Summary
本文介绍了一种方法来评估内皮血管性血友病因子释放和随后的血小板捕获在流体剪切应激反应的炎症刺激使用的体外流室系统。
Abstract
血管性血友病因子 (VWF) 是一种 multimeric 糖蛋白凝血因子, 介导血小板黏附和聚集在内皮损伤的部位, 并携带因子 VIII 在循环。VWF 是由内皮细胞合成的, 或者被释放组成到血浆中, 或者被储存在专门细胞器中, 称为 Weibel-Palade 体 (WPBs), 以满足止血的挑战而按需释放。促和促炎刺激能迅速诱导 WPB 胞和 VWF 释放。内皮细胞释放的大部分 VWF 在血浆中循环;然而, VWF 的一部分被锚定在内皮细胞表面。在生理剪切条件下, 内皮锚 VWF 可与血小板结合, 形成 VWF-血小板柱, 可能代表血栓形成的病灶。流室系统可用于视觉观察的释放 VWF 从内皮细胞和随后的血小板捕获的方式, 是重现性和相关的病理生理 VWF 介导的血栓形成。利用这种方法, 内皮细胞培养在流室, 并随后刺激与促诱导 WPB 胞。洗过的血小板在活化的内皮细胞上进行灌注。血小板被激活, 并随后绑定到细长的 VWF 弦的流体流向。利用胞外组蛋白作为促和促炎症刺激, 我们观察到, 与未处理的内皮细胞相比, VWF-血小板的形成与组织治疗的内皮细胞的增加有关。本议定书描述了定量的, 视觉的和 real-time 的评估, 活化的 VWF-血小板相互作用模型的血栓和止血。
Introduction
血栓形成是导致全球死亡的主要原因1 , 可以在反应 todysregulated 血小板活化和凝血酶生成两 veinsand 动脉。血浆水平 VWF 是血液凝固的一个关键的调节器, 藉以低水平 (< 50%) 导致被称为血管性血友病病 (VWD)2和高水平 (> 150%) 的出血性疾病与增加的风险静脉的3和动脉4血栓形成。
VWF 是巨和内皮细胞合成的 multimeric 糖蛋白, 分别保存在血小板α颗粒和 WPBs 中。在止血的挑战, VWF 可以释放从内皮 WPBs 到绳循环血小板的活化内皮细胞5或暴露的胶原蛋白在血管壁上的6。VWF 对内皮细胞的锚定是由 p-选择素7和整合因子αvβ38所介导的。随后释放的血小板α颗粒存储可以进一步增加局部 VWF 浓度, 稳定血小板与血小板的相互作用, 为血小板堵塞的形成, 需要支架的传播凝血叶栅和纤维蛋白沉积.VWF 的血小板结合活动受其 multimeric 结构的调节, 高分子重量体具有较大的止血活性9,10。在循环中, VWF 也充当凝血因子 VIII. 的载体。
流体剪切应力是 VWF 生理的重要调节因子。在没有剪切应力的情况下, VWF 存在于球状形态中, 为血小板糖蛋白 Ib 黏附力的粘附域11。当剪切应力存在时, 金属、整合和金属与凝血酶母模 (ADAMTS13) 的劈裂部位被暴露。ADAMTS13 克里夫斯裸和血小板修饰的 VWF 弦来调节 multimer 的大小, 从而减少其止血活性12。
VWF 是一种急性相蛋白, 许多刺激, 包括缺氧13, 感染的14, 和促炎细胞因子, 已被证明是调解 VWF 释放内皮细胞。类似于其他炎症因子, 胞外组蛋白也被证明在小鼠体内诱发全身 VWF 释放15,16和血小板活化,体外17,18, 19. 这被证明取决于组蛋白亚型, 因为赖氨酸和精氨酸含量的差异可能影响功能15。我们的研究目的是建立一个流室模型来研究富含赖氨酸 (HK) 和精氨酸 (HR) 组蛋白亚型和促对内皮 VWF 释放和 real-time 血小板捕获的影响, 潜在的早期事件炎症引起的血栓。
这种流室方法重述在体内的内胶原蛋白, 内皮细胞, VWF 和血小板之间的相互作用, 在一个体外系统, 是可视化, 重现性和可量化的。它允许对调节 VWF-血小板相互作用的通路的所有方面进行 real-time 评估, 包括 WPB 分泌、血小板活化和 VWF 蛋白水解。在受控剪应力条件下的 VWF 的研究已被用来评价 VWD 突变 , 影响 VWF 释放和血小板结合功能20, WPB 生理学21, VWF ADAMTS135。我们使用这种方法来量化 VWF-血小板串形成的结果, 炎症刺激: 胞外组蛋白。
