Summary
Videomicroscopy sistemleri izole yağ dokusu arteriyoller fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel özelliklerini incelemek için kullanılır. Bu teknik obez insanlarda farklı yağ dokusu etki alanlarındaki mikrovasküler fenotipleri incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Obezite yakından metabolik ve kardiyovasküler hastalık gelişimine bağlı iken az bu süreçleri yöneten mekanizmaları hakkında bilinir. Özellikle merkez/visseral obezite işbirliğiyle yağlı doku serbest pro aterojenik arabulucu yerel ve sistemik patojenik vasküler değişiklikler tanıtmak ve kavramı o kardiyovasküler hastalık olabilir onaylanmadığına karar yağ doku disfonksiyon sonucu gelişmeye devam ediyor. Burada, analiz olduğu gibi küçük insan arteriyoller yaşayan insan denekler yağ deposundan kaldırıldı vazodilatör ve vasoconstrictor tepkilerin içerir videomicroscopy benzersiz bir yöntem açıklanmaktadır. Videomicroscopy farmakolojik veya fizyolojik uyaranlar vivo içinde koşulları taklit eden bir baskı sistemi kullanarak yanıt olarak izole yüzdeki fonksiyonel özelliklerini incelemek için kullanılır. Teknik patofizyolojisi ve vasküler disfonksiyon yağ dokusu ortamın içinde yerel olarak katkıda moleküler mekanizmalar anlamak için yararlı bir yaklaşımdır. Ayrıca, yağ dokusu microvasculature anormallikleri de sistemik hastalıklarla bağlantılı olmuştur. Biz depo özel vasküler yanıt obez bireylerde incelemek için bu tekniği uygulanır. Endotel bağımlı vazodilatasyon yüksek akış ve asetilkolin adipose arteriyoller (50-350 µm iç çapı, 2-3 mm uzunluğunda) aynı birey bariatrik cerrahi sırasında iki farklı yağ depoları izole olarak değerlendirildi. Visseral yağ arteriyoller subkutan perondan izole kaplar kıyasla Özürlüler endotel bağımlı vazodilatasyon sergi gösterdi. Bulgular visseral microenvironment klinik gözlem artan visseral obezite sistemik hastalik mekanizmaları için bağlama ile ilgili olabilecek vasküler endotel disfonksiyonu ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Videomicroscopy tekniği farklı yağ depoları gelen vasküler fenotipleri incelemek gibi bulgular farklı derecelerde obezite ve metabolik fonksiyon bozukluğu olan bireyler arasında karşılaştırmak için kullanılabilir. Yöntem damar yanıtlarında boyuna yanıt-e doğru klinik müdahaleler incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Videomicroscopy küçük arteriyoller yaşayan insan denekler ex vivokaldırıldı vasomotor işlevini incelemek için kullanılan yararlı bir tekniktir. Bizim laboratuvar microvasculature çeşitli yağ microenvironments etkilerini karakterize etmek için farklı yağ dokusu bölmeleri gelen küçük yüzdeki dışarı dissekan odaklanmıştır. Bu teknik önemli bir avantajı kan damarları insan vücudundan kaldırıldı işlevsel kalır ve kolayca dakika ile biyopsi takip saat içinde incelenebilir var. Fizyolojik şartlarda taklit ve birçok vivo içinde özellikleri özetlemek mikro-cam Kanüller üzerinden intraluminal uzayda tutulan transmural basınç sabit. 1 , 2 Ayrıca, güvenilir videomicroscopy kurulum otomatik kenar algılama yazılımı ile endotel bağımlı ve - bağımsız vazodilatör ve vasoconstrictor kapasitesini izole hem nitel hem de nicel değerlendirmesi için sağlar. Gemi gerçek zamanlı, izin hızlı fizyolojik değerlendirme fiziksel ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak. 3 diğer mikrovasküler teknikleri de daha az zaman alıcı ve bir güç çevirici tarafından çeşitli agonistler yanıtlarını gerilim ölçmek eğilimindedir tel myography gibi mevcuttur.
