Summary
Videomicroscopy 시스템은 고립 된 지방 조직 arterioles 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 비만 인 간에 있는 다른 지방 조직 도메인에 microvascular 고기 검사를 사용할 수 있습니다.
Abstract
비만 대사 및 심혈 관 질환의 발전에 밀접 하 게 연결 된다, 그러나 약간이 프로세스를 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 그것은 국부 적으로 그리고 체계적으로, 중앙/내장 adiposity와 협회에서 특히 지방 조직에서 발표 프로 atherogenic 중재자 병원 성 혈관 변화를 촉진 수 있습니다 그리고 개념 심혈 관 질병이 있을 수 있습니다 가상은 지방 조직 장애의 결과 진화 하 고 있습니다. 여기, 우리는 그대로 작은 인간의 arterioles 살아있는 인간을 대상의 지방 창 고에서 제거의 vasodilator 및 vasoconstrictor 응답의 분석을 포함 하는 videomicroscopy의 독특한 방법을 설명 합니다. Videomicroscopy는 응답을 vivo에서 조건 압력된 시스템을 사용 하 여 약리학 또는 생리 적 자극으로 격리 된 microvessels의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 기술은 이상과 지방 조직 환경 내에서 로컬로 혈관 장애에 기여 하는 분자 메커니즘의 이해를 얻기 위해 유용한 방법입니다. 또한, 지방 조직 microvasculature에 이상 또한 조직의 질병으로 연결 되었습니다. 우리는 뚱뚱한 주제에 있는 창 고 전용 혈관 응답 검사에이 기술을 적용. 우리는 증가 흐름을 두 개의 서로 다른 많은 플랫폼에서 동일한 개인에서 bariatric 수술 동안 격리 지방 arterioles (50-350 µ m 내부 직경, 길이 2-3 m m)에서 아 세 틸 콜린 endothelium 종속 엷게 평가. 우리는 내장 지방에서 arterioles 피하 창 고에서 고립 된 선박에 비해 장애인된 endothelium 종속 엷게 전시 시연 했다. 연구 결과 내장 microenvironment는 조직의 질환 메커니즘을 증가 내장 adiposity를 연결 하는 임상 관측에 관련 될 수 있는 혈관 내 피 기능 장애와 관련 된 것이 좋습니다. Videomicroscopy 기술은 다른 지방 창 고에서 관 고기 검사 하 고 결과 비교 하 여 비만 대사 장애의 다른 정도 가진 개인에 걸쳐 사용할 수 있습니다. 메서드 또한 임상 내정간섭에 응답에 경도 혈관 반응 검사를 사용할 수 있습니다.
Introduction
Videomicroscopy 작은 arterioles 생활 인체 ex vivo에서제거의 조절과 기능 검사를 활용 하는 유용한 기술입니다. 우리 연구소는 microvasculature에 다양 한 많은 microenvironments의 효과 특성을 다른 지방 조직 구획에서 작은 microvessels에 밖으로 해 부에 집중 했다. 이 기술의 주요 장점은 인체에서 제거 하는 혈관 기능 유지와 생 시간을 몇 분 안에 쉽게 시험 될 수 있다. 생리 적인 조건 유사 하 고 과거 압력 마이크로 유리 뉼 많은 비보에 특성을 정리를 통해 intraluminal 공간에서 유지 관리를 꾸준히. 1 , 2 또한, 자동된 가장자리 감지 소프트웨어와 신뢰할 수 있는 videomicroscopy 설정 endothelium 종속-독립적인 vasodilator 및 vasoconstrictor 용량 절연의 질적 및 양적 평가 대 한 허용 물리적 및 약리 자극에 대 한 응답에서 실시간, 허용 빠른 생리 적 평가에서 선박. 3 다른 microvascular 기법 와이어 myography 적은 시간이 소요 되며 힘 변환기에 의해 다양 한 agonists 긴장 응답을 측정 하는 경향이 사용할 수 있습니다.