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Protocol
这些研究得到了加拿大皇后大学研究伦理学委员会的批准。
1. 内皮细胞刺激
-
胶原蛋白涂层一个6良好的组织培养板。
- 提前24小时, 在37° c 的情况下, 用1毫升胶原蛋白缓冲液 (50 µg/mL 鼠尾胶原 1, 0.02 米冰醋酸) 涂上6层组织培养板。
- 用2毫升的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 冲洗两次井。
注: 板材可以用锡纸包裹, 并存放在4° c 的密闭塑料袋中。
- 在含有10% 胎牛血清 (FBS) 的2毫升生长培养基中, 以 1 x 106细胞的密度对内皮细胞进行种子。孵育细胞为24小时在37° c (5% CO2)。
注: 在这里, 血液的副产物内皮细胞 (BOECs) 之间的5和15的使用。BOECs 使用斯塔克et al.中引用的方法从野生 VWF 序列中分离出健康志愿者22的方式与以前由朱庇特23描述的方法类似。 - 24小时后取出培养基, 用 HBSS 冲洗细胞。
- 添加1毫升无血清培养基 (不含 FBS 的最低基本生长培养基), 含有佛波 12-酸13乙酸酯 (PMA; 100 nM), 普通组蛋白 (UH), 和 HK 或 HR (全部在25µg/毫升) 到细胞为 2 h 在37° c (5% CO2)。
注: 这种组蛋白的浓度是基于以前的体外, 由许et al.的细胞毒性报告24和艾布拉姆斯et al。25 , 使用50µg/毫升。 - 2小时后收集培养基, 并在-20 ° c 贮存, 直至分析。
2. 酶联免疫吸附试验 (ELISA) VWF 定量
- 用100µL 涂层缓冲剂 (10 毫米二元磷酸磷酸钠和145毫米氯化钠, pH 7.2), 在10° c 的夜间涂上4µg/毫升多克隆抗 VWF 抗体的微。
- 洗涤盘三次用250µL 洗涤缓冲 (10 毫米二元磷酸钠, 500 毫米氯化钠, 和0.1% 吐温 20, pH 7.2)。
- 用洗涤缓冲器稀释培养基样品1:2 和 1:4, 并使用标准曲线的普通参考等离子体, 从1:10 稀释开始。
- 100µL 稀释样品和标准隔夜在4° c。
- 洗盘三次, 用250µL 洗涤缓冲器。
- 添加100µL 稀释抗 VWF, HRP 共轭检测抗体 (1.1 µg/µL 在洗涤缓冲) 到板和孵化1小时室温。
- 根据制造商的说明, 用邻苯二胺盐酸盐 (门诊) 试剂清洗钢板并孵育10分钟。
- 停止反应与100µL 1 M H2, 因此4并且读板材在492毫微米。
3. 固相组蛋白-VWF 结合试验
- 微与组蛋白稀释在0.5% 钠胆酸50毫米碳酸盐缓冲 (pH 9.6) 到10µg/毫升过夜在4° c。
- 洗涤板三次与250µL PBS 补充0.1% 吐温 20, 孵化10分钟之间的洗涤。
- 在室温下, 用0.1% 吐温20和1% 牛血清白蛋白 (BSA) µL 200 的 PBS 为 1 h 块的平板。
- 重复步骤3.2。
- 从200亩/毫升到25亩/毫升的盐水缓冲液 (10 毫米二元磷酸磷酸钠, 500 毫米氯化钠, 0.1% 吐温 20, pH 7.2) 连续稀释血浆衍生的人 VWF/因子 VIII 复合物。在室温下, 在2小时内将100µL 添加到盘中。
- 重复步骤3.2。
- 使用100µL PBS-0.1%tween 20 和 1:1, 000 兔多克隆抗 VWF 抗体结合在室温下 1 h, 检测 VWF 对固定组蛋白的束缚。
