Summary
Videomicroscopy systemen worden gebruikt voor het onderzoeken van de functionele eigenschappen van geïsoleerde adipeus weefsel arteriolen in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli. Deze techniek kan worden gebruikt om te onderzoeken microvasculaire fenotypen in verschillende adipeus weefsel domeinen bij zwaarlijvige mensen.
Abstract
Terwijl obesitas nauw met de ontwikkeling van metabole en cardiovasculaire ziekte verbonden is, is weinig bekend over de mechanismen die deze processen regelen. Het hypothetische is dat pro-atherogene bemiddelaars vrijgelaten uit vetweefsel met name in samenwerking met centrale/viscerale vetmobilisering pathogene vasculaire wijzigingen, zowel lokaal als systemisch bevorderen kunnen, en het begrip dat hart-en vaatziekten kan de gevolg van vetweefsel dysfunctie blijft zich ontwikkelen. Hier beschrijven we een unieke methode van videomicroscopy waarbij de analyse van vaatverwijdende en vasoconstrictor antwoorden van intact kleine menselijke arteriolen verwijderd uit de obesitas depot van levende menselijke proefpersonen. Videomicroscopy wordt gebruikt voor het onderzoeken van de functionele eigenschappen van geïsoleerde microvessels in reactie op farmacologische of fysiologische stimuli met behulp van een druk systeem dat in vivo voorwaarden bootst. De techniek is een nuttige benadering inzicht van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die aan vasculaire dysfunctie lokaal binnen de kring van vetweefsel bijdragen. Afwijkingen in het adipeus weefsel microvasculature hebben bovendien ook verbonden met systemische ziekten. We deze techniek te onderzoeken depot-specifieke vasculaire reacties bij zwaarlijvige proefpersonen toegepast. We beoordeeld endotheel-afhankelijke vasodilatatie groeiende stroom én acetylcholine in obesitas arteriolen (50-350 µm inwendige diameter, 2-3 mm in lengte) geïsoleerd van twee verschillende obesitas depots tijdens bariatric chirurgie van dezelfde persoon. We toonden aan dat arteriolen van viscerale vet verminderde endotheel-afhankelijke vasodilatatie in vergelijking met de schepen van de subcutane depot geïsoleerd vertonen. De bevindingen suggereren dat de viscerale communicatie wordt geassocieerd met vasculaire endotheel disfunctie die relevant zijn voor de klinische observatie verhoogde viscerale vetmobilisering koppelen aan systemische ziekte mechanismen kan zijn. De videomicroscopy-techniek kan worden gebruikt om vasculaire fenotypes van verschillende vet depots onderzoeken evenals bevindingen van personen met verschillende mate van obesitas en metabole dysfunctie met elkaar vergelijken. De methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken vasculaire reacties overlangs in reactie op klinische interventies.
Introduction
Videomicroscopy is een handige techniek gebruikt om de vasomotorisch functie van kleine arteriolen verwijderd uit levende menselijke proefpersonen ex vivoonderzoeken. Ons laboratorium heeft zich gericht op ontrafeling uit kleine microvessels uit verschillende adipeus weefsel compartimenten te karakteriseren van de effecten van verschillende obesitas microenvironments op de microvasculature. Een groot voordeel van deze techniek is dat de bloedvaten van het menselijke lichaam verwijderd functioneren blijven en gemakkelijk binnen enkele minuten tot uren na biopsie kan worden onderzocht. Fysiologische omstandigheden worden geïmiteerd en stabiel Transmurale druk in de ruimte van de intraluminale via micro-glas-cannulas die veel in vivo kenmerken recapituleren gehandhaafd. 1 , 2 bovendien een betrouwbare videomicroscopy set-up met geautomatiseerde rand detectie software kunt voor zowel de kwantitatieve als de kwalitatieve beoordeling van endotheel-afhankelijke en -onafhankelijke vaatverwijdende en vasoconstrictor hoedanigheid van geïsoleerde schepen in real-time, executoriale snelle fysiologische beoordeling in reactie op fysieke en farmacologische stimuli. 3 andere microvasculaire technieken zijn ook beschikbaar, zoals draad myography die de neiging om minder tijd in beslag nemen en meten van spanning reacties op verschillende agonisten door een kracht transducer.
