Summary
Videomicroscopy system används för att undersöka funktionella egenskaper isolerade fettvävnad arterioler som svar på fysiologiska och farmakologiska stimuli. Denna teknik kan användas för att undersöka mikrovaskulära fenotyper i olika fettvävnad domäner hos överviktiga människor.
Abstract
Medan fetma är nära kopplad till utvecklingen av metabola och kardiovaskulära sjukdomar, är lite känt om mekanismer som styr dessa processer. Det är en hypotes om att pro-aterogena mediatorer frigörs från fettvävnader särskilt i samband med central/visceral adiposityen kan främja patogena vaskulära förändringar lokalt och systemiskt, och uppfattningen att kardiovaskulär sjukdom kan vara den följd av fettvävnad dysfunktion fortsätter att utvecklas. Här beskriver vi en unik metod för videomicroscopy som innebär analys av vasodilaterande och vasokonstriktor svar av intakt små mänskliga arterioler bort från fett depå levande försökspersoner. Videomicroscopy används för att undersöka funktionella egenskaper isolerad microvesselsna som svar på farmakologisk eller fysiologiska stimuli med en pressad system som härmar i vivo villkor. Tekniken är en användbar metod för att få förståelse av patofysiologin och molekylära mekanismer som bidrar till vaskulär dysfunktion lokalt inom den fettvävnad miljön. Dessutom har avvikelser i den fettvävnad mikrocirkulation också kopplats samman med systemiska sjukdomar. Vi tillämpat denna teknik för att undersöka depot-specifika vaskulär Svaren hos överviktiga patienter. Vi bedömde endotel-beroende vasodilatation både ökat flöde och acetylkolin i fett arterioler (50-350 µm inre diameter, 2-3 mm i längd) isolerat från två olika fett depåer under bariatrisk kirurgi från samma individ. Vi visat att arterioler från visceralt fett uppvisar nedsatt endotel-beroende vasodilatation jämfört med fartyg isolerade från subkutan depån. Resultaten tyder på att den viscerala närmiljön är associerad med vaskulär endotelial dysfunktion som kan vara relevanta för klinisk observation länka visceral fetma till systemisk sjukdomsmekanismer. Den videomicroscopy tekniken kan användas för att undersöka vaskulär fenotyper från olika fett depåer samt jämföra resultaten mellan individer med olika grader av fetma och metabolisk dysfunktion. Metoden kan också användas för att undersöka vaskulär Svaren längdriktningen som svar på kliniska interventioner.
Introduction
Videomicroscopy är en användbar teknik som används för att undersöka små arterioler bort från levande försökspersoner ex vivovasomotoriska funktion. Vårt laboratorium har fokuserat på att dissekera ut små microvesselsna från olika fettvävnad fack att karakterisera olika fett mikromiljö effekter på mikrocirkulation. En stor fördel med denna teknik är att blodkärl tas bort från den mänskliga kroppen förblir funktionella och kan lätt undersökas inom minuter till timmar efter biopsi. Fysiologiska förhållanden är härmade och stadig transmural tryck underhålls i intraluminal utrymmet via micro-glas kanyler som sammanfatta många i vivo egenskaper. 1 , 2 dessutom en tillförlitlig videomicroscopy set-up med automatiserade kant upptäckt programvara möjliggör både kvalitativ och kvantitativ bedömning av endotel-beroende - oberoende vasodilaterande och vasokonstriktor kapacitet och isolerade fartyg i realtid, tillåter snabb fysiologisk bedömning som svar på fysisk och farmakologiska stimuli. 3 andra mikrovaskulära tekniker finns också såsom tråd myography som tenderar att vara mindre tidskrävande och mäta spänningen Svaren till olika agonister genom en kraftgivare.