본 연구실은 비만는 맥 관 구조에 다른 지방 조직 도메인의 효과에 초점을 맞추고 혈관 부전 사이의 관계를 검사 하는 videomicroscopy를 적용 하 고 있다. 내부-복 부 내장 지방의 축적으로 중앙 adiposity adipocytokine 생산, 대사 장애, 및 cardiometabolic 위험에 가장 밀접 하 게 연결 되었습니다. 프로 atherogenic cytokines 및 adipokine dysregulation의 과잉 생산으로 지방 조직 장애는 이러한 프로세스에 연루 강력 하지만 특정 규제 분자 및 치료 목표는 크게 남아 postulated이 되었습니다. 알려지지 않은. 4 또한, 현지 지방 조직 수준, 모 세관 진공 및 장애인된 관류에 지방 조직 pseudohypoxia 및 대사 dysregulation 연결 되었습니다. 심혈 관 질환 지방 조직 장애의 결과 수 있습니다 가설 진화입니다. 지방에서 특히 중앙/내장 adiposity, 가능성이 함께 협회에서에서 발표 하는 프로 atherogenic 중재자 홍보 내 피 기능 장애 및 병원 성 혈관 변화 될 수 있는 많은 맥 관 구조에 로컬로 명단 및 사용 하 여 검출 된 여기에 방법을 설명합니다. 5
고립 된 지방 조직 arterioles의 기능 평가 이상과 인간의 비만에 혈관 장애에 기여 하는 분자 메커니즘의 이해를 얻기 위해 유용한 방법입니다. 지방 서비스 센터 관련 장애에 기여 하는 메커니즘을 조사, endothelium 종속을 검사 하는 방법을 개발 했습니다 및-microvasculature의 독립적인 vasodilatory 응답 각종 규제의 식을 평가 하 고 bariatric 수술의 때에 뚱뚱한 과목에서 얻은 내장과 피하 (SC) 지방 조직 표본 쌍된에 후보자.
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Protocol
프로토콜 및 여기에 설명 된 예제에서 보스톤 대학 학교의 약 기관 검토 위원회 (IRB, 프로토콜 #H-25644)를 승인 했다 고 헬싱키 선언에 따라 실시 했다. 참여 하기 전에 서 면된 동의 제공 하는 모든 과목.
1. 솔루션의 준비 및 마이크로 유리 뉼
- 준비 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic 산 성 염 (HEPES) 솔루션. 1 L에 대 한 8.059 g, NaCl 0.298 g, KCl 0.296 g MgSO 4 분해 • 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 포 4, 950 mL에 0.01 g EDTA, 1.081 g D-포도 당, 및 2.383 g HEPES 산 이온 물입니다. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. PH를 7.4 NaOH를 사용 하 여 조정 합니다. HEPES 버퍼 7 일 4에서 저장 될 수 있다 ° c.
- 소금 버퍼 재고 x 20을 준비합니다. 1 L에 대 한 추가 143.8 g NaCl, KCl 7.0 g, 5.9 g MgSO 4 및 7.4 g CaCl 2 • 2 H 2 O 900 mL의 증류수에. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. 4 재고 솔루션을 저장 ° c.
- 버퍼 재고 x 20을 준비합니다. 1 L 26.8 g NaHCO 3 및 0.2 g EDTA·2H 2 O 이온된 물 900 mL에 추가 합니다. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. 4 재고 솔루션을 저장 ° c.
- 생리 실험 동안 사용할 KREBS 솔루션을 준비 합니다. 1 L, 이온된 물 900 mL, 버퍼 재고 x 20의 50 mL, 50 mL 소금 버퍼 솔루션, 0.99 g D-포도 당 및 0.16 g KH 2 포 4 x 20의 추가. PH를 7.4 HCl을 사용 하 여 조정 합니다. 버퍼의 pH를 유지 하려면 지속적으로 저 어와 파라핀으로 또는 지속적으로 거품.
- 확인 전화 20 분 마다 매일 KREBS 솔루션 신선한 게.
- 마이크로 유리 뉼 상용 바늘/피 펫 끌어당기는 사람을 사용 하 여 40-240 µ m의 내부 직경을 확인. 유리 뉼의 크기는 고립 된 혈관 (50-350 µ m)의 내부 직경의 크기에 의해 결정 됩니다. 또는, 미리 정해진된 크기의 마이크로-유리 뉼 구입.
2. 시 약의 준비
- 준비 아 세 틸 콜린 (Ach, 10 -2 M, 재고 솔루션). 18.29 g 10 mL 이온된 물에 용 해. 1 mL aliquots-80 ° c.에 재고 솔루션 (10 -2 M)의 저장 다음 작업 농도를 연속적으로 희석 실험의 날: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- Papaverine (2 x 10 -2 M, 재고 솔루션)를 준비합니다. 0.07517 g 10 mL 이온된 물에 용 해. 준비 재고 솔루션 및 저장소-80에 10 µ L aliquots ° C. 직렬 실험의 하루에 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M를 희석.