Bizim laboratuvar videomicroscopy obezite ve vasküler disfonksiyon, damarlara farklı yağ dokusu etki alanları etkilerini odaklanan arasındaki ilişkiyi incelemek için başvurdu. İntra abdominal visseral yağ birikimi ile Merkezi obezite en yakın adipocytokine üretim, metabolik fonksiyon bozukluğu ve kardiyometabolik risk bağlantılı olmuştur. Bu yağ doku disfonksiyon aşırı üretim pro aterojenik sitokinler ve adipokine bozukluk olan kuvvetle bu işlemlerde karıştığı, ancak belirli yasal moleküller ve tedavi hedefleri büyük ölçüde kalır öne keşfedilmemiş. 4 Ayrıca, yerel yağ doku düzeyinde, kapiller rarefaction ve Engelli perfüzyon yağ dokusu pseudohypoxia ve metabolik bozukluk bağlantılı. Kardiyovasküler hastalık yağ doku disfonksiyon sonucu olabilir hipotez gelişmektedir. Pro aterojenik arabulucu yağ, özellikle orta/visseral obezite, büyük olasılıkla işbirliğiyle piyasaya teşvik endotel disfonksiyonu ve -ebilmek var olmak patojenik vasküler değişiklikler yerel olarak tezahür adipose damarlara ve kullanarak tespit Burada açıklanan yöntemi. 5
İzole yağ dokusu arteriyoller işlevsel değerlendirme patofizyolojisi ve insan obezite vasküler disfonksiyon katkıda moleküler mekanizmalar anlamak için yararlı bir yaklaşımdır. Yağ depo özel disfonksiyon katkıda mekanizmaları araştırmak için endotel bağımlı incelemek için yöntemler geliştirdik ve - microvasculature bağımsız vasodilatory yanıtları ve çeşitli düzenleyici ifade değerlendirmek obez bir konu bariatrik cerrahi anda elde eşleştirilmiş visseral ve subkutan (SC) yağ dokusu örnekleri aday.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokolü ve burada anlatılan örnekler Boston Üniversitesi okul tıp kurumsal inceleme kurulu'nin (IRB, iletişim kuralı #H-25644) kabul edildi ve Helsinki Deklarasyonu uygun olarak yapılmıştır. Tüm konularda yazılı Onam önce katılım sağlanan.
1. hazırlık çözümler ve mikro-cam Kanüller
- hazırla 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic asidik solüsyon (HEPES) çözüm. 1 L için 8.059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g MgSO 4 dissolve • 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1.081 g D-glukoz ve 2.383 g HEPES asit 950 ml deiyonize su. Sesini için 1 L deiyonize su ile olun. PH 7.4 NaOH kullanarak için ayarlayın. HEPES tampon saklanabilir için 7 gün 4 ° C.
- 20 x Salt arabellek hisse senedi hazırlayın. 143,8 g NaCl, 7.0 g KCl, 5.9 g MgSO 4 ve 7.4 g CaCl 2 1 L için ekleyin • 2 H 2 O 900 mL distile su içine. •Ses yükseltme için 1 L deiyonize su ile olun. Saat 4'te hazır çözüm depolamak ° C.
- 20 x arabellek hisse senedi hazırlayın. 1 L için 26.8 g NaHCO 3 ve 0.2 g EDTA·2H 2 O 900 mL deiyonize su içine ekleyin. •Ses yükseltme için 1 L deiyonize su ile olun. Saat 4'te hazır çözüm depolamak ° C.
- Çözüm KREBS fizyolojik deneyler sırasında kullanılmak üzere hazırlayın. 1 L için 900 mL deiyonize su, 20 arabellek hisse senedi x 50 mL, 20 tuz tampon solüsyonu, 0,99 g D-glukoz ve 0,16 g KH 2 PO 4 x 50 mL ekleyin. PH HCl kullanarak 7.4 için ayarlayın. Tamponunun pH korumak için sürekli karıştırın ve kapak ile parafin veya sürekli kabarcık.
- Onay pH her 20 dk. KREBS çözüm taze olun günlük.
- Yapmak mikro-cam Kanüller 40-240 µm bir piyasada bulunan iğne/pipet çektirmenin kullanarak bir iç çapı ile. Cam Kanüller boyutunu izole kan damarları (50-350 µm) iç çapını boyutu tarafından belirlenir. Alternatif olarak, mikro-cam Kanüller önceden belirlenmiş büyüklükte satın.