Vårt laboratorium har tillämpat videomicroscopy för att undersöka sambandet mellan fetma och vaskulär dysfunktion, med fokus på effekterna av olika fettvävnad domäner på kärlsystemet. Centrala adiposity med ackumulering av intraabdominell visceralt fett har varit närmast knuten till adipocytokine produktion, metabolisk dysfunktion och kardiometabola risk. Det har varit postulerade att fettvävnad dysfunktion med överproduktion av pro-aterogena cytokiner och adipokine dysreglering är starkt inblandade i dessa processer, men specifika reglerande molekyler och behandling mål är fortfarande till stor del oupptäckta. 4 dessutom på den lokala fettvävnad, kapillär förtunning och nedsatt perfusion har kopplats till fettvävnad pseudohypoxia och metabola dysreglering. Hypotesen att hjärt-kärlsjukdom kan vara följden av fettvävnad dysfunktion utvecklas. Pro-aterogena mediatorer frigörs från fett, särskilt i samband med central/visceral adiposity, sannolikt främja endoteldysfunktion och patogena vaskulära förändringar som kan manifestera lokalt i den fett vaskulatur och detekteras med hjälp av den häri beskrivs metod. 5
En funktionell bedömning av isolerade fettvävnad arterioler är en användbar metod för att få förståelse av patofysiologin och molekylära mekanismer som bidrar till vaskulär dysfunktion i människors fetma. För att undersöka mekanismer som bidrar till fett depå-specifik dysfunktion, vi har utvecklat metoder för att undersöka endotel-beroende och - oberoende vasodilaterande svar av mikrocirkulation, och utvärdera uttryck för olika föreskrivande kandidater i Parade visceral och subkutant (SC) fettvävnad exemplar erhållits från överviktiga patienter vid tidpunkten för obesitaskirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokoll och exempel beskrivs här godkändes av Boston University skola av medicin institutionella Review Board (IRB, protokoll #H-25644) och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Alla ämnen som skriftligt informerat samtycke innan deltagande.
1. beredning av lösningar och Micro-glas kanyler
- Förbered 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic sura saltlösning (HEPES) lösningen. För 1 L, lös 8.059 g NaCl, 0.298 g kaliumklorid, 0.296 g MgSO 4 • 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1.081 g D-glukos och 2.383 g HEPES syra i 950 mL avjoniserat vatten. Göra upp volymen till 1 L med avjoniserat vatten. Justera pH till 7,4 med NaOH. HEPES buffert kan lagras till 7 dagar vid 4 ° C.
- Förbereda 20 x Salt buffertlagret. För 1 L, lägga till 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 och 7,4 g CaCl 2 • 2 H 2 O i 900 mL destillerat vatten. Göra upp volymen till 1 L med avjoniserat vatten. Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- Förbereda 20 x buffertlagret. För 1 L, lägga till 26,8 g NaHCO 3 och 0,2 g EDTA·2H 2 O i 900 mL avjoniserat vatten. Göra upp volymen till 1 L med avjoniserat vatten. Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- Förbereda KREBS lösningen ska användas under de fysiologiska experiment. För 1 L, lägga till 900 mL avjoniserat vatten, 50 mL 20 x buffertlagret, 50 mL 20 x buffertlösning med Salt 0,99 g D-glukos och 0,16 g KH 2 PO 4. Justera pH till 7,4 använder HCl. För att bibehålla pH i bufferten, rör om hela tiden och täcka med paraffin eller bubbla kontinuerligt.
- Kontrollera pH varje 20 min. gör KREBS lösningen färska dagligen.
- Göra mikro-glas kanyler med en innerdiameter på 40-240 µm med hjälp av kommersiellt tillgängliga nål/pipett avdragare. Storleken på glas kanyler bestäms av storleken på den inre diametern av isolerade blodkärl (50-350 µm). Alternativt köpa micro-glas kanyler av förutbestämda storlek.
2. Beredning av reagens
- förbereda acetylkolin (Ach, 10 -2 M, stamlösning). Lös 18.29 g i 10 mL avjoniserat vatten. Lagra 1 mL portioner av stamlösning (10 -2 M) vid-80 ° C. På dagen för experimentet seriellt späd till få arbeta följande koncentrationer: 10 -6, 10 -8, 10 -7, 10 -5, 10 -9 M.