Ons laboratorium heeft videomicroscopy om zich te buigen over de relatie tussen obesitas en vasculaire dysfunctie, gericht op de effecten van verschillende adipeus weefsel domeinen op de therapieën worden toegepast. Centrale vetmobilisering met accumulatie van intra-abdominale visceraal vet is meest nauw gekoppeld aan adipocytokine productie, metabole dysfunctie en cardiometabolic risico. Het heeft zijn gepostuleerd dat adipeus weefsel dysfunctie met overproductie van pro-atherogene disregulatie van cytokines en adipokine zijn sterk betrokken bij deze processen, maar specifieke regelgevende moleculen en de behandeling doelstellingen grotendeels blijven onontdekt. 4 voorts, op het niveau van de lokale adipeus weefsel, de capillaire rarefaction en de verminderde perfusie zijn gekoppeld aan vetweefsel pseudohypoxia en metabole disregulatie. De hypothese dat hart-en vaatziekten mogelijk het gevolg van vetweefsel dysfunctie evolueert. Pro-atherogene bemiddelaars vrijgegeven uit vet, met name in samenwerking met centrale/viscerale vetmobilisering, waarschijnlijk bevorderen endotheel disfunctie en pathogene vasculaire veranderingen die kunnen manifesteren lokaal in de obesitas therapieën en gedetecteerd met behulp van de hierin beschreven methodologie. 5
De functionele beoordeling van geïsoleerde adipeus weefsel arteriolen is een nuttige benadering inzicht van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die aan vasculaire dysfunctie in menselijke obesitas bijdragen. Voor het onderzoek naar de mechanismen die aan vet depot-specifieke dysfunctie bijdragen, hebben we methoden te onderzoeken endotheel-afhankelijke en - onafhankelijke vasodilatory reacties van de microvasculature, en evalueren van de expressie van verschillende regelgevende kandidaten in gepaarde viscerale en onderhuidse (SC) vetweefsel specimens verkregen zwaarlijvige onderwerpen ten tijde van bariatrische chirurgie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
het protocol en de voorbeelden die hier beschreven werden goedgekeurd door Boston University School van geneeskunde institutionele Review Board (IRB, protocol #H-25644) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki. Alle onderwerpen verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming voordat deelname.
1. bereiding van de oplossingen en Micro-glas Cannulas
- voorbereiden de 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic zuur zout (HEPES) oplossing. Voor 1 liter, Los 8.059 g NaCl, 0.298 g KCl, 0.296 g MgSO 4 • 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1.081 g D-Glucose en 2.383 g HEPES zuur in 950 mL gedeïoniseerd water. Vul aan tot 1 L met gedeïoniseerd water. Breng de pH op 7.4 met NaOH. HEPES-buffer kan worden opgeslagen tot 7 dagen bij 4 ° C.
- Bereiden de 20 x zout buffervoorraad. Voor 1 liter, het toevoegen van 143,8 g NaCl, 7.0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 en 7.4 g CaCl 2 • 2 H 2 O in 900 mL gedestilleerd water. Waaruit volume aan 1 L met gedeïoniseerd water. Stockoplossing bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden de 20 x buffervoorraad. Voor 1 liter, voeg 26.8 g NaHCO 3 en 0.2 g EDTA·2H 2 O in 900 mL gedeïoniseerd water. Waaruit volume aan 1 L met gedeïoniseerd water. Stockoplossing bewaren bij 4 ° C.
- Bereid de KREBS oplossing moet worden gebruikt tijdens de fysiologische experimenten. Voor 1 liter, voeg 900 mL gedeïoniseerd water, 50 mL 20 x buffervoorraad, 50 mL 20 x zout bufferoplossing, 0.99 g D-Glucose en 0.16 g KH 2 PO 4. Breng de pH op 7.4 met behulp van HCl. Om de pH van de buffer, roer voortdurend en bedek met paraffine of continu bubble.
