마우스의 장내 미생물에 대한 박테리오신 효과 평가 방법
Summary
박테리오신은 다양한 생태 학적 틈새에서 미생물 다양성을 정의하는 데 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 여기서 우리는 박테리오신이 동물 모델에서 장내 미생물 구성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다.
Abstract
매우 흥미로운 질문은 소화관 미생물 군의 구성과 건강과의 관계, 특히 인구 균형 유지에 기여하는 요인과 관련된 우리의 발전 지식에 의해 발생한다. 그러나 이러한 요소를 평가할 수있는 방법은 제한되어 있습니다. 박테리오신은 많은 박테리아에 의해 생산되는 항균 펩타이드로서 식품 획득 및 / 또는 틈새 설립에 경쟁 우위를 제공 할 수 있습니다. 많은 프로 바이오 틱 젖산균 (LAB) 균주는 병원균의 번식을 막음으로써 인간 및 동물의 건강을 증진 할 수있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 그들은 박테리오신을 생산하기 때문에 면역 조절에도 사용할 수 있습니다. 그러나 박테리오신의 길항 작용은 일반적으로 박테리아가 숙주와 수백 가지의 미생물 종으로부터 다기능 영향을받는 인간과 동물의 복잡한 내장 환경에 비해 잘 정의되었지만 단순화 된 조건 하에서 실험실 생물학적 검사에 의해 결정됩니다같은 틈새 시장을 노리고있다. 이 연구는 효과를 평가할 수있는 완전하고 효율적인 절차를 설명합니다 뮤린 시스템에서 다양한 표적 특이성을 갖는 다양한 박테리오신의 연구가 진행되고있다. 박테리오신 치료 동안 미생물 구성의 변화는 조성 16S rDNA 시퀀싱을 사용하여 모니터링된다. 우리의 접근법은 박테리오신 생산자와 균체 동성 비 박테리오 신 생성 돌연변이 체 모두를 사용하는데, 후자는 박테리오신 관련이 아닌 박테리오 신 관련 변형과 박테리오 신의 변형을 구분할 수있는 능력을 부여한다. 분변 DNA 추출 및 16S rDNA 시퀀싱 방법은 일관되고 생물 정보학과 함께 박테리아 프로파일의 희미한 변화를 발견하고 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도면에서 세균 집단과 건강 지표 사이의 상관 관계를 확립하는 강력한 절차를 구성합니다. 우리의 프로토콜은 일반적이므로 호스트 마이크를 변경할 가능성이있는 다른 화합물이나 영양소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.독성 또는 유익한 효과를 연구 할 때 로비오타 조성물.
Introduction
박테리오신은 박테리아 (1, 2) 다양한 제조 항균 펩타이드이다. 이들 화합물과 생산자, 특히 LAB은, 탐구 및 식품 보존 및 의학 3에서의 응용 가능성에 대한 수십 년 동안 전 세계적으로 이용되고있다. Lactia, Enterococcus, Staphylococcus 및 Bacillus의 종을 포함하여 여러 가지 박테리오신이 중요한 병원균을 죽이는 것으로 알려져 있습니다. 일부 박테리오신은 면역 반응을 조절할 능력조차 가지고 있습니다 4 . 많은 박테리오신은 상대적으로 좁은 스펙트럼을 가지고 있는데, 이는 일부 응용 분야에서 크게 인정 받고 있습니다. 예를 들어, 일부 좁은 스펙트럼의 박테리오신은 동일한 틈새를 공유하는 공생 또는 유익한 식물상에 많은 방해없이 문제가되는 박테리아의 선택된 그룹에 대해 특정 활성을 지시하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 특히 내장 환경에서 필수적입니다.많은 유익한 미생물이 상호 작용하는 역동적 인 방식으로 5에서 성공 onment. 박테리오신은 또한 병원균, 병원균, 또는 장의 항상성을 불균형하게하는 기회 성 박테리아의 성장을 억제 할 수 있기 때문에 예방 또는 프로 바이오 틱 용도로 매우 유용합니다 6 , 7 .
그들의 성질과 물리 화학적 성질의 관점에서, 박테리오신은 구조, 표적 특이성, 작용 방식 등 이 매우 다양하기 때문에 매우 다양하다 . 대부분의 박테리오신은 시험 관내 환경에서 매우 상세하게 연구되었지만, 식품에서는 거의 시험되지 않았다 매트릭스 8 , 9 또는 생체 내에서, 예를 들어 동물 내장 6 , 10 . 시험 관내 특성은 생체 내 에서 복잡성 때문에 평가할 때 크게 다를 수 있습니다.장내 환경 및 유익한 박테리아에 대한 의도하지 않은 영향을 추정 할 수있다. 대부분의 probiotics는 LAB입니다. 그들은 호스트의 생리학에 영향을 미치는 것으로 알려진 단쇄 지방산을 비롯하여 특정 박테리아에 대한 항균성을 입증하기 위해 다양한 대사 산물을 생산합니다. 그러므로 박테리오신을 생성하는 프로 바이오 틱 균주의 경우 정상적인 미생물을 가진 건강한 동물과 같은 현실적인 분석법을 수립하는 것이 가장 좋습니다.
현재 연구에서, 우리는 건강한 마우스에 박테리오신이 다른 억제 스펙트럼을 갖는 다른 박테리오신 생산 균주의 효과를 평가할 수있는 전략을 제공한다. 우리의 전략은 비생산성 매개 효과로부터의 박테리오신 매개 효과의 분화를 가능하게하는 동위 원소 비 박테리오 신 돌연변이 체로 마우스를 먹이는 것을 포함한다. Sequencing 16S rDNA는 내장에서 박테리아 개체수의 동적 인 변화를 추적 할 수있게합니다. 하위등가 통계 분석은 박테리아 종과 박테리아 종과 측정 된 생리적 매개 변수 ( 예 : 체중, 혈청 생화학 매개 변수 등 ) 간의 상관 관계를 해독합니다. 우리는이 연구에서 제시된 프로토콜이 살아있는 동물의 박테리오신 연구 이외의 다른 프로 바이오 틱 또는 프리 바이오 틱 적용에도 적용 가능하다고 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 절차는 미생물 군에서의 변화가 건강 또는 나이와 연관되어 있는지를 결정하는 데 사용되었습니다. 프로토콜의 다른 부분은 중요하지만, 그 중에서도 대변 샘플링, 시퀀싱 및 분석 할 DNA 단편의 선택, DNA 추출 및 생물 정보 분석의 수행이 가장 중요한 포인트 일 수 있습니다. 윤리적 이유로 마우스에 스트레스를주지 말아야하고 내장에서 박테리아의 비율을 변화시키는 것으로 알?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 연구원의 EEA Grant NILS 과학 및 지속 가능성 조정 이동성 (참조 번호 : 017-ABEL-CM-2013)에 감사드립니다. CB 및 GP-M. 스페인 경제 및 경쟁력 부문 (AGL2015-70487-P)의 지원을 받았다. OCOU와 DBD는 노르웨이 생명 과학 대학 (NMBU)의 식품 과학 연구를위한 전략적 장학금 프로그램 (프로젝트 1205051025)에 의해 지원되었습니다. 우리는 동물 보호 및 샘플링에 대한 그녀의 도움으로 Inmaculada Noguera와 동물 시설에서 실험실 재료의 사용 가능성을 보장하는 데 도움을 준 Jesus Dehesa에게도 감사드립니다. 우리는 또한 통계에 관한 조언을 해주신 Lars-Gustav Snipen 교수님 께 감사드립니다.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
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