- Förbereda papaverin (2 x 10 -2 M, stamlösning). Lös 0.07517 g i 10 mL avjoniserat vatten. Förbereda 10 µL portioner av stamlösning och förvaras vid -80 ° C. seriellt späd för att få 10 -5, 10 -7, 10 -6, 10 -4, 10 -8 M på dagen för experimentet.
- Förbereda är endotelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, stamlösning). Lös 50 µg endotelin-1 i 1 mL 1% BSA/PBS. Lagra 1 mL portioner av stamlösning (2 x 10 -5 M) vid-80 ° C. På dagen för experimentet späd till få en arbetande koncentration av 10 -10 M på dagen för experimentet.
- Förvara reagenserna i antingen-20 ° C eller upp till-80 ° C beroende på typ av frys tillgänglig, men inte längre än 6 månader.
3. Fettvävnad insamling och fartyget förberedelse
- rekrytera feta män och kvinnor (BMI (Kroppsmasseindex) ≥ 35 kg/m², ålder ≥ 18 år) inskrivna i programmet bariatrisk kirurgi vid Boston Medical Center (BMC). Totalt 40 patienter deltog i dessa experiment.
- Samla subkutan och visceral fettvävnad prover under planerade bariatriska operationer av kirurgen utför operationen.
- Skörd av subkutan fettvävnad från nedre bukväggen och visceralt fett från den större omentum, respektive. Typiska fettvävnad urvalets storlek varierar från 3-10 mg vävnad.
- Plats vävnader omedelbart i kallt HEPES buffert lösning med ett pH-värde 7,4 och förvaras vid 4 ° C i upp till 24 h.
Obs: Dessutom fett arterioler kan erhållas från magra individer samt under andra typer av operationer såsom bråck reparationer eller plastikkirurgi och kan också vara biopsier från subkutan depån via trans-kutana buk fett pad biopsi < sup Class = ”xref” > 6.
- Använder en vävnad dissektion Mikroskop, mikro-sax och mikro-pincett, försiktigt omgivande fett och bindväv från de små fett arterioler (50-350 µm intraluminal diameter, längd 2-3 mm).
- Slips bort alla grenar på de arterioler med tiny nylon eller siden suturer innan cannulating på glas kapillär pipetterna. Noggrant dissekera arterioler eftersom även mindre skador av arteriole väggen orsakar betydande funktionella förändringar.
- Minimera fartyg exponering för ljus och värme som det kan orsaka vasodilatation. Eftersom det kan ibland vara svårt att skilja arterioler från venoler, identifiera storlek och smidig muskel tonen av fartyg genom att nafsa tips av fartygen. Arterioler är oftast mindre och påvisa större ton jämfört med venoler.
- Förbereda orgel kammaren. Fyll långsamt glas kapillär pipetter och gummi slangar med KREBS lösning med en 10 mL spruta.
- När gummi slangar är fylld och glas kapillär pipetter är nersänkta i KREBS lösning inom orgel kammaren, hål i arterioler säkert på de säkrade pipetterna och knyt båda ändarna av arteriole med nylon eller silk suturen knop noggrant.
- Fylla upp orgel kammaren med KREBS lösning upp till 2 mL.
- Säkra orgel kammaren till en scenen med inverterade mikroskopet (förstoring 10 X / 0,25 mål) och videokamera.
- Aktivera programvaran kant upptäckt som strömmas i realtid på en samplingsfrekvens på 1 kHz (1 bilder per sekund).
- Anslut ena sidan av den trycksatta slangen till KREBS lösningen fyllda trycket reservoarer gratis mikrobubblor, som bubblor kan införa experimentella fel. Anslut den andra sidan av trycksatta slangar till orgel kammaren.
- Ansluta KREBS lösning fylld trycket reservoarerna till tryckgivaren med ren slang.
- Styra intra-luminala flöde genom att reglera höjden på dessa två reservoarer; således när reservoarer är placerade på samma höjd, ingen intra-luminala flödet inträffar.