2. Reaktifler hazırlanması
- hazırla asetilkolin (Ach, 10 -2 M, hisse senedi çözüm). 10 mL deiyonize su 18.29 g geçiyoruz. 1 mL aliquots hisse senedi çözüm (10 -2 M)-80 ° C'de depolayın Aşağıdaki çalışma konsantrasyonları elde etmek için seri olarak seyreltik deneme günü: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- (2 x 10 -2 M, hisse senedi çözüm) papaverin hazırlayın. 10 mL deiyonize su 0.07517 g geçiyoruz. 10 µL aliquots hisse senedi çözüm ve-80 mağazasında hazırlamak ° C. seri olarak sulandırmak 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M denemenin gün almak için.
- Endotelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, hisse senedi çözüm) hazırlayın. 50 µg endotelin-1 1 mL % 1'dağıtılması BSA/PBS. 1 mL aliquots hisse senedi çözüm (2 x 10 -5 M)-80 ° C'de depolayın 10 -10 M çalışma konsantrasyonu deney gününde elde etmek için seyreltik deneme günü.
- Ya-20 ° C'de reaktifler depolamak veya ile-80 ° C arasında derin dondurucu türüne bağlı olarak kullanılabilir, ama 6 aydan uzun olmayan.
3. Yağ dokusu toplama ve gemi hazırlık
- askere obez erkekler ve kadınlar (vücut kitle indeksi (VKİ) ≥ 35 kg/m², yaş ≥ 18 yaşındaki) bariatrik cerrahi programı, Boston Tıp Merkezi (BMC) kayıtlı. Toplam 40 konuların bu deneylerde katıldı.
- Toplamak subkutan ve viseral yağ doku örnekleri planlı bariatrik cerrahi sırasında operasyonu cerrah tarafından.
- Hasat subkutan yağ dokuları alt karın duvarından ve viseral sırasıyla büyük Omentumun, şişko. Tipik yağ dokusu örnek boyutu değişir doku 3-10 mg.
- Yer dokulara hemen soğuk HEPES tampon çözüm pH 7,4 ve mağaza 4 ° c ilâ 24 h için
Not: Ayrıca, adipose arteriyoller yalın bireylerin de cerrahi fıtık onarım veya plastik cerrahi gibi diğer türleri sırasında elde edilebilir ve aynı zamanda biyopsi trans-Kutanöz karın yağ yastığı biyopsi ile subkutan depo dan olabilir < sup sınıf "xref" = > 6.
- Bir doku diseksiyon mikroskop, mikro-makas ve mikro-forseps kullanarak, dikkatle çevreleyen bağ dokusu ve yağ küçük adipose arteriyoller (50-350 µm intraluminal çapı, 2-3 mm uzunluğunda) kaldırın.
- Cam kapiller Pipetler cannulating önce küçük naylon veya ipek dikiş kullanarak arteriyoller bütün dallarda kapalı kravat. Arteriyol duvardaki bile ufak hasar önemli bir işlev değişikliğine neden olur bu yana dikkatle incelemek arteriyoller.
Işık ve ısı olarak
- simge durumuna Küçült gemi maruz vazodilatasyon neden olabilir. Bazen arteriyoller venüller ayırt etmek zor olabilir bu yana, damarları boyutu ve düz kas tonu damarlarının ipuçları kesme tarafından tanımlayın. Arteriyoller genellikle daha küçük olan ve büyük sesi venüller için karşılaştırıldığında gösteren.
- Organ odası hazırlamak. Yavaş yavaş cam kapiller Pipetler ve kauçuk tüp 10 mL kullanarak KREBS solüsyonu ile doldurmak.
- Kez alıpkendi doldurulur ve cam kapiller Pipetler KREBS çözüm içinde organ odası sular altında arteriyoller güvenli Pipetler üzerinde güvenli bir şekilde cannulate ve her iki ucunda da arteriyol naylon ile kravat veya dikiş knot dikkatle ipek.
- Organ odası KREBS çözüm ile doldurmak 2 mL.
- Organ odası bir sahneye ters mikroskopla (büyütme 10 X / 0,25 amaç) güvenli ve video kamera.