- 重复步骤3.2。
- 孵育板为30分钟与100µL 门诊试剂和停止反应与100µL 1 M H2, 因此4。测量 492 nm 的光学密度。
4. 将内皮细胞播种到流室
- 将0.5 毫升胶原蛋白涂层缓冲液 (在步骤2.1 中描述) 装入口锁1毫升注射器。
- 将注射器的口锁末端拧到流室滑动的储水池中。
- 慢慢按压活塞, 直到整个车道被涂上, 每个蓄水池都满了。对每条车道重复, 在37° c 下孵育24小时。
- 用200μ l 吸管抽吸胶原蛋白涂层缓冲液。加载另一个注射器与1毫升 HBSS, 并按下柱塞慢慢地洗涤每个车道的流室。用200μ l 吸管在气流室的相对端吸吸洗涤液。重复两次。
- 吸管大约100µL 3 x 106细胞/mL 内皮细胞 (BOEC) 溶液在生长介质中与 10% FBS 进入流室的车道。
注: 内皮细胞的播种密度超过了腔室的容量。这是为了确保最大的渠道覆盖面;在随后的清洗步骤中移除换药单元格。 - 孵育室在37° c 为 24 h. 使用口锁注射器 (如步骤4.4 所示) 每8-12 小时更换培养基。确保车道上没有可见气泡。
5. 从人的全血中分离血小板
- 在一个30克针的生物安全柜中, 加入300µL 酸-柠檬酸葡萄糖缓冲液 (85 毫米柠檬酸三钠, 111 毫米 d-葡萄糖, 71 mm 柠檬酸, pH 4.5) 到无添加剂3毫升血液收集采血。
- 通过静脉穿刺 (每三管3毫升) 从健康志愿者 (无血小板和甾抗炎药七天) 中收集全血, 遵循与博纳博et al26所发布的协议类似的方法。
- 丢弃第一管, 因为与静脉穿刺相关的初始组织损伤会引起自发的血小板活化。
- 轻轻倒置 vacutainers 三次, 将血液与抗凝剂混合。
- 离心 vacutainers 在 150 x g 为15分钟在24° c (室温)。
- 用吸管在生物安全柜中慢慢取出富含血小板的血浆 (上清), 并小心地将其转移到15毫升的锥形管上。将每个采血的富含血小板的体积转移到单个锥形管上, 以避免潜在的 cross-activation。
注: 应在生物安全柜中进行血小板隔离, 以防止细菌污染和潜在的人工血小板和/或内皮细胞活化。 - 离心圆锥管在 900 x g 为 10 min 在24° c (室温), 以颗粒的血小板。
- 吸管和丢弃血小板--贫上清。
- 用1毫升柠檬酸-葡萄糖钠 (厘米) 缓冲液 (13 毫米柠檬酸钠, 30 毫米 d-葡萄糖, 120 毫米氯化钠, pH 7.0) 仔细清洗颗粒。
注: 当添加悬浮时, 血小板会出现在类似于一缕状的形态中, 而颗粒也会被轻轻地放在上面。在受血小板活化污染的样本中, 血小板不会轻易重, 并会出现笨。 - 一旦完全悬浮, 离心样品在 900 x g 为10分钟在24° c (室温)。
- 取出厘米洗涤缓冲液, 重3毫升 Tyrode 的缓冲液 (138 毫米氯化钠, 5.5 毫米 d-葡萄糖, 12 毫米碳酸氢钠, 2.9 毫米氯化钾, 0.36 毫米二元磷酸钠, pH 7.4)。确保血小板完全悬浮, 如果观察到聚合, 则丢弃样本。
- 添加1.5 µL 从20毫米 DiOC6 库存溶液 (溶解57.25 毫克在5毫升的甲醇) 到每3毫升锥形管洗涤血小板的最后浓度1µM。
注: DIOC6 是一种绿色荧光线粒体染料, 用于本实验中对血小板进行标记。 - 分1毫升的洗涤血小板溶液, 以三1.5 毫升离心管。
注: 本实验所需的血小板体积是根据流室的大小、所需的剪切应力和实验的长度 (步骤 6.5) 计算的。这一协议可以调整, 因为条件的变化, 以确保有足够的体积流。 - 在隔离2小时内使用冲洗过的血小板。
6. 流动装置总成
- 将一根70厘米的无菌硅胶油管 (内径1.6 毫米) 连接到男性肘部口连接一端和一个女性口锁接头。
- 将女性口锁接头连接至20毫升注射器。
- 重复步骤6.1 和6.2 两次, 以产生三相同的注射器油管连接。