- Check de pH elke 20 min. maken de KREBS-oplossing vers dagelijks.
- Maken van micro-glas cannulas met een inwendige diameter van 40-240 µm met behulp van een commercieel beschikbare naald/pipet trekker. De grootte van de glazen cannulas wordt bepaald door de grootte van de inwendige diameter van geïsoleerde bloedvaten (50-350 µm). U aanschaffen micro-glas cannulas van de vooraf bepaalde grootte.
2. Bereiding van reagentia
- voorbereiden de acetylcholine (Ach, 10 -2 M, stockoplossing). Los 18.29 g in 10 mL gedeïoniseerd water. Opslaan van 1 mL aliquots van stockoplossing (10 -2 M) bij-80 ° C. Op de dag van het experiment serieel verdund te verkrijgen van de volgende concentraties van de werken: 10 -5 met 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- Bereiden de papaverine (2 x 10 -2 M, stockoplossing). Los 0.07517 g in 10 mL gedeïoniseerd water. Bereiden van 10 µL hoeveelheden van de stamoplossing en winkel op -80 ° C. serieel verdunnen om te verkrijgen van 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M op de dag van het experiment.
- Bereiden de endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, stockoplossing). Los 50 µg endothelin-1 in 1 mL van de 1% BSA/PBS. Opslaan van 1 mL aliquots van stockoplossing (2 x 10 -5 M) bij-80 ° C. Op de dag van het experiment verdund tot een concentratie van de werken van 10 -10 M op de dag van het experiment aan.
- Opslaan van reagentia in beide-20 ° C of -80 ° C, afhankelijk van type vriezer beschikbaar, maar niet langer dan 6 maanden tot.
3. Vetweefsel collectie en vaartuig voorbereiding
- werven zwaarlijvige mannen en vrouwen (index van de lichaamsmassa (BMI) ≥ 35 kg/m², leeftijd ≥ 18 jaar) ingeschreven in het programma van bariatric chirurgie aan het Boston Medical Center (BMC). Een totaal van 40 onderwerpen deelgenomen aan deze experimenten.
- Subcutane en viscerale adipeus weefselmonsters verzamelen tijdens geplande bariatrische chirurgie door de chirurg de bewerking.
- Oogst het onderhuids vetweefsel van de lagere buikwand en viscerale vet uit het Omentum majus, respectievelijk. De grootte van de steekproef van de typische vetweefsel varieert van 3-10 mg van weefsel.
- Plaats weefsels onmiddellijk in koud HEPES buffer oplossing met een pH van 7,4 en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 24 h.
Opmerking: Daarnaast obesitas arteriolen kan worden verkregen voor mager individuen ook tijdens andere soorten operaties zoals hernia reparaties of plastische chirurgie, en kan ook van het subcutane depot via trans-cutane buik vet pad biopsie biopsied < sup Class = "xref" > 6.
- Met behulp van een weefsel dissectie Microscoop, de micro-schaar en de micro-pincet, zorgvuldig verwijderen omringende vet en bindweefsel de kleine obesitas arteriolen (50-350 µm intraluminale diameter, 2-3 mm in lengte).
- Tie uit alle takken van de arteriolen met kleine nylon of zijde hechtingen vóór het cannulating op de glazen capillaire pipetten. Zorgvuldig ontleden de arteriolen omdat zelfs kleine beschadigingen van de muur arteriole zorgt ervoor dat belangrijke functionele veranderingen.
- Minimaliseren vaartuig blootstelling aan licht en warmte als het kan leiden tot vasodilatatie. Omdat het soms moeilijk worden kan te onderscheiden van de arteriolen van venules, identificeren de grootte en vlotte spier Toon van schepen door de toppen van de schepen te happen. Arteriolen zijn meestal kleiner en getuigen van meer Toon in vergelijking met venules.