- 는 Endothelin 1 (외 1, 2 x 10 -5 M, 재고 솔루션)를 준비합니다. 1%의 1 mL에 50 µ g endothelin-1 녹 BSA/PBS. 1 mL aliquots-80 ° c.에 재고 솔루션 (2 x 10 -5 M)의 저장 실험 실험의 하루에 10 -10 M의 작업 농도를 희석의 날.
- 시 약 중-20 ° C에 저장 또는 냉장고의 종류에 따라 사용할 수 있는, 하지만 하지 6 개월 이상-80 ° C까지.
3. 지방 조직 수집 및 선박 준비
- 모집 비만 남자와 여자 (몸 질량 색인 (BMI) ≥ 35 k g/m ², 나이 ≥ 18 년) 보스톤 의료 센터 (BMC)에서 비만 수술 프로그램에 등록. 40 과목의 총이이 실험에 참가 했다.
- 계획된 bariatric 수술 하는 동안 작업을 수행 하는 외과 의사에 의해 피하와 내장 지방 조직 샘플을 수집.
- 수확은 피하 지방 조직을 더 낮은 복 부 벽에서 내장 지방 그레이터 omentum에서 각각. 전형적인 지방 조직 샘플 크기 3-10 mg의 조직에서 변화 한다.
- 장소 조직을 즉시 차가운 HEPES 버퍼 ph 7.4와 최대 24 h. 4 ° C에서 저장소 솔루션
참고: 또한, 지방 arterioles 다른 유형의 헤 르 니 아 수리 등 성형 수술, 수술 중 뿐만 아니라 마른 개인에서 얻어질 수 있다 그리고 또한 수 트랜스 피부 복 부 지방 패드 생 검을 통해 피하 디포에서 biopsied < sup 클래스 = "외부 참조" > 6.
- 주변 지방과 결합 조직 (50-350 µ m intraluminal 직경, 길이 2-3 m m) 작은 지방 arterioles에서 제거 신중 하 게 조직 해 부 현미경, 마이크로-가 위 및 마이크로 집게를 사용 하 여,.
- Arterioles 유리 모 세관 펫에 cannulating 전에 작은 나일론 또는 실크 봉합을 사용 하 여에 모든 지점에서 넥타이. 신중 하 게 해 부하는 arterioles 되 벽의 사소한 손상 원인 중요 한 기능 변경 이후.
빛과 열으로
- 최소화 배 노출 혈관 확장을 일으킬 수 있습니다. 그것은 때로는 어려울 수 있습니다 venules arterioles 구별, 이후 혈관의 끝 물에 의해 혈관의 크기 및 평활 근 음색을 식별 합니다. Arterioles는 일반적으로 더 작은 이며 venules에 비해 더 큰 톤.
- 기관 챔버 준비. 천천히 KREBS 솔루션 10 mL 주사기를 사용 하 여 유리 모 세관 펫 및 고무 튜브를 작성.
- 고무 튜브 채워지고 유리 모 세관 펫 챔버 내에 장기 KREBS 솔루션에 잠긴, 일단 안전 하 게 보안된 펫에 arterioles cannulate와 나일론 되의 두 끝을 묶어 또는 실크 봉합 사 매듭 신중 하 게.
- KREBS 솔루션과 장기 챔버를 채워 최대 2 mL.
- 거꾸로 현미경 (배율 10 배 / 0.25 목표)와 함께 무대에 기관 실 확보 및 비디오 카메라.
- 1 kHz의 샘플링 레이트에서 실시간에 스트리밍 가장자리 탐지 소프트웨어에 설정 (1 프레임/초).
- 연결할 가압된 튜브의 한쪽 채워진된 압력 저수지 microbubbles, 무료로 KREBS 솔루션으로 거품 실험 오류를 발생할 수 있습니다. 기관 실에 가압된 튜브의 다른 쪽을 연결.
- 깨끗 한 배관 압력 트랜스듀서에 KREBS 솔루션 가득 압력 저수지를 연결.
- 제어이 두 저수지의 높이 조절 하 여 내부 luminal 흐름; 따라서 때 저수지에 배치 됩니다 같은 높이, 아니 내 luminal 흐름 발생 합니다.