-
使用注射器泵产生流体流动。输入以下设置到注射器泵浦: 注射器的内部直径和流速。
注:20 毫升注射器的内部直径为19.55 毫米。根据所需的剪切速率/剪切应力和流室的尺寸计算流量。对于当前研究中使用的流室, 要达到 1 dyn/厘米2 (在低静脉切变中观察), 需要9.37 µL/分钟的流速。由于证据连接组蛋白与静脉血栓形成, 4.45 dyn/cm2的适度静脉切变被选择。这也是基于这样的假设, 即缓冲液的粘度与水相似。流速等于41.7 µL/分钟. 用于计算不同流室尺寸的流速的公式可以在以下方面找到:- 使用注射器泵上的按钮选项设置泵来提取液体。
- 在注射器泵上装上油管的三注射器, 并在注射器和活塞周围紧紧地固定支架。
- 将男性肘口到第二20厘米的无菌硅胶管的两端。
- 连接一个肘口到一个钝的18口径针。
- 重复两次, 创造三相同的进气系统的三车道的流室。
注: 硅管和 Luers 可以用10% 漂白水冲洗后再用蒸馏水。不建议重新使用流室。
7. 显微镜设置
- 使用装有全自动舞台的旋转圆盘显微镜。执行照明与激光发射, 提供 405, 458, 491, 543, 和 633 nm 激光线。使用20X 目标捕获所有图像。使用分析软件 (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) 调整所有参数。
- 选择通道设置 (发射过滤器: 520/35), 与励磁在491毫微米, 为承购。将电子倍增电荷耦合器件设置为电子倍增增益为 150, 曝光时间为200毫秒, 以获得完整的动态数据范围。
注: 血小板被贴上绿色荧光染料, DiOC6, 波长最大值 (激发, 482 nm; 发射, 504 nm)。 - 调整 491 nm 激光功率到20%。
- 标记中心所有三车道和选择1μ m 为 z 范围和0.5 μ m 为步大小。选择每个十年代捕获图像的时间点 (即,工期) 和图像之间的时间 (即间隔) 的数量;选择每张幻灯片的 "60 时间点"。设置显微镜捕捉三车道的图像, 并将它们保存到指定的实验文件夹中。
注: 由于流室有三车道, 显微镜将需要在三位置之间切换以捕获图像。
8. VWF-血小板串形成
- 使用与步骤4.4 相同的技术, 从流程室 (从步骤 4) 中删除培养基。
- 添加100µL 或组胺 (25 µM), PMA (100 nM), UH, 香港, 或 HR (所有在25µg/毫升) 稀释无血清培养基 (如步骤 1.4), 以刺激 BOEC 单层在室温和环境 O2/CO2的15分钟。
注意: 虽然没有必要的 VWF 释放, 执行这种刺激在37° c 将改善 VWF 胞27。 - 确保流室的三条单独的车道中的一个不被作为实验性的控制。
- 使用1毫升注射器取出培养基, 用 100-200 µL 的 PBS 将其替换成内皮层的促。
- 使用血管夹将流室安装到滑动支架上, 以确保腔室到位。
- 将可用的雄性口连接器安装在 70 cm 油管 (连接到注射器) 的末端, 到流室的蓄水池。重复两个其他流室车道。
- 启动注射器泵, 除去 PBS 清洗。将额外的 PBS 移到相反的流室中, 以确保车道不会干涸。
- 观察所有三车道的等效流量流系统, 然后暂停注射器泵。
- 选择一个区域来捕捉每条车道中间的图像, 在实验之间大致相同的区域。
注意: 操作显微镜的人可以对实验条件视而不见。这一步确保显微镜是在血小板流前聚焦 (参见步骤 7)。 - 将雌性口耦合器连接到5毫升注射器, 然后到自由雄性口接头 (步骤 6.8), 并在含有洗涤血小板溶液的1.5 毫升离心管中浸入钝针 (步骤 5.13). 通过油管慢慢地绘制血小板溶液, 确保系统内没有气泡。
- 取出5毫升注射器, 并将雄性口附着在流动室的开口蓄水池上。重复三车道
- 重新启动注射器泵和捕捉图像在血小板流动期间使用显微镜和协议设置从步骤7为10分钟在黑暗中。