- De orgel-zaal voor te bereiden. Langzaam vullen de glazen capillaire pipetten en rubber slangen met KREBS oplossing met behulp van een spuit van 10 mL.
- Zodra de rubber slang wordt gevuld en glazen capillaire pipetten zijn ondergedompeld in KREBS oplossing binnen de orgel-zaal, de arteriolen veilig op de beveiligde pipetten cannulate en binden van beide uiteinden van de arteriole met nylon of silk hechtdraad knopen zorgvuldig.
- Vullen opwaarts naar de orgel-zaal met KREBS oplossing tot 2 mL.
- Veilig de orgel-kamer op een podium met de omgekeerde Microscoop (vergroting 10 X / 0,25 doelstelling) en videocamera.
- Inschakelen de rand detectie software die stroomsgewijs wordt verzonden in real-time op een sampling-frequentie van 1 kHz (1 frame/s).
- Sluit een kant van de onder druk staande buis aan de oplossing van de KREBS gevulde druk reservoirs gratis microbellen, zoals bubbels experimentele fout kunnen invoeren. Verbind de andere kant van onder druk staande buis aan het orgel kamer.
- De KREBS oplossing gevuld druk reservoirs verbinden met de drukopnemer met schone tubing.
- Controle van intra-luminal stroom door het reguleren van de hoogte van deze twee reservoirs; dus als reservoirs worden geplaatst op dezelfde hoogte, er treedt geen intra-luminal stroom.
- Als al deze processen zijn voltooid, schakel verwarming blok en software programma om de temperatuur bij 37 ° C. continu perfuse van het schip met KREBS oplossing en beluchten met een gasmengsel van 74% stikstof, 5% CO 2 en 21% O 2 2 7 ,, 8, gedurende de gehele experimentele procedure.
- Tot de gewenste druk inside het lumen van de geïsoleerde schepen geleidelijk verhogen de intraluminale druk (5 mmHg, iedere 5 min) via de druk controle-eenheid in het deelvenster myo-interface doen in een langzaam tempo om endothelial laag schade te voorkomen.
Opmerking: Zodra de druk 60 mmHg bereikt, een 20-30 min evenwichtsinstelling periode is nodig om te stabiliseren van het vaartuig. Alle vasculaire functie studies uitgevoerd bij 60 mmHg en 37 ° C met een pH van 7,4. 7
4. Beoordeling van obesitas microvasculaire functie
Opmerking: In het algemeen, obesitas arteriole endotheel-afhankelijke vasodilatatie in reactie op fysiologische (stroom-geïnduceerde) kan worden ontlokte en farmacologische stimuli (Ach-geïnduceerde).
- Flow-gemedieerde, endotheel-afhankelijke vasodilatatie
- opnemen na drukregeling, de diameter van de obesitas arteriole in rust (Di). Dit wordt aangeduid als de rust basislijn diameter.
- Vooraf vernauwen bloedvaten ~ 55% van de rust basislijn diameter (Dp) door toevoeging van 1 µL van endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) rechtstreeks naar het bad en wacht 5 min voor effect. Herhaal dit proces totdat het bereiken van de gewenste ~ 55% vooraf staat gespannen.
- Na pre vernauwing, induceren continue stroom in de ruimte van de intraluminale van vetweefsel arteriolen, in gelijke en tegengestelde richtingen zodat een drukverschil over het vaartuig kan worden ontwikkeld zonder dat de gemiddelde intraluminale druk van de 60 mmHg.
Opmerking: bijvoorbeeld, als een reservoir omhoog 10 cm in hoogte wordt, andere één moet worden verplaatst naar beneden 10 cm te veranderen druk verlopen en dus veranderen intraluminale debiet. Desgewenst nauwkeuriger stroom tarief metingen zijn een kwantitatieve debietmeters systeem kan worden toegepast op de experimentele opstelling. - Maatregel flow-gemedieerde dilatatie 3-5 min na de inleiding van de inductie van de stroom. De niveaus van intraluminale stroming (druk verlopen) kunnen worden in het bereik van 0 - 100 cmH 2 O. verhogen elke toename van drukverschil door Δ10 cmH 2 O elke 5-6 min, tot een maximum van 100 cmH 2 O.