- 이러한 모든 프로세스가 완료 되 면 설정 37에 온도 유지 하기 위해 블록 및 소프트웨어 프로그램을 난방 ° C. 지속적으로 perfuse KREBS 솔루션과 선박 및 5% CO 2, 21% O 2와 N 74%의 가스 혼합 aerate 2 전체 실험 절차에 걸쳐 7 , 8.
- 원하는 압력 insi 달성 하기드의 격리 된 선박 루멘 점차적으로 압력 제어 장치 묘 인터페이스 패널에서 내 피 층 손상을 방지 하기 위해 느린 속도로 이렇게 통해 intraluminal 압력 (5 mmHg, 매 5 분)를 증가.
참고: 압력 60 mmHg에 도달 하면, 20-30 분 평형 기간 필요 선박 안정 합니다. 모든 혈관 기능 연구 60 mmHg, pH 7.4에서 37 ° C에서 수행 됩니다. 7
4. 지방 Microvascular 함수의 평가
참고: 일반적으로, 많은 되 종속 내 피 혈관 확장 (흐름 유도)에 생리 적인 응답에 elicited 수 및 약리 자극 (Ach 유도).
- 흐름 중재, 종속 내 피 혈관 확장
- 가압, 다음 나머지 (디)에서 지방 되의 직경을 기록. 이 휴식 기준 직경으로 불린다.
- 미리 endothelin 1의 1 µ L을 추가 하 여 ~ 55% 휴식 기준 직경 (Dp)의 혈관을 수축 (동부 표준시-1, 10 − 10 M) 목욕 및 효과 대 일 분 대기에 직접. 상태를 막혀서 미리 원하는 ~ 55%에 도달 될 때까지이 과정을 반복.
- 압력 차이 평균 intraluminal 압력을 변경 하지 않고 선박에 걸쳐 개발 될 수 있도록 유도 지방 조직 arterioles, 평등 하 고 반대 방향의 intraluminal 공간으로 연속 흐름을 사전 수축, 다음 60 mmHg의.
참고: 예를 들어 한 저수지 높이 10 cm에 의해 이동 하는 경우 다른 하나 필요를 압력 기울기를 변경 하 고 따라서 intraluminal 유량 변경 10 cm에 의해 이동 해야 합니다. 더 정확한 흐름 속도 측정 바란다면 양적 유량 시스템 실험 설정에 적용할 수 있습니다. - 흐름 중재 팽창 측정 흐름 유도의 개시 후 3-5 분. Intraluminal 흐름 (압력 기온 변화도)의 수준 수 범위의 0-100 cmH 2 오 증가 압력 기온 변화도의 각 증가 Δ10 cmH 2 O 100 cmH 2 오의 최대 5-6 분 마다
참고: 안정 층 류는 루멘에서 유도 하기 위하여 두 마이크로 유리 정 팁 크기 필요가 arterioles;의 내부 직경에 매우 가까울 그렇지 않으면, 루멘 내의 난 류를 생산 하 고 원치 않는 측정 오류를 유발. - 흐름-중재 팽창 평가, 다음 돌아가기 압력 저수지 같은 높이 (60 mmHg).
- 그런 다음 즉시 상공에서 솔루션을 제거 하 여 되 고 챔버를 세척 하 고 신선한 KREBS 솔루션으로 대체. 이 챔버 내에 중단된 되는 방해 하지 않는 만큼 주의 이루어집니다.
- 3-4 회 20-30 분, 또는 격리 된 선박 휴식 기준 지름에 반환 될 때까지이 과정을 반복.
- 중재 하는 아 세 틸 콜린, 내 피-종속, 엷게
- 지방 되는 휴식 기준 직경에 반환은, 미리 수축 endothelin-1 (동부 표준시-1, 10 를 투여 하 여 배 ~ 55% − 10 M) 위의 섹션에서에서 설명한 대로 4.1.2 목욕에 직접.
- 사전 수축에 따라 순차적으로 수용 체 중재 하는, 산화 질소 주 작동 근 (Ach, 10 -5 M에 10 -9) 직접 목욕 하는 아 세 틸 콜린의 증가 복용량 (2 µ L)를 관리. 각 복용량의 관리 후 arteriolar 직경 5 분에 있는 변화를 기록.