- 10分钟后, 将口从流动室的进水管上拔下, 并用 PBS 填充油层, 以维持流在内皮单层上。
9. VWF-血小板串量化
注: PBS 的连续流动需要保持 VWF-血小板柱伸长率以进行图像分析。停止流动将导致 VWF 成为球状, 并将损害 VWF-血小板串量化。在图像捕获过程中, 必须用 PBS 将每个水库顶起来。HBSS 可以取代 PBS, 如果细胞萎缩或分离在这一步观察。
- 从第一条车道开始, 每张幻灯片捕获10幅图像, 在幻灯片中间使用20X 物镜, 不重叠。对每个车道重复此操作。
注: 由于紊流剪应力, 应避免储层周围的区域。 - 使用图像处理软件, 通过单击 "图像"、"调整" 和 "亮度/对比度" 来调整亮度。拖动滚动条, 直到被黏附的血小板可以被看得足够好, 以量化。
- 在图像中观察到三或更多对齐的血小板时, 记录一个 VWF 的血小板串。计算图像中所有的 VWF-血小板字符串。重复所有10图像和平均值的实验。
注: 执行量化的人可以对实验条件视而不见。没有必要为 VWF co-stain, 因为这已经被独立研究证实了8,28,29。 - 重复实验至少三次, 以评估每个促。
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Representative Results
为了直接评估组蛋白对内皮细胞 VWF 释放的影响, 我们将汇合 BOECs 暴露在含有 PMA (阳性对照)、呃、HR 和 HK 2 h 的无血清培养基中。我们发现, 在治疗的内皮细胞 (图 1) 中, 香港诱导的 VWF 蛋白 (VWF: Ag) 增加了2倍。有趣的是, 当 BOECs 被刺激与 UH 和 HR, 有较少 VWF: Ag 在媒介比在未处理的情况发现了。我们假设, 由于组蛋白可以直接绑定到 VWF30, 因此它们可能会与 VWF: 培养基中的 Ag 检测有差异。为了评价组蛋白结合到 VWF, 我们采用了固相结合法。我们表明, 嗯和 HR 绑定比 HK 更强烈的 VWF (图 2), 支持在图 1中演示的检测干扰。
胞外组蛋白已被证明激活血小板在体外19, 我们的数据表明, 组蛋白介导 VWF 释放内皮细胞。为了描述组蛋白对 VWF-血小板相互作用的影响, 我们采用了 VWF-血小板串形成的流室模型, 在该细胞中, 将血小板标记在受激的内皮细胞膜上。有代表性的图像被抓获 post-flow, 和数量的 VWF 血小板字符串的量化。
我们观察到, 在开始的流动条件下, 未经处理的细胞有非常少的 VWF-血小板字符串 (< 1 字符串每个审查领域), 而组胺和 PMA 治疗细胞平均2.10 和3.10 字符串, 分别。当细胞处理 HK (3.52 字符串, p = 0.019), HR (6.00 字符串, p = 0.004), 和 UH (5.51 字符串, p = 0.012) 时, 就形成了明显更多的 VWF-血小板串。在图 3G中显示了 VWF-血小板字符串计数的图形表示形式。在视频1A 和 B中显示了与未处理的细胞相比较的实时 VWF-血小板串形成反应。
这些研究, 连同其他小组的调查显示, 组蛋白28和其他促炎剂, 如氨基酸的5和细胞因子31刺激内皮细胞的 VWF 分泌, 调解随后的血小板捕获体外。我们表明, 静态刺激内皮细胞不足以阐明 VWF 释放由于组蛋白的能力绑定和封存 VWF。因此, 需要设计一个 VWF 释放和血小板黏附的流室模型, 以便更全面地描述和模拟内皮、VWF 和血小板之间的体内相互作用。