Opmerking: Om te induceren stabiele laminaire flow in het lumen, beide micro glas canule tipformaten moeten zijn zeer dicht bij de binnendiameter van de arteriolen; anders zal het produceren van turbulente stroming binnenkant lumen en veroorzaken ongewenste meetfouten. - Naar aanleiding van de flow-gemedieerde dilatatie beoordeling, door druk reservoirs terug te keren naar dezelfde hoogte (60 mmHg).
- Vervolgens wassen arteriole en kamer door het onmiddellijk verwijderen oplossing van kamer en vervangen door verse KREBS oplossing. Dit wordt gedaan met de nodige voorzichtigheid over de geschorste arteriole binnen de kamer niet te verstoren.
- Herhaalt dit proces 3 - 4 keer voor 20-30 min of totdat het geïsoleerde schip keert terug naar de rust basislijn diameter.
- Acetylcholine-gemedieerde, endotheel-afhankelijke, vasodilatatie
- wanneer de obesitas arteriole is teruggekeerd naar de rust basislijn diameter, vooraf samentrekken vaartuig ~ 55% door het toedienen van endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) rechtstreeks naar de bad, zoals hierboven beschreven in punt 4.1.2.
- Na pre vernauwing, opeenvolgend beheren toenemende doses (2 µL) van acetylcholine die een receptor-gemedieerde, stikstofmonoxide agonist (Ach, 10 -9 tot 10 -5 M) rechtstreeks aan het bad. Opnemen van de verandering in arteriolar diameter 5 min na toediening van elke dosis.
- Zodra het vaartuig bereikt een plateau na toediening van de laatste dosis van Ach, was het schip 3 - 4 keer met KREBS oplossing. Het toestaan van 20-30 min voor vaartuig te herstellen en terug te keren naar de rust van de diameter van de basislijn. Om te helpen handhaven van de pH in de orgel-camber, wijzigen KREBS oplossing elke 15 min.
- Broeden de arteriole met N w - nitro - l-arginine methylester (L-naam, 10 -4 M), een inhibitor van de omwenteling van stikstofoxide synthase voor 30 min, en herhaal 4.2.1 en 4.2.2 te karakteriseren de relatieve bijdrage van stikstofmonoxide aan Ach-gemedieerde vaatverwijding.
- Beoordelen endotheel-onafhankelijke vasodilatatie (vasculaire glad spierweefsel functie) en de levensvatbaarheid van het schip door een sequentiële toediening van steeds grotere doses van papaverine (10 -8 naar 10 -4 M) rechtstreeks aan het bad. Als de diameter van het vaartuig niet terugkomen, of groter zijn dan de rust diameter van de basislijn (Di) in reactie op papaverine (dat wil zeggen passende vasodilatatie), overwegen het vaartuig niet-levensvatbare en negeren van gegevenspunten.
5. Data-analyse en berekening
- berekenen de vasculaire reactiviteit. Percentage vasodilatatie voor gegevens uitdrukking rekening voor basislijn verschillen vaartuig diameter te berekenen met de volgende vergelijking gebruiken:
% vasodilatatie (DT-Dp/Di-Dp) × 100 =
waar DT is de opgenomen diameter op een bepaald tijdstip (maximaal diameter), Dp is de diameter opgenomen na toevoeging van de vasoconstrictie agent (dwz. ET-1 geïnduceerde vernauwing diameter), en Di is de diameter gemeten onmiddellijk vóór de toevoeging van de vasoconstrictie agent (rust basislijn diameter). 9 - vasodilatatie en vasoconstrictie gevoeligheid (dosis-respons) tot een agonist definiëren als de concentratie van Ach, papaverine of ET-1 dat 50% van de maximale respons (EG 50) lokt die kan worden gedefinieerd door een sigmoïdale parameter en uitgezette, zoals eerder is beschreven. 10
Opmerking: de Inter waarnemer reproduceerbaarheid studies van vasodilatatie van obesitas microvessels heeft een hoge correlatie coëfficiënt (CC) van 0,99 (n = 10 schip-experimenten) in ons laboratorium.