- İçinde akış kenar algılama yazılımı 1 kHz örnekleme hızında gerçek zamanlı açın (1 kare/sn). Kabarcıklar deneysel hata tanıtmak gibi
- bir basınçlı boru dolu basınç rezervuar microbubbles ücretsiz KREBS çözüm bağlamak. Diğer basınçlı boru organ odasına bağlamak.
- Temiz boru ile basınç detektörler KREBS dolu çözüm basınç rezervuar bağlanmak.
- Kontrol bu iki rezervuarlar yüksekliğini düzenleyerek içi luminal akışı; Yani, ne zaman rezervuarlar içi luminal hiçbir akışı ortaya çıkar aynı yükseklikte yer alır. Tüm bu işlemler tamamlandıktan sonra
- dönüş sıcaklığı 37 korumak için blok ve yazılım programı Isıtma ° C. sürekli KREBS çözüm ile gemi sıvı ve % 5 CO 2, % 21 O 2 ve % 74'ü N gaz karışımı ile havalandırmak 2 bütün deneysel prosedür boyunca 7 , 8. İstenilen basınç insin ulaşmak için
- de izole kaplar Lümen yavaş yavaş artırın intraluminal basınç (5 mmHg, her 5 dk) yolu ile endotel tabakası zarar görmemesi için yavaş bir hızla böylece basınç kontrol ünitesi myo-arabirimi Masası ' nda.
Not: basınç 60 mmHg ulaştığında, bir 20-30 dk denge süre gemi stabilize etmek gereklidir. Tüm vasküler işlevi çalışmaları 60 mmHg ve pH 7.4 37 ° C'de gerçekleştirilir. 7
4. Adipose mikrovasküler işlevi değerlendirilmesi
Not: genel olarak, yağ arteriyol endotel bağımlı vazodilatasyon yanıt olarak fizyolojik (akış kaynaklı) elicited ve farmakolojik uyaranlara (Ach kaynaklı).
- Akışı aracılı, endotel bağımlı vazodilatasyon
- basıncını, istirahat (Di) yağ arteriyol çapını kaydetmek. Bu dinlenme temel çapı adlandırılır.
- Kan damarlarının dinlenme temel çapı (Dp) ~ %55 1 µL endotelin-1 ekleyerek önceden daraltır (ET-1, 10 − 10 M) banyo ve etkisi 5 dk bekle. İstenen ~ %55 ulaşan devlet önceden dar kadar bu işlemi yineleyin.
- Ortalama intraluminal basınç değiştirmeden gemi arasında basınç farkı geliştirilebilir böylece öncesi daralma sürekli akışı yağ dokusu arteriyoller, eşit ve zıt yönde intraluminal uzaya ikna etmek 60 mmHg,.
Not: bir rezervuar 10 cm yüksekliğinde hareket ederse, örneğin, diğeri 10 cm kadar basınç gradyanları değiştirebilir ve böylece intraluminal akış hızını değiştirmek için taşınması gerekiyor. Daha doğru akış hızı ölçümleri istenirse, deneysel set-up bir nicel debimetre sistemi uygulanabilir. - Ölçmek akışı aracılı dilatasyon akışı indüksiyon başlanmasından sonra 3-5 dak. İntraluminal akışı (basınç gradyanları) düzeyde olabilir aralığın 0 - 100 cmH 2 O. artırmak her artış basınç geçişin Δ10 cmH 2 tarafından O en çok 100 cmH 2 O. her 5-6 min
Not: lümen istikrarlı laminar akışı ikna etmek için her iki mikro cam kanül ucu boyutları çok arteriyoller iç çap yakın olmak gerekir; Aksi takdirde, türbülanslı akış içinde Lümen üretmek ve istenmeyen ölçüm hataları neden. - Akış-aracılı dilatasyon değerlendirme, aynı yükseklikte (60 mmHg) basınç rezervuar iade.
- Sonra yıkama arteriyol ve odası hemen odasından çözüm kaldırarak ve taze KREBS çözüm ile değiştirin. Bu odanın içinde askıya alınmış arteriyol bozmak değil olarak dikkatle yapılır.
- 20-30 dk için 3 - 4 kez veya izole kap dinlenme temel çapı dönünceye kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Asetilkolin-aracılı, endotel bağımlı, vazodilatasyon
- adipose arteriyol dinlenme temel çapı döndüğünde önceden sıkmak endotelin-1 (ET-1, 10 yönetmek gemi ~ %55 − 10 M) doğrudan Bath, 4.1.2 bölümünde yukarıda açıklandığı gibi.
