Метод оценки бактериоциновых эффектов на кишечную микробиоту мышей
Summary
Считается, что бактериоцины играют ключевую роль в определении микробного разнообразия в различных экологических нишах. Здесь мы описываем эффективную процедуру оценки того, как бактериоцины влияют на состав микробиоты кишечника на животной модели.
Abstract
Очень интригующие вопросы возникают с нашими продвигающимися знаниями о составе микробиоты кишечника и взаимоотношениями со здоровьем, особенно в отношении факторов, которые способствуют поддержанию баланса населения. Однако существуют ограниченные доступные методологии для оценки этих факторов. Бактериоцины являются антимикробными пептидами, продуцируемыми многими бактериями, которые могут принести конкурентное преимущество для получения пищи и / или создания ниши. Многие штаммы пробиотических молочнокислых бактерий (LAB) обладают большим потенциалом для развития здоровья людей и животных, предотвращая рост патогенов. Они также могут быть использованы для иммуномодуляции, поскольку они продуцируют бактериоцины. Однако антагонистическая активность бактериоцинов обычно определяется лабораторными биоанализами в четко определенных, но чрезмерно упрощенных условиях по сравнению со сложной средой кишечника у людей и животных, где бактерии сталкиваются с многофакторными влияниями хозяина и сотен микробных видов sУлавливая ту же самую нишу. В этой работе описывается полная и эффективная процедура оценки эффекта Из множества бактериоцинов с различной специфичностью мишени в мышиной системе. Изменения в составе микробиоты во время лечения бактериоцином контролируются с использованием композиционного секвенирования 16S рДНК. В нашем подходе используются как производители бактериоцина, так и их изогенные не-бактериоцин-продуцирующие мутанты, причем последний дает возможность отличать бактериоцин от не связанных с бактериоцином модификаций микробиоты. Методы секвенирования фекальной ДНК и 16S рДНК являются согласованными и вместе с биоинформатией представляют собой мощную процедуру для обнаружения слабых изменений в профилях бактерий и установления корреляций с точки зрения концентрации холестерина и триглицеридов между бактериальными популяциями и маркерами здоровья. Наш протокол является общим и может поэтому использоваться для изучения других соединений или питательных веществ с возможностью изменения микрофона хозяинаRobiota, либо при изучении токсичности, либо в положительных эффектах.
Introduction
Бактериоцины представляют собой антимикробные пептиды, продуцируемые широким спектром бактериальных видов 1 , 2 . Эти соединения и их производители, особенно LAB, были исследованы и эксплуатируются во всем мире в течение десятилетий для их потенциальных применений в области сохранения и медицины продуктов питания 3 . Известно, что несколько бактериоцинов убивают важные патогены, включая виды Listeria, Enterococcus, Staphylococcus и Bacillus . Некоторые бактериоцины даже обладают способностью модулировать иммунный ответ 4 . Многие бактериоцины имеют относительно узкие спектры, что очень ценится в некоторых применениях. Например, некоторые бактериоцины с узким спектром могут использоваться для направления специфической активности против отобранных групп проблемных бактерий без значительного беспокойства на комменсальной или полезной флоре, разделяющей одну и ту же нишу; Это особенно важно в кишечникеГде многочисленные полезные микробы процветают интерактивно и динамично 5 . Бактериоцины также очень привлекательны для профилактического или пробиотического использования, так как они могут подавлять (вызывать) рост патогенов, патобионов или оппортунистических бактерий, которые могут дисбалансить гомеостаз кишечника 6 , 7 .
С точки зрения их природы и физико-химических свойств бактериоцины очень разнообразны, поскольку они имеют разные структуры, специфичность мишени, способы действия и т. Д. Большинство бактериоцинов были изучены очень подробно в условиях in vitro , но очень немногие были протестированы в пищевых продуктах Матрицы 8 , 9 или in vivo, например, в животной кишке 6 , 10 . Свойства in vitro могут сильно различаться при оценке in vivo из-за сложности oF окружение кишечника, а также предполагаемое непреднамеренное воздействие на полезные бактерии. Большинство пробиотиков являются ЛАБ. Они производят множество других метаболитов, включая короткоцепочечные жирные кислоты, которые, как известно, влияют на физиологию хозяина, а также демонстрируют антимикробные свойства по отношению к определенным бактериям. Поэтому в случае пробиотических штаммов, которые производят бактериоцины, лучше всего установить реалистичные анализы, такие как здоровые животные с нормальной микробиотой.
В настоящем исследовании мы предлагаем стратегию, которая позволяет оценить влияние различных штаммов, продуцирующих бактериоцин, у которых бактериоцины имеют разные ингибирующие спектры, у здоровых мышей. Наша стратегия включает кормление мышей изогенными не бактериоциновыми мутантами, что позволяет дифференцировать эффекты, обусловленные бактериоцином, от эффектов, не связанных с бактериоцином. Последовательность 16S rDNA позволяет следить за динамическими изменениями бактериальной популяции в кишечнике. подпискаРавномерный статистический анализ расшифровывает корреляции между видами бактерий, а также между видами бактерий и измеренными физиологическими параметрами ( например, вес тела, биохимические параметры сыворотки и т . Д. ). Мы считаем, что протокол, представленный в этом исследовании, также применим к другим пробиотическим или пребиотическим применениям за пределами изучения бактериоцинов у живых животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедура, описанная здесь, была использована для определения того, связаны ли изменения микробиоты со здоровьем или возрастом. Различные части протокола важны, но среди них выборка фекалий, выбор фрагмента ДНК, подлежащего секвенированию и анализу, и выполнение экстракции ДНК и биоин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить EEA Grant NILS Science and Sustainability Скоординированную мобильность исследователей (ссылка 017-ABEL-CM-2013). CB и GP-M. Были поддержаны грантом AGL2015-70487-P от Министерства экономики и конкурентоспособности Испании. OCOU и DBD были поддержаны стратегической программой стипендий для исследований в области пищевых наук Норвежского университета наук о жизни (NMBU) (проект 1205051025). Мы также хотели бы поблагодарить Инмакуладу Ногуэру за ее помощь в уходе за животными и отборе проб и Иисусе Дехеса за его помощь в обеспечении доступности лабораторных материалов на объекте для животных. Мы также ценим профессора Ларса-Густава Снайпина за его совет по статистике.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. . Advances in Applied Microbiology. 54, 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait?. Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics?. Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies?. J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, &. #. 2. 1. 4. ;. C. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 – Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