6. statistische analyse
- Express continue metingen als bedoel ± SEM. Deze bedrijven meestal normaal worden verdeeld. Analyseren van vasculaire reactiviteit in obesitas arteriolen door herhaald-measures two-way ANOVA.
- Vergelijken als alternatief, het gebied onder de curve (AUC) van het perceel voor de cumulatieve vasodilatatie aan de dosis-respons tussen behandelgroepen. In alle gevallen overwegen P < 0.05 statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ons laboratorium heeft gebruikt videomicroscopy om te onderzoeken van endotheel-afhankelijke en onafhankelijke vasodilatatie, evenals de vasocontractile functie van vetweefsel arteriolen geïsoleerd van subcutane en viscerale vet voor zwaarlijvige mensen. De karakteristiek van de experimentele opstelling wordt weergegeven in figuur 1A. Vetweefsel arteriolen zijn opgehangen tussen twee glazen capillaire pipetten en vastgezet met hechtingen binnen de orgel-kamer zoals weergegeven in figuur 1B. Zoals hierboven beschreven in punt 5.1, kunnen arteriolar antwoorden dan worden beoordeeld door onderzoek van het vaartuig op basislijn (figuur 2A), gevolgd door pre vernauwing met ET-1 ~ 55% van de diameter van de basislijn (figuur 2B), en vervolgens agonist-geïnduceerde Vasodilatatie en ontspanning van de vasculaire lumen als weergegeven in figuur 2C.
Wij en anderen hebben opgemerkt dat endotheel-afhankelijke vasodilatatie reacties op groeiende stroom (shear stress)11 en Ach12 aanzienlijk werden afgerond in viscerale ten opzichte van subcutane obesitas arteriolen (figuur 3A, 3B ) in menselijke obesitas. Echter, endotheel-onafhankelijke vasodilatatie in reactie op papaverine niet differentieel is gewijzigd tussen de twee depots (Figuur 3 c). Samen, deze bevindingen suggereren dat vasculaire dysfunctie in viscerale domeinen is grotendeels een gevolg van dysfunctie op het niveau van het endotheel, op zijn minst in de vroege stadia van de ziekte. Deze techniek maakt systematische analyse van vaatverwijdende reacties van intact kleine menselijke arteriolen en kan ook worden toegepast op andere toegankelijke regio's van de menselijke therapieën. De ex vivo -systeem kan worden gemanipuleerd met behulp van tal van farmacologische methoden zoals reacties op insuline als een index of vasculaire endothelial insuline resistentie6, dosis-respons studies nitroglycerine voor het testen van vasculaire glad spierweefsel laag functie. 12 biologische methoden zoals RNA silencing kunnen ook worden geïntroduceerde13 potentieel mechanistische kaders voor het begrijpen van kritische toezichthouders die vasculaire dysfunctie onder specifieke ziekten verlenen te ontwikkelen.