- Öncesi daralma artan dozlarda (2 µL) sırayla bir reseptör aracılı, nitrik oksit agonist (Ach, 10 -9 10 -5 M için) doğrudan banyo için olan asetilkolin yönetmek. Değişikliği arterioler çapı 5 dk sonra her doz yönetim kaydetmek. Gemi yönetimi son Ach doz takip bir plato ulaşmıştır sonra
- gemi 3 - 4 kez KREBS çözüm ile yıkayın. 20-30 dk geminin yeniden elde etmek ve temel çapı istirahat için dönmek izin. KREBS çözüm her 15 dk. organ kamber pH korumaya yardımcı olmak için değiştirmek
- Kuluçkaya arteriyol ile N w - nitro - l-arginin metil ester (L-NAME, 10 -4 M), bir 30 dk, nitrik oksit sentaz inhibitörü ve sonra tekrar 4.2.1 ve göreli katkısını karakterize 4.2.2 nitrik oksit Ach-aracılı vazodilatasyon.
- Endotel bağımsız vazodilatasyon (vasküler düz kas fonksiyonu) ve gemi canlılığı papaverin (10 -8 10 -4 M için) doğrudan banyo için artan dozlarda sıralı bir yönetim tarafından değerlendirmek. Damar çapı değil dönmek veya aşması papaverin (Yani uygun vazodilatasyon) yanıt olarak dinlenme temel (Di) çapı, gemi uygun olmayan düşünün ve veri noktaları atın.
5. Veri analizi ve hesaplama
- Hesaplama vasküler reaktivite. Temel farklılıklar damar çapı hesabı ve aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplamak için veri ifade için yüzde vazodilatasyon kullanın:
% vazodilatasyon = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
DT verilen zamanda noktada (en yüksek derece kaydedilen çapı nerede çapı), Dp vazokonstriksiyona ajan (i.e. eklenmesinden sonra kaydedilen çapı olduğunu. ET-1 indüklenen daralma çapı), ve Di hemen vazokonstriksiyona ajan (dinlenme temel çapı) toplamadan önce kaydedilen çapı. 9 - vazodilatasyon ve vazokonstriksiyona duyarlılığı (doz-yanıt) için bir agonist Ach, papaverin veya ET-maksimal yanıt (EC 50) % 50'si aydınlığa çıkartıyor tarafından tanımlanan 1 konsantrasyon olarak tanımlamak bir sigmoidal parametre ve çizilen, daha önce açıklandığı gibi. 10
Not: yağ yüzdeki vazodilatasyon arası gözlemci tekrarlanabilirlik çalışmalar vardır 0,99 yüksek bir korelasyon katsayısı (CC) (n = 10 gemi deneyler) bizim laboratuvar.
6. istatistiksel analiz
± SEM anlamına- Express sürekli ölçümler Bunlar normal dağıldığı eğilimindedir. Vasküler reaktivite tarafından tekrarlanan ölçüler iki yönlü ANOVA adipose arteriyoller analiz.
- Alternatif olarak, arsa için doz-yanıt tedavi grupları arasında için toplu vazodilatasyon (AUC) eğri altındaki alan incelemenizi öneririz. Her durumda, P düşünün < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim laboratuvar videomicroscopy endotel bağımlı incelemek için kullanılan ve - bağımsız vazodilatasyon, aynı zamanda yağ dokusu arteriyoller vasocontractile fonksiyonu obez insanların subkutan ve viseral yağ izole. Karakteristik deneysel set-up şekil 1A' görüntülenir. Yağ dokusu arteriyoller iki cam kapiller Pipetler arasında askıya ve yerde dikiş içinde şekil 1Badımında gösterildiği gibi organ odası ile güvenli. 5.1 bölümünde yukarıda açıklandığı gibi arterioler yanıt sonra arkasından öncesi daralma ET-1 temel çapı (şekil 2B) % ~ 55 ve sonra agonist kaynaklı temel (şekil 2A), gemisine incelenerek tespit edilebilir vazodilatasyon ve şekil 2Ciçinde görüntülendiği vasküler Lümen gevşeme.