- 배 최종 Ach 복용량의 관리를 다음 대 지에 도달 했습니다 일단 워시는 용기 3-4 회 KREBS 솔루션. 복구 하 고 초기 직경 휴식을 반환 선박에 대 한 20-30 분을 허용 합니다. 장기 의회에서 pH를 유지 하려면 변경 KREBS 솔루션 15 분 마다
- 품 어 되 N w-니트로-l-아르기닌 메 틸 에스테 르 (L 이름, 10 -4 M), 30 분, 산화 질소 synthase의 억제제 및 다음 반복 4.2.1 및 4.2.2 특성의 상대적 기여도를 Ach 중재 혈관을 산화 질소.
- 목욕에 직접 papaverine (10 10 -4 M를 -8)의 증가 복용량의 순차적 행정에 의해 endothelium 독립 혈관 (혈관 부드러운 근육 기능) 및 선박 생존 능력을 평가합니다. 혈관 직경, 반환 하거나 papaverine (즉 적절 한 혈관)에 대 한 응답 휴식 기준선 (디) 직경을 초과 하지 않습니다, 선박 비 가능한 고려 하 고 데이터 요소를 삭제.
5. 데이터 분석 및 계산
- 계산 혈관 반응성. 데이터 표현에 대 한 백분율 혈관 혈관 직경 기준 차이 대 한 계정 및 다음 수식을 사용 하 여 계산을 사용 하 여:
% 혈관 (DT-Dp/디-Dp) × 100 =
DT는 주어진된 시간 (최대에 기록 된 직경 지름), Dp입니다 vasoconstriction 에이전트 (즉 추가 후 기록. ET-1 유도 축의 직경), 고 디 바로 앞 vasoconstriction 에이전트 (휴식 초기 직경)의 추가 기록입니다. 9 - Ach, papaverine, 또는 외-1 최대 응답 (EC 50)의 50%를 elicits 의해 정의 될 수 있는 농도 주 작동 근에 혈관 확장 및 vasoconstriction 감도 (복용량 응답) 정의 자형 매개 변수 및 플롯, 앞에서 설명한 대로. 10
참고: 지방이 많은 microvessels의 혈관의 관찰자 간 재현성 연구는 0.99의 높은 상관 계수 (CC) (n = 10 배 실험) 우리의 실험실에.
6. 통계 분석
- 익스프레스 연속 측정 ± SEM.를 의미 이 일반적으로 배포 하는 경향이. 반복 측정 양방향 ANOVA에 의해 지방 arterioles 혈관 반응성 분석.
- 또는 처리 그룹 사이 복용량 응답을 누적 혈관에 대 한 음모의 곡선 (AUC) 아래 영역을 비교합니다. 모든 경우에 P 고려 < 0.05 통계적.
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Representative Results
우리 연구소는 endothelium 종속 검사를 videomicroscopy를 사용 하 고 있다 고-지방 조직 arterioles의 vasocontractile 기능 뿐만 아니라 독립적인 혈관, 피하와 내장 지방 비만 인간의에서 격리. 특성 실험 설정 그림 1A에 표시 됩니다. 지방 조직 arterioles 두 유리 모 세관 펫 사이 일시 중단 하 고 챔버 내에 장기 그림 1B와 같이 봉합과 장소에 고정 됩니다. Arteriolar 응답 다음 사전 수축 외 1 ~ 55%의 초기 직경 (그림 2B), 다음, 다음 주 작동 근 유도 기준선 (그림 2A)에서 선박을 검사 하 여 평가 될 수 있다 위에서 설명한 섹션 5.1, 혈관 고 그림 2C에 표시로 혈관 루멘의 휴식.
증가 흐름 (전단 응력)11 , Ach12 endothelium 종속 엷게 응답 했다 크게 무딘 내장에 피하 지방이 많은 arterioles (그림 3A, 3B에 비해 우리와 다른 사람 관찰 ) 인간의 비만에. 그러나, 응답 papaverine 혈관 확장 endothelium 독립 했다 두 플랫폼 (그림 3C) 사이 차동 변경 하지. 함께,이 발견 제안 내장 도메인에서 혈관 장애는 질병의 초기 단계에서 적어도 크게 endothelium의 수준에서 장애의 결과 이다. 이 기술은 그대로 작은 인간의 arterioles의 vasodilator 응답의 체계적인 분석을 허용 하 고 인간의 맥 관 구조의 액세스할 수 있는 다른 지역에도 적용 될 수 있습니다. Ex vivo 시스템 테스트 혈관 평활 근 혈관 내 피 인슐린 저항6또는 니트로 글 리세 린에 복용량 응답 학문의 색인 인슐린에 대 한 응답 등 수많은 약리 방법을 사용 하 여 조작할 수 있습니다. 레이어 기능입니다. 12 RNA 침묵 같은 생물 학적 방법을 수 있습니다 도입된13 잠재적으로 특정 질병 조건 하에서 관 역 기능을 부여 하는 중요 한 레 귤 레이 터를 이해 하기 위한 기계 프레임 워크를 개발 하.