Figuur 1: Videomicroscopy set-up. (A) afbeelding beeltenis van de componenten van het videomicroscopy orgel kamer. (B) afbeelding van een menselijke obesitas arteriole gemonteerd tussen twee glazen capillaire pipetten in de zaal van het orgel. Vaartuig diameter verandert in reactie op de fysiologische en farmacologische stimuli die kunnen worden onderzocht en analysesoftware en een omgekeerde camera-bijlage met behulp van de gekwantificeerde gespecialiseerd in het systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeeld van microvasculaire vasodilatatie met behulp van druk videomicroscopy. (A) rust basislijn arteriolar diameter (na overdruksystemen diameter, geen agonist of stimulatie: Di) (B) vooraf vernauwde diameter (nadat ET-1 vernauwde diameter geïnduceerde: Dp), (C) Agonist-geïnduceerde verwijde diameter (nadat Ach is toegevoegd: DT). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: endotheel-afhankelijke, en -onafhankelijke vasodilatatie in onderhuids vs. viscerale obesitas arteriolen in zwaarlijvige mensen. Endotheel-afhankelijke vasodilatatie was aanzienlijk verzwakt in viscerale ten opzichte van onderhuids vetweefsel arteriolen wanneer beoordeeld door (A) verhoogd stroom (gepaarde subcutane en viscerale vaartuigen, n = 20), of (B) acetylcholine dosis respons met/zonder L-naam (gepaarde subcutane en viscerale vaartuigen, n = 16). (C) endotheel-onafhankelijke vasodilatatie niet differentieel is gewijzigd tussen viscerale en onderhuidse arteriolen wanneer beoordeeld door papaverine dosis-respons (gepaarde subcutane en viscerale vaartuigen, n = 8). * Duidt groep verschillen tussen depots; †Denotes depot-specifieke verschillen tussen acetylcholine met L-naam ten opzichte van acetylcholine alleen; NS: niet significant. Gegevens worden gepresenteerd als mean± SEM, p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dissectie en de isolatie van obesitas arteriolen uit de omliggende weefsels kunnen een tijdrovend en arbeidsintensief proces met zorgvuldige aandacht voor detail en technisch protocol. De procedure microdissection vereist zorgvuldige vaardigheden en gespecialiseerde dissectie gebruiksvoorwerpen ter voorkoming van potentiële schade aan de gladde spieren of endothelial cel lagen van de microvasculature. Zelfs kleine toevallige lekke banden in de arteriolar muur kunnen voorkomen dat intraluminale overdruksystemen en resultaten in een mislukte experiment. Bovendien, is cannulation van arteriolen met behulp van hechtingen cruciaal voor het beveiligen van de arteriolen tussen de glazen capillaire Pipetteer tips aan elk uiteinde van het schip.
Menselijke geïsoleerde microvessels kunnen ontwikkelen spontane myogenic Toon na 30-40 min van drukregeling op 60 mmHg. We vonden echter dat de menselijke obesitas arteriolen in het algemeen 50-350 µm met interne diameter van de luminal zijn relatief klein met dunne lagen van vasculaire glad spierweefsel, en zijn meestal niet ontwikkelen van belangrijke myogenic Toon in vergelijking met skeletspieren arteriolen formaat. Wij veroorzaken dus pre vernauwing van deze kleine arteriolen ET-1 vóór de blootstelling aan Vasodilatatoren gebruiken. Wij vinden dat ET-1 een voorspelbaarder vasoconstrictor reactie, oefent terwijl in sommige gevallen kan er variabiliteit in reacties op alpha-receptor agonisten zoals phenylephrine. Het is absoluut noodzakelijk om te kiezen van de juiste agonisten voor het opwekken van een gewenste ~ 55% pre vernauwing; echter is het ook cruciaal om te selecteren van de juiste hoeveelheid vooraf beklemmende agent om te voorkomen dat over de dosering en toxische schade aan het schip. Dit bereiken we door te starten met de lagere dosis van het bereik en up-titrating om uit te voeren zoals beschreven in paragraaf 4.1.2.
Arteriolen in adipeus weefsel zijn gevoelig voor de veranderingen in de pH en temperatuur; 14 daarom, is het cruciaal voor bewaking en beheersing van de juiste pH (7.4) en temperatuur (37 ° C) tijdens het experimentele proces. Terwijl videomicroscopy een strak gereguleerde temperatuur gecontroleerde systeem is, is het noodzakelijk om te controleren de pH van de oplossing van de KREBS gedurende het gehele experiment om te voorkomen dat verschuivingen resultaten kunnen vertekenen. Continu borrelen van de KREBS oplossing en vervanging van oplossing elke 15 min tijdens overdruksystemen en wassen stappen zal de pH variaties na verloop van tijd verminderen.