- När alla dessa processer är kompletta, slå på värme block och programvara program för att hålla temperaturen vid 37 ° C. kontinuerligt BEGJUTA fartyget med KREBS lösning och lufta med en gasblandning av 5% CO 2, 21% O 2 och 74% N 2 7 , 8 under hela experimentella förfarandet.
- Att uppnå önskat tryck inside lumen av isolerade fartyg gradvis öka intraluminal trycket (5 mmHg, varje 5 min) via styrenheten trycket i panelen myo-gränssnitt gör det långsamt för att undvika endothelial lagret skador.
Obs: När trycket når 60 mmHg, en 20-30 min Jämviktstiden period krävs för att stabilisera fartyget. Alla vaskulär funktion studier utförs på 60 mmHg och 37 ° C vid pH 7,4. 7
4. Bedömning av fett mikrovaskulära funktion
Observera: I allmänhet, fett arteriole endothelial-beroende vasodilatation kan utlösas svar på fysiologiska (flöde-inducerad) och farmakologiska stimuli (Ach-inducerad).
- Flöde-medierad, endotel-beroende vasodilatation
- efter trycksättning, spela in diametern på den fett arteriole i vila (Di). Detta kallas vilande baslinjen diameter.
- Pre sammandra blodkärlen att ~ 55% av vilande baslinjen diameter (Dp) genom att lägga till 1 µL av endotelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkt till bad och vänta 5 min för effekt. Upprepa denna process tills att nå de önska ~ 55% före trängd staten.
- Efter före sammandragning, framkalla kontinuerligt flöde in i intraluminal utrymme av fettvävnad arterioler, i lika och motsatta riktningar så att en tryckskillnad kan utvecklas över fartyget utan att ändra genomsnittlig intraluminal trycket 60 mmHg.
Obs: till exempel om en reservoar som klättrar med 10 cm i höjd, annan behöver flyttas med 10 cm till förändra trycket lutningar och således ändra intraluminal flöde. Om mer exakt flöde klassar mått önskas, en kvantitativ flödesmätaren system kan tillämpas på experimental set-up. - Mäter flöde-medierad dilatation 3-5 min efter inledandet av flödet med induktion. Nivåerna av intraluminal flöde (trycket lutningar) kan vara i intervallet 0 - 100 cmH 2 O. öka varje ökning med tryckgradient genom Δ10 cmH 2 O varje 5-6 min, upp till maximalt 100 cmH 2 O.
Obs: För att förmå stabil laminärt flöde i lumen, båda micro glas kanyl tip storlekar måste vara mycket nära innerdiametern på arterioler; annars det kommer att producera turbulent flöde inuti lumen och framkalla oönskade mätfel. - Efter flöde-medierad dilatation bedömningen, returnera trycket reservoarer till samma höjd (60 mmHg).
- Sedan tvätta arteriole och kammare genom att omedelbart ta bort lösning från kammaren och ersätta med färsk KREBS lösning. Detta görs med försiktighet att inte störa den svävande arteriole inom kammaren.
- Upprepa den här processen 3 - 4 gånger i 20-30 min, eller tills isolerade fartyget återvänder till vila baslinjen diameter.
- Acetylkolin-medierad, endotel-beroende, vasodilatation
- när den fett arteriole har återvänt till vilande baslinjen diameter, pre tygla fartyget ~ 55% genom att administrera endotelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkt till bad, som beskrivs ovan i avsnitt 4.1.2.
- Efter före sammandragning, sekventiellt administrera ökande doser (2 µL) av acetylkolin som är en receptor-medierad, kväveoxid agonist (Ach, 10 -9 till 10 -5 M) direkt till badet. Registrera ändringen i arteriolär diameter 5 min efter administrering av varje dos.
- När fartyget har nått en platå efter administrering av den slutliga Ach, tvätta kärlet 3 - 4 gånger med KREBS lösning. Att 20-30 min för fartyget att återhämta sig och återgå till vila baslinjen diameter. För att upprätthålla pH i orgel camber, ändra KREBS lösning var 15 min.