그림 1: Videomicroscopy 설정. (A) 이미지 videomicroscopy 기관 챔버의 구성 요소를 묘사. (B) 이미지는 인간의 많은 되의 기관 실에서 두 개의 유리 모 세관 펫 사이 탑재. 혈관 직경 검사할 수 있는 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서 변경 되 고 시스템 분석 소프트웨어와 거꾸로 카메라 첨부 파일 전문 정량 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 압력 videomicroscopy를 사용 하 여 microvascular 혈관의 그림. (A) 휴식 기준 arteriolar 직경 (후 가압 직경, 길 항 제 또는 자극: 디) (B) 사전 압축된 직경 (후 동부 표준시-1 유도 죄이 고 지름: Dp), (C) 주 작동 근 유도 vasodilated 직경 (Ach 추가 되었다: DT). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3:에 피-종속, 그리고-독립적인 혈관 비만 인 간에 있는 내장 지방 arterioles 대 피하. 피-종속 혈관은 크게 감쇠 내장에 피하 지방 조직에 비해 arterioles (A)에 의해 평가 하는 때 증가 흐름 (쌍 피하 및 내장 혈관, n = 20), 또는 (B) 아 세 틸 콜린 복용량 응답/L 이름 없이 (쌍 피하 및 내장 혈관, n = 16). (C) Endothelium 독립 엷게 차동 변경 내장과 피하 arterioles papaverine 복용량 응답에 의해 평가 하는 때 사이 (쌍 피하 및 내장 혈관, n = 8). 저장소; 사이 그룹 차이 나타냅니다. †Denotes 창 고 전용 차이 혼자; 아 세 틸 콜린에 비해 L 이름으로 아 세 틸 콜린 NS: 중요 하지. 데이터 mean± SEM, p로 표시 됩니다 < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
해 부 및 주위 조직에서 지방 arterioles의 절연 기술 프로토콜 세부 사항에 주의 함께 시간과 노동 집약적인 과정 수. 있습니다 서 절차 세심 한 기술과 부드러운 근육 또는 내 피 손상을 방지 하기 위해 특수 해 부 기구는 microvasculature의 레이어를 셀 필요 합니다. Arteriolar 벽에도 작은 실수로 구멍 intraluminal 가압 및 실패 한 실험에서 결과 방지할 수 있습니다. 또한, cannulation arterioles 봉합 활용의 그릇의 각 끝에 유리 모 세관 피펫은 끝 사이 arterioles 확보 중요 합니다.
인간의 고립 된 microvessels 60 mmHg에서 가압의 30-40 분 후 자발적인 조직적 톤을 개발할 수 있습니다. 그러나, 우리 인간의 많은 arterioles 일반적으로 50-350 µ m 내부 luminal 직경의 혈관 평활 근의 스파스 레이어와 상대적으로 작은 고 골격 근육 arterioles에 비해 중요 한 조직적 음색을 개발 하지 않는 경향이 크기 발견. 우리는 따라서 vasodilators에 노출 하기 전에 동부 표준시-1을 사용 하 여 이러한 작은 arterioles 사전 수축 유발. 우리는 동부 표준시-1에 보다 예측 가능한 vasoconstrictor 응답 미치는 경우도 있을 수 있습니다 가변성 phenylephrine 등 알파 수용 체 주 작동 근 응답에 동안 찾을. 그것은 원하는 ~ 55% 사전 수축; 유도를 적절 한 agonists를 선택 하는 것이 필수적 그러나 그것은 또한 혈관에 복용량 및 독성 손상 방지 하기 위해 미리 죄 에이전트의 정확한 금액을 선택 하는 중요 한입니다. 우리는 낮은 범위 복용량으로 시작 하 고 최대 단원 4.1.2에에서 설명 된 대로 효과를 넣는 여 이것을 달성.