Terwijl videomicroscopy een handige techniek is te onderzoeken van de functionele eigenschappen van microvessels, kan de techniek heeft een grote leercurve en arbeidsintensief vooral tijdens het proces van vasculaire isolatie. Afhankelijk van het type weefsel dat is biopsied, is onze ervaring met vetweefsel microvessels gebleken dat de procedure cannulation duren een aanzienlijke hoeveelheid tijd en geduld voordat kan. Daarnaast is er een inherente tijd gevoeligheid voor de experimenten als vaartuigen buiten het lichaam de neiging om hun fysiologische en functionele eigenschappen verliest na verloop van tijd. Dus de experimenten moeten worden uitgevoerd binnen de levensvatbare venster van de schepen van minuten tot uren na chirurgische biopsie vóór uiteindelijke weefsel verval.
De klinische relevantie en de motivering van deze experimentele model met behulp van videomicroscopy voor het bestuderen van de arteriolen wordt ondersteund door ons vermogen om direct sonde pathofysiologie in intact hele segmenten van menselijke bloedvaten verwijderd uit levende onderwerpen, die kan niet worden gerepliceerd door niet-invasieve imaging. In feite, ons vermogen om direct toegang en onderzoeken van disfunctionele menselijke bloedvaten in, bijvoorbeeld een zwaarlijvige lichaam, kan ons voorzien van kansen inzicht te krijgen in de trajecten die worden differentieel gewijzigd in ziekten en ontdek roman therapeutische doelen. Bovendien gepubliceerde gegevens uit ons laboratorium en anderen die ex vivo beoordeling van obesitas arteriolar functie correlaten met in vivo systemische endothelial functie reacties weergeven in andere vasculaire bedden binnen een individu, en koppelen met cardiovasculaire risicofactoren zoals roken, hypertensie, diabetes en ontsteking. 12 , 15 , 16 hebben we ook gepubliceerde gegevens aan te tonen een significante correlatie tussen immunohistochemische bevindingen relevant zijn voor stikstofmonoxide biologie in viscerale obesitas endotheliale cellen en brachialis arteriële flow-gemedieerde vaatverwijding suggereren parallelle abnormaliteiten in adipeus en systemische circulaties. 17 gezien de systemische aard van endotheel disfunctie, wij zijn van mening dat deze techniek vertegenwoordigt een pragmatische aanpak niet alleen menselijke vaatweefsel studeren, maar mogelijk ook gebruik maken van deze methode in dieren en klinische longitudinale studies naar effecten van de behandeling te onderzoeken. Andere technieken te onderzoeken van de microvasculature zijn ook beschikbaar zoals draad myography, die de neiging om minder technisch moeilijk uit te voeren en voorziet in maatregelen voor isometrische spanning van geïsoleerde schepen naar verschillende agonisten met behulp van een kracht transducer. Terwijl deze methode ook informatie over de fysiologische eigenschappen van microvessels biedt, doet een intra-luminal druk systeem waardoor het minder geneigd om te recapituleren in vivo voorwaarden kan geen gebruik van de set-up. Een voordeel van videomicroscopy is de capaciteit voor het opwekken van een relatief constant intraluminale druk minimaliseren van veranderingen in schuintrekken in het lumen. De methode kan worden toegepast op vergelijkbare grootte microvessels in zowel mensen als dieren. 9 , 12 , 18 ten slotte opgemerkt moet worden dat een aantal verkrijgbare videomicroscopy systemen beschikbaar voor aankoop en set-up zijn; de algemene fysiologische begrippen zijn echter vrij uniform op alle platformen. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen informatie of belangenconflicten verslag.
Acknowledgments
De auteurs bedank de vrijwilligers voor hun deelname aan deze studies en de chirurgische personeel op de Boston Medical Center voor het verstrekken van vetweefsel biopsieën. Dr. Gokce wordt ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies, HL081587, HL114675 en HL126141. Dr. Farb wordt ondersteund door de NIH K23 HL135394 verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