- Inkubera arteriole med N w - nitro - l-arginin metylester (L-namn, 10 -4 M), en hämmare av kväveoxid syntas för 30 min, och sedan upprepa 4.2.1 och 4.2.2 att karakterisera relativa bidrag kväveoxid till Ach-medierad vasodilatation.
- Bedöma endotel-oberoende vasodilatation (vaskulär glatt muskulatur funktion) och fartyget lönsamhet genom en sekventiell administrering av ökande doser av papaverin (10 -8 till 10 -4 M) direkt till badet. Om fartyget diameter inte återgå till, eller överstiga vilande baslinjen (Di) diameter som svar på papaverin (dvs. lämpliga vasodilatation), överväga fartyget icke livskraftiga och kassera datapunkter.
5. Dataanalys och beräkning
- Beräkna vaskulär reaktivitet. Använd procent vasodilatation för data uttryck att redogöra för baslinjen skillnader i fartyget diameter och beräkna med hjälp av följande ekvation:
% vasodilatation = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
där DT är inspelade diametern vid en given tidpunkt (maximalt diameter), Dp är diametern registreras efter tillägg av vasokonstriktion agenten (dvs. ET-1 inducerad sammandragning diameter), och Di är diametern registreras omedelbart före tillsats av vasokonstriktion agenten (vilande baslinjen diameter). 9 - definiera vasodilatation och vasokonstriktion känslighet (dos-respons) till en agonist som koncentrationen av Ach, papaverin eller ET-1 som väcker 50% av den maximal responsen (EG 50) som kan definieras av en sigmoidal parametern och uppritade, som tidigare beskrivits. 10
Obs: mellan observatör reproducerbarhet studierna av vasodilatation av fett microvesselsna har en hög korrelationskoefficient (CC) på 0,99 (n = 10 fartyget experiment) i vårt laboratorium.
6. statistikanalys
- Express kontinuerliga mätningar som menar ± SEM. Dessa tenderar att vara normalfördelade. Analysera vaskulär reaktivitet i fett arterioler av upprepade-åtgärder tvåvägs ANOVA.
- Jämför alternativt arean under kurvan (AUC) av tomten för kumulativa vasodilatation att dos-Svaren mellan behandlingsgrupperna. I alla fall, överväga P < 0,05 statistiskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vårt laboratorium har använt videomicroscopy för att undersöka endotel-beroende och oberoende vasodilatation, samt vasocontractile funktion av fettvävnad arterioler isolerade från underhudsfett och visceralt fett av överviktiga människor. Den karakteristiska experimental set-up visas i figur 1A. Fettvävnad arterioler är upphängd mellan två glas kapillär pipetter och säkrade på plats med suturer i orgel kammaren som visas i figur 1B. Som beskrivits ovan i avsnitt 5.1, kan arteriolär Svaren sedan avgöras från fartyget vid baslinjen (figur 2A), följt av före sammandragning med ET-1 ~ 55% av utgångsvärdet diameter (figur 2B), och sedan agonist-inducerad vasodilatation och avkoppling av vaskulär lumen som visas i figur 2 c.
Vi och andra har observerat att endotel-beroende vasodilatation Svaren till ökat flöde (shear stress)11 och Ach12 var signifikant trubbiga i viscerala jämfört med subkutan fett arterioler (figur 3A, 3B ) i människors fetma. Endotel-oberoende vasodilatation som svar på papaverin förändrades dock inte differentially mellan de två depåerna (figur 3 c). Tillsammans, dessa fynd tyder på att vaskulär dysfunktion i viscerala domäner är till stor del ett resultat av dysfunktion i nivå med endotelet, åtminstone i tidiga stadier av sjukdomen. Denna teknik tillåter systematisk analys av vasodilaterande Svaren av intakt små mänskliga arterioler och kan också tillämpas på andra tillgängliga regioner i det mänskliga kärlsystemet. Ex vivo systemet kan manipuleras med hjälp av många farmakologiska metoder såsom Svaren till insulin som ett index av vaskulär endotelial insulin resistens6eller dos-Svaren studier på nitroglycerin för att testa vaskulär glatt muskulatur lager-funktion. 12 biologiska metoder såsom tysta RNA kan också introducerade13 potentiellt utveckla mekanistiska ramverk för att förstå kritiska regulatorer som ger vaskulär dysfunktion under specifika sjukdomstillstånd.