지방 조직에서 arterioles 변화 pH 및 온도;에 민감합니다. 14 그러므로, 모니터링 하 고 실험 과정에서 적절 한 pH (7.4)와 온도 (37 ° C) 제어 결정적 이다. Videomicroscopy는 단단히 통제 온도 제어 시스템, 실험 결과 왜곡 수 있습니다 교대를 피하기 위해 전체 KREBS 솔루션의 산도 모니터링 하는 것이 필수적입니다. KREBS 솔루션 및 가압 동안 솔루션 마다 15 분의 교체의 연속 버블링 및 세척 단계 동안 pH 변화를 줄일 것입니다.
Videomicroscopy는 microvessels의 기능 속성을 검사 하는 유용한 기법, 기술은 상당한 학습 곡선이 고 노동 집약적인 혈관 격리 과정 특히 있을 수 있습니다. Biopsied는 조직의 종류에 따라 지방 조직 microvessels 우리의 경험 cannulation 절차 상당한 양의 시간과 인내심이 걸릴 수 있습니다 설명 했다. 또한 고유의 시간 몸 밖에 서 혈관으로 실험에 감도 시간이 지남에 그들의 생리 적 및 기능적 속성을 잃는 경향이 있다. 따라서, 실험 최종 조직 붕괴 이전 수술 생 검 후 시간 분의 혈관의 가능한 창 내에서 수행 될 필요가 있다.
임상 관련성와 우리의 능력을 직접 그대로 전체 세그먼트 생활 과목에서 제거 하는 인간의 혈관의 이상에 의해 지원 됩니다 arterioles 공부에 대 한 videomicroscopy를 활용 하 여이 실험 모델의 근거는 비 침략 적 영상으로 복제할 수 없습니다. 사실, 우리의 능력을 직접 액세스 하 고에, 예를 들어 비만 신체 기능 인간의 혈관 검사를 제공할 수 경로 차동 질병 상태에서 변경 되 고 소설에 대 한 통찰력을 얻을 수 있는 기회와 치료 대상입니다. 또한, 우리의 실험실과 다른 사람에서 게시 된 데이터, 개인 내의 다른 혈관 침대에서 그 비보 전 평가의 비보에 많은 arteriolar 함수 관계가 조직 내 피 기능 응답을 표시 하 고 연결 심장 혈관 위험 요소와 고혈압, 흡연, 당뇨병, 및 염증 등. 12 , 15 , 16 우리 immunohistochemical 결과 내장 지방 내 피 세포에서 산화 질소 생물학 관련 및 제안 하는 상 완 동맥 흐름 중재 혈관 사이의 중요 한 상관 관계를 보여주는 데이터를 출판도 지방 및 전신 순환에 병렬 이상입니다. 이 기술은 단지 인간의 혈관 조직 공부 하지만 또한 잠재적으로 동물과 임상 경도 연구에서이 메서드를 사용 하는 실용적인 접근 방식을 나타내는 있다고 17 내 피 기능 장애의 조직의 특성상, 치료 효과 검사 합니다. 검사는 microvasculature에 다른 기술을 덜 기술적으로 수행 하기 어려운 경향이 있고 다양 한 agonists 힘 변환기를 사용 하 여 격리 된 혈관의 아이소메트릭 긴장의 측정에 대 한 수는 myography, 와이어 등도 있습니다. 이 메서드는 또한 microvessels의 생리 특성에 관한 정보를 제공 합니다, 하는 동안 설정 비보에 조건 정리 경향이 덜 렌더링 수 있습니다 내부 luminal 압력된 시스템을 활용 하지 않습니다. Videomicroscopy의 장점은 비교적 일정 intraluminal 압력 최소화 루멘에 전단에 변화를 유도 하는 기능입니다. 메서드는 인간과 동물 둘 다에 유사한 크기의 microvessels를 적용할 수 있습니다. 9 , 12 , 18 마지막으로, 주목 해야 한다 다양 한 상용 videomicroscopy 시스템 구입 및 설치; 사용할 수 있습니다. 그러나 전반적인 생리 적 개념은 모든 플랫폼에 걸쳐 상당히 균일 한 있다. 2 , 6 , 18
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Disclosures
저자는 공개 또는 보고서 이해 충돌 있다.
Acknowledgments
저자는 이러한 연구와 지방 조직 생체 검사를 제공 하기 위한 보스톤 의료 센터에서 외과 직원에 그들의 참여에 대 한 자원 봉사자 감사 하 고 싶습니다. 박사 Gokce HL081587, HL114675, 및 HL126141 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 됩니다. 박사 Farb NIH에서 지원 K23 HL135394를 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
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