图 1: 富含赖氨酸的组蛋白诱导培养的内皮细胞 VWF 释放.BOECs 被刺激与普通组蛋白 (UH), 赖氨酸丰富 (香港), 和精氨酸 (HR) 蛋白的分数。香港刺激 VWF 释入培养基。和 HR 治疗减少了 VWF 的检测: 在内皮细胞培养基中相对于未经处理 (Untr) 控制的 Ag。3个别实验进行。数据显示为平均值± SE. *p < 0.05, **p < 0.01, 和 ***p < 0.001 表示相对于未经处理的情况的重要性。此图已从州et al15中修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: VWF-组蛋白绑定干扰 VWF 检测体外.与富含赖氨酸 (HK) 组蛋白的固相结合法相比, 血浆衍生的 VWF 与 HR 和剂量依赖性更强。数据被显示为平均值± SE. N≥3个别实验进行。此图已从州et al15中修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 组蛋白介导 VWF-血小板串形成.在流室切片上播种的内皮细胞是用普通组蛋白 (UH)、富含赖氨酸的 (香港) 或精氨酸 (HR) 蛋白组分或组胺/PMA (阳性对照) 进行治疗, 并在 4.45 dyn/cm2的剪切应力下灌注10分钟用洗过的荧光标记的血小板有代表性的图像获得 post-platelet 流从未经处理的控制 (A) 和细胞治疗组胺 (B), 佛波 12-酸 13-乙酸酯 (PMA) (C), HK (D), HR (E), 以及 UH (F)。PMA 治疗结果平均每个领域3.1 串, 与组胺相媲美。VWF-血小板串被量化从10连续的回顾领域和平均为 n≥3单独实验 (G)。数据显示为平均值± SE. * p < 0.05 和 ** < 0.01 表明相对于未经处理的情况的重要性。此图已从州et al15中修改。请单击此处查看此图的较大版本.
补充视频。VWF-血小板串形成反应普通组蛋白 (2) 与没有治疗相比 (1):此视频已从州et al15中修改过.请单击此处下载这些视频.
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Discussion
虽然 VWF-血小板串的生理相关性仍然存在争议, 由于它们在 VWF 裂解蛋白酶 ADAMTS13 中的迅速溶解, 它们可以作为一个可量化的体外模型, 通过 VWF 的方法在现场进行血小板招募。在组蛋白水平增加的情况下, 血栓可能形成于5。此外, 在缺乏 ADAMTS13 活动的病理-如血栓性血小板减少紫癜 (或炎症环境-ADAMTS13 活动是抑制-VWF-血小板字符串可以观察到在体内32 , 并可能有助于血小板 microaggregation 和白细胞外渗, 连接 VWF33的止血和促炎症功能。最后, 推测 VWF-血小板串形成可能是静脉和/或动脉血栓形成的起始事件, 形成病灶周围的病理血栓。
VWF - 血小板串在流室系统中的形成可用于研究 WPB 胞、 ADAMTS13 和血小板结合能力的 VWF 。成功执行这些实验有几个关键步骤。但是, 根据模型的应用情况, 可以对协议进行修改。
来自特定血管床的内皮细胞在对机械和生化信号的反应中是异质的34。因此, 选择适合应用此方法的单元格类型可能很有用。BOECs 在目前的研究中因其增殖潜能而被使用;在几个 (10 以上) 通道上保持表型;和稳健的 VWF 表达, 促进 VWF 胞的量化。其他调查人员使用人脐静脉内皮细胞 (内皮)5,8,28和 non-endothelial 细胞 (人胚肾293细胞) 转染 VWF 基因表达 VWD 突变35.结果表明, VWF 表达在组织与血管生理学方面差异很大36。培养的内皮细胞由不同的微和 macrovasculature 有观察到的差异 VWF 蛋白基底分泌物37, 并有证据表明, 钙通道差异之间的内皮细胞亚型影响 WPB胞响应促38。