Figur 1: Videomicroscopy set-up. (A) bild föreställande komponenterna i videomicroscopy orgel kammaren. (B) bild av ett mänskligt fett arteriole monteras mellan två glas kapillär pipetter i orgel kammaren. Fartyg diameter ändras som svar till fysiologiska och farmakologiska stimuli som kan undersökas och kvantifierade använder specialiserade analysprogram och en inverterad kamera bifogad fil i systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Illustration av mikrovaskulära vasodilatation med trycket videomicroscopy. (A) vilande baslinjen arteriolär diameter (efter trycksättning diameter, ingen agonist eller stimulering: Di) (B) pre förträngda diameter (efter ET-1 inducerad förträngda diameter: Dp), (C) Agonist-inducerad vasodilated diameter (efter Ach lades: DT). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: endotel-beroende och -oberoende vasodilatation i subkutan vs. visceralt fett arterioler hos överviktiga människor. Endotel-beroende vasodilatation var betydligt försvagat i viscerala jämfört med subkutan fettvävnad arterioler när bedömas av (A) ökat flöde (ihopparad underhudsfett och visceralt fartyg, n = 20), eller (B) acetylkolin dosrespons med/utan L-namn (ihopparad underhudsfett och visceralt fartyg, n = 16). (C) endotel-oberoende vasodilatation förändrades inte differentially mellan visceral och subkutant arterioler när bedömas av papaverin dosrespons (ihopparad underhudsfett och visceralt fartyg, n = 8). * Betecknar gruppen skillnader mellan depåer; †Denotes depot-specifika skillnader mellan acetylkolin med L-namn jämfört med acetylkolin ensam; NS: inte betydande. Data presenteras som medelvärde ± SEM, p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dissektion och isolering av fett arterioler från omgivande vävnader kan vara en tidskrävande och arbetsintensiva process med noggrann uppmärksamhet på Detaljer och tekniska protokoll. Den lokalt proceduren kräver noggrann färdigheter och specialiserade dissektion redskap att förebygga potentiella skador att den glatta muskulaturen eller endothelial cellen lager av mikrocirkulation. Även små oavsiktlig punkteringar i arteriolär väggen kan hindra intraluminal trycksättning och resultat i ett misslyckat experiment. Dessutom, är kanylering av arterioler utnyttja suturer avgörande för att säkra arterioler mellan glas kapillär pipettspetsar i varje ände av fartyget.
Mänskliga isolerade microvesselsna kan utveckla spontan myogenic ton efter 30-40 min Trycksättning på 60 mmHg. Vi fann dock att mänskliga fett arterioler generellt storlek 50-350 µm av inre luminala diameter är relativt små med glesa lager av vaskulär glatt muskulatur, och tenderar att inte utveckla betydande myogenic ton jämfört med skelettmuskulaturen arterioler. Vi framkalla således före sammandragning av dessa små arterioler med ET-1 innan exponering för vasodilaterare. Vi finner att ET-1 utövar en mer förutsägbar vasokonstriktor svar medan i vissa fall kan det finnas variation i Svaren till alpha receptoragonister såsom fenylefrin. Det är absolut nödvändigt att välja de lämpliga agonister att inducera en önskad ~ 55% före sammandragning; men det är också avgörande att välja rätt mängd pre snåriga agent att förhindra över dosering och toxiska skador på fartyget. Detta uppnår vi genom att starta med den lägre dosen utbud och upp-titrering till effekt som beskrivs i avsnitt 4.1.2.
