéliales influencent WPB exocytose en réponse aux sécrétagogues38.
Histones ont été utilisés dans cette étude comme un secrétagogue de roman. Ils ont été comparés pour le contrôle positif, l’histamine, un stimulant physiologique fréquemment décrit du communiqué de VWF. Un ELISA VWF:Ag a été utilisé pour vérifier la version VWF des cellules endothéliales dans des conditions statiques. Il existe deux mécanismes intracellulaires qui déclenchent la libération de VWF : l’élévation du calcium intracellulaire39 ou pf AMP cyclique niveaux40. Différentiels d’activation de ces voies peuvent être induite par sécrétagogues comme thrombine / l’histamine ou épinéphrine/vasopressine (ou pertinente à la maladie de von Willebrand, desmopressine), respectivement, et il peut être intéressant de comparer ces deux voies à l’aide de cette chambre à flux modèle de formation de chaîne de VWF-plaquettaire. Plus loin dans le contexte de la maladie thrombo-inflammatoire, élucidation des bio-marqueurs inflammatoires, tels que les cytokines41 ou profils moléculaires de dommages/micro-organismes pathogènes associés (DAMPS/PAMPS) et leur rôle dans la formation de chaîne de VWF-plaquettaire est encouragée.
Contrainte de cisaillement fluide est importante lorsque VWF globulaire se déploie pour exposer le site de liaison du domaine A1 glycoprotéine Ib sur plaquettes11. Il a été démontré qu’une contrainte de cisaillement fluide minimale d’environ 0,73 dynes/cm2 est requise pour la liaison de plaquettes de VWF chaînes42. En outre, ces forment des chaînes sur les cellules endothéliales à relativement faible des contraintes de cisaillement (2,5 dynes/cm2) mais peut être délogé à des contraintes de cisaillement de 20 dynes/cm2 ou supérieur à8. Dans la présente étude, nous avons sélectionné une contrainte de cisaillement veineuse (4,45 dynes/cm2) qui a permis aux interactions entre l’endothélium, du VWF et plaquettes tout en conservant le tampon de perfusion pour une expérience de 10 min.
Grâce à ce système de chambre de flux pour évaluer ADAMTS13 clivage de chaînes de VWF-plaquettaire doit être augmenté dans les contraintes de cisaillement fluidiques sur ceux utilisés dans cette expérience. Maximale ADAMTS13 clivage de chaînes de VWF-plaquettaire survient entre 10 et 30 dyn/cm212, une gamme qui englobe la haute veineux de la contrainte de cisaillement artérielle modérée43. Modifier la vitesse de cisaillement dans ce système peut être utile pour comparer la formation de chaîne de VWF-plaquettes et dissolution, facteurs contributifs dans le développement d’une thrombose veineuse, artérielle ou microvasculaire.
Des modifications supplémentaires de cette technique peuvent être effectuées pour le matériel de perfusion et la chambre de flux. Sécrétagogues peuvent être administrés dans des conditions d’écoulement pour ressembler à des environnements de in vivo . Amorçage des plaquettes avec des agonistes pour évaluer leur réactivité ou y compris les populations de leucocytes sont des extensions de cette technique. Par ailleurs, y compris les agents thérapeutiques ciblant les multimères longueur VWF, la capacité de fixation des plaquettes ou réactivité plaquettaire peuvent élucider les mécanismes importants qui régulent l’initiation du développement du thrombus. Autres enquêteurs ont utilisé soit interne44 ou achetés à lamelle de verre chambres flux45, par opposition à la glisse à base de polymères utilisés dans cette étude et semble obtenir des résultats comparables.
Un facteur critique dans le protocole de chaîne de VWF-plaquettaire est la préparation des plaquettes lavées. Il n’est pas recommandé d’utiliser le sang total dans le présent protocole en raison de la présence d’ADAMTS13. Agents de prévention de l’activation plaquettaire, tels que la prostacycline ou apyrase, il faut éviter, car il peut influencer plus tard défavorablement l’adhésion des plaquettes à VWF. Veiller à ce que les tampons sont ramenés à température ambiante avant l’isolement des plaquettes et utilisant des techniques de pipette prudent (c'est-à-dire, en évitant les bulles et les dures contraintes de cisaillement) sont essentielles pour maintenir les plaquettes dans leur état inactif. En outre, marquage des plaquettes avec une tache mitochondriale, tels que DIOC6 ou la rhodamine 6 G, est préféré à interférer avec les domaines extracellulaires qui peuvent être importants pour la liaison de VWF. Toutefois, comme DIOC6 est un colorant membrane perméable, elle peut également être pris en petites quantités par les cellules endothéliales au cours de l’expérience. En l’absence d’un microscope à fluorescence, d’autres études ont observé des chaînes de VWF-plaquettaire à l’aide de la microscopie lumineuse46.
En conclusion, cette méthodologie de chambre de flux de formation de chaîne de VWF-plaquettes peut fournir des données mécanistes, en temps réel pour prendre en charge en vivo observations dans la pathogenèse de la thrombose. Exposition au cisaillement fortement influence le rôle physiopathologique VWF en maladie thrombo-inflammatoire, le modèle de chambre de flux est un outil d’enquête essentiel pour n’importe quel laboratoire désireux de comprendre les interactions entre cellules endothéliales-plaquettaire dans ce contexte.
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Disclosures
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Alison Michels est un destinataire de Frederick Banting et Charles Best Canada Bourse d’études supérieures de l’instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Laura L. Swystun a reçu une bourse des IRSC. David Lillicrap est le récipiendaire d’une Chaire de recherche du Canada en hémostase moléculaire. Cette étude a été financée en partie par une subvention (MOP-97849) de fonctionnement des IRSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
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