组蛋白作为一种新颖的促在本研究中得到应用。他们被比较了正面控制, 组胺, 一个频繁地被描述的生理刺激 VWF 发行。VWF: Ag ELISA 用于验证 VWF 释放内皮细胞在静态条件下。有两种细胞内机制触发释放 VWF: 细胞内钙的升高39或 pf 循环 AMP 级别40。这些通路的微分活化可以诱导促如凝血酶/组胺或肾上腺素/加压素 (或, 相关的 VWD, 加压), 这可能是有趣的比较这两个途径使用这个流室VWF-血小板串形成模型。在血栓炎性疾病的背景下, 进一步阐明炎症生物标志物, 如细胞因子41或损伤/病原体相关的分子模式 (抑/PAMPS), 以及它们在 VWF-血小板串形成中的作用受到鼓励。
流体剪应力是重要的, 当球状 VWF 展开暴露的 A1 域结合位点的糖蛋白 Ib 在血小板11。已证明, 在血小板与 VWF 字符串的绑定中, 需要大约 0.73 dyn/cm2的最小流体剪切应力42。此外, 这些弦在相对低剪应力 (2.5 dyn/cm2) 上形成于内皮细胞, 但可在 20 dyn/cm2或以上8的剪切应力下脱落。在目前的调查中, 我们选择了静脉切应力 (4.45 dyn/cm2), 允许在内皮, VWF 和血小板之间的相互作用, 同时保存灌注缓冲的10分钟的实验。
利用这个流室系统来评价 VWF-血小板串的 ADAMTS13 劈裂, 需要增加在本实验中使用的射流剪切应力。VWF-血小板串的最大 ADAMTS13 分裂发生在10和 30 dyn/cm212之间, 该范围包括高静脉到中度动脉切应力43。改变这个系统的剪切率可能是有用的比较 VWF-血小板形成和溶解, 促成因素的发展静脉, 动脉, 或微血管血栓形成。
这项技术的额外修改可以对灌注材料和流室进行。促可以在流条件下进行管理, 以类似于在体内环境。用激动剂启动血小板来评估其反应性或包括白细胞的数量是这种技术的延伸。此外, 包括靶向 VWF multimer 长度, 血小板结合能力, 或血小板反应性的治疗剂, 可以阐明调节血栓形成的重要机制。其他调查人员使用了 in-house44或购买的玻璃片流室45, 而不是本研究中使用的聚合物幻灯片, 并且似乎获得了类似的结果。
VWF-血小板串协议中的一个重要考虑因素是冲洗血小板的制备。由于 ADAMTS13 的存在, 建议不要在本议定书中使用全血。预防血小板活化的药物, 如前列或 apyrase, 应避免, 因为这可能会影响血小板黏附到 VWF。确保在血小板隔离之前将缓冲液带到室温, 并使用仔细的吸管技术 (即,避免气泡和苛刻的剪切应力) 是维持血小板处于不活动状态的关键。此外, 标记血小板与线粒体染色, 如 DIOC6 或罗丹明 6G, 是首选超过干扰细胞外领域, 可能是重要的 VWF 结合。然而, 由于 DIOC6 是一种膜渗透性的染料, 它也可以在实验过程中被内皮细胞少量地占用。在没有荧光显微镜的情况下, 其他的研究用明亮场显微镜观察了 VWF-血小板的字符串46。
总之, 这种流室法的 VWF-血小板串形成可以提供机械的, real-time 的数据, 以支持在体内观察的血栓形成的机制。由于接触剪切强烈影响 VWF 在血栓炎性疾病中的病理生理作用, 流室模型是任何有兴趣了解内皮细胞-血小板相互作用的实验室的重要调查工具。上下文.
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Disclosures
作者声明没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
艾莉森州是来自加拿大卫生研究院 (研究院) 的弗雷德里克班廷和查尔斯最佳加拿大研究生奖学金获得者。劳拉· l · Swystun 是研究院奖学金获得者。戴维 Lillicrap 是一个加拿大研究椅子分子止血的接受者。这项研究部分由研究院的营运补助金 (MOP-97849) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
References
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