Arterioler i fettvävnaden är känsliga för förändringar i pH och temperatur. 14 därför är det viktigt att övervaka och styra lämpligt pH (7,4) och temperatur (37 ° C) under experimentell process. Medan videomicroscopy är en hårt reglerad temperatur kontrollerade system, är det absolut nödvändigt att övervaka pH KREBS lösningen i hela experimentet att undvika förändringar som kan förvränga resultaten. Kontinuerlig bubblande KREBS lösning och ersätta lösning varje 15 min vid trycksättning och tvätt steg minskar pH variationer över tid.
Medan videomicroscopy är en användbar teknik för att undersöka microvesselsna funktionella egenskaper, tekniken har en stor inlärningskurva och kan vara arbetskrävande som särskilt under processen för vaskulär isolering. Beroende på vilken typ av vävnad som är biopsier, har vår erfarenhet med fettvävnad microvesselsna visat att förfarandet som kanylering kan ta avsevärd tid och tålamod. Dessutom finns det inneboende tid känslighet för experimenten som fartyg utanför kroppen tenderar att förlora sin fysiologiska och funktionella egenskaper över tiden. Således, experimenten måste utföras inom fönstret livskraftig fartyg som minuter till timmar efter kirurgisk biopsi före eventuell vävnad sönderfall.
Den kliniska relevansen och syftet med denna experimentella modell utnyttjar videomicroscopy för studera arterioler stöds av vår förmåga att direkt sond patofysiologi i intakt hela segment av mänskliga blodkärl tas bort från levande ämnen, som kan inte replikeras av icke-invasiva imaging. Faktum är att vår förmåga att direkt få tillgång till och undersöka dysfunktionella mänskliga blodkärl i, till exempel en feta kropp, kan ge oss möjligheter att få insikt i vägar som är differentially förändrade i sjukdomstillstånd och upptäck roman terapeutiska mål. Dessutom publicerade data från vårt laboratorium och andra visar att ex vivo bedömning av fett arteriolär funktion korrelerar med in vivo systemisk endotelfunktion svaren i andra kärlbäddar inom individ och associera med kardiovaskulära riskfaktorer som hypertoni, rökning, diabetes och inflammation. 12 , 15 , 16 vi har också publicerat uppgifter som visar en signifikant korrelation mellan immunhistokemiska fynd relevanta för kväveoxid biologi i visceralt fett endotelceller och brachialis arteriella flödet-medierad vasodilatation vilket tyder på parallella avvikelser i adipose och systemisk cirkulationer. 17 med systemisk tanke på endoteldysfunktion, anser vi att denna teknik utgör en pragmatisk inställning till studera inte bara mänskliga kärlvävnad men också potentiellt utnyttja denna metod i djur och kliniska longitudinella studier för att undersöka behandlingseffekter. Andra tekniker för att undersöka mikrocirkulation finns också såsom tråd myography, som tenderar att vara mindre tekniskt svåra att utföra och möjliggör åtgärder av isometrisk spänning av isolerade fartyg till olika agonister med en kraftgivare. Även denna metod ger också information om fysiologiska egenskaper hos microvesselsna, använda set-up inte ett intra-luminala pressad system som kan göra det mindre benägna att sammanfatta i vivo villkor. En fördel med videomicroscopy är förmågan att inducera en relativt konstant intraluminal trycket minimerar förändringar i skjuvning i lumen. Metoden kan tillämpas på liknande storlek microvesselsna i både människor och djur. 9 , 12 , 18 slutligen noteras bör att det finns ett antal kommersiellt tillgängliga videomicroscopy system för inköp och installation; men de övergripande fysiologiska begrepp är ganska enhetlig över alla plattformar. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar eller intressekonflikter till rapport.
Acknowledgments
Författarna vill tacka frivilliga för deras deltagande i dessa studier och den kirurgiska personalen vid Boston Medical Center för att tillhandahålla fettvävnad biopsier. Dr. Gokce stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag HL081587, HL114675 och HL126141. Dr. Farb stöds av NIH bevilja K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