Biz ve diğerleri endotel bağımlı vazodilatasyon yanıt yüksek akış (shear stres)11 ve Ach12 önemli ölçüde visseral içinde deri altı yağ arteriyoller (şekil 3A, 3B karşılaştırıldığında kör olduğunu gözlemledim ) insan obezite. Ancak, endotel bağımsız vazodilatasyon papaverin cevaben differentially iki depoları (şekil 3 c) arasında değiştirilmiş değil. Birlikte, bu bulgular bu vasküler disfonksiyon visseral etki alanlarındaki önermek büyük ölçüde bir disfonksiyon endotel, düzeyinde en az hastalığın erken aşamalarında sonucudur. Bu teknik olduğu gibi küçük insan arteriyoller, vazodilatör tepkilerin sistematik analizi izin verir ve insan damarlara erişilebilir diğer bölgeler için de uygulanabilir. Vasküler düz kas test etmek için bir dizin vasküler endotel insülin direnci6veya doz-yanıt çalışmaları için nitrogliserin olarak insülin yanıt gibi çok sayıda farmakolojik yöntemleri kullanarak ex vivo sisteminin değiştirilebileceğini Katman işlev. 12 RNA susturmak gibi biyolojik yöntemler de potansiyel olarak belirli hastalık koşullarında vasküler disfonksiyon görüşmek kritik düzenleyiciler anlamak için mekanik çerçeveler geliştirmek için tanıtılan13 olabilir.
Şekil 1: Videomicroscopy set-up. (A)görüntü videomicroscopy organ odası bileşenlerini tasvir. İki cam kapiller Pipetler organ namluda arasında bir insan yağ arteriyol (B) görüntü monte. Damar çapı incelenebilir fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak değiştirir ve quantified kullanarak analiz yazılımı ve ters kamera ek uzman içinde belgili tanımlık sistem. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: mikrovasküler vazodilatasyon basınç videomicroscopy kullanarak Illustration. (A)dinlenme temel arterioler çapı (sonrası basınçlandırma çapı, hiçbir agonist veya uyarı: Di) (B) önceden dar çap (ET-1 dar çap indüklenen sonra: Dp), (C) Agonist kaynaklı vasodilated çapı (Ach eklendikten sonra: DT). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: endotel bağımlı ve - bağımsız vazodilatasyon obez insanlarda visseral adipoz arteriyoller vs subkutan. Endotel bağımlı vazodilatasyon önemli ölçüde zayıflatılmış visseral içinde deri altı yağ dokusu ile karşılaştırıldığında (Atarafından) değerlendirirken arteriyoller akışı arttı (eşleştirilmiş subkutan ve viseral gemiler, n = 20), veya (B) asetilkolin doz yanıt/L-adı olmadan (eşleştirilmiş subkutan ve viseral gemiler, n = 16). (C) endotel bağımsız vazodilatasyon değil differentially değişmiş papaverin doz Cevabıyla değerlendirirken visseral ve subkutan arteriyoller arasında (eşleştirilmiş subkutan ve viseral gemiler, n = 8). * Depoları arasında grup farklılıklar gösterir; †Denotes depo özel asetilkolin L-NAME asetilkolin yalnız karşılaştırıldığında ile arasındaki farklar; NS: önemli değil. Mean± SEM, p sunulan verilerin < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diseksiyon ve dokuları çevreleyen dan adipose arteriyoller yalıtım dikkat detay ve teknik iletişim kuralı ile zaman alıcı ve emek yoğun bir işlem olabilir. Mikrodiseksiyon yordam titiz beceri ve düz kas ve endotel olabilecek hasarları önlemek için özel diseksiyon mutfak eşyaları microvasculature katmanları hücre gerektirir. Arterioler duvardaki bile küçük yanlışlıkla delikler intraluminal basınçlandırma ve başarısız bir deney sonuçlarında engelleyebilirsiniz. Ayrıca, cannulation dikiş kullanan arteriyoller, gemi her ucundaki cam kapiller pipet ipuçları arasında arteriyoller güvenliğini sağlamak önemlidir.
İnsan izole yüzdeki spontan myogenic sesi basınçlandırma 60 mmHg, 30-40 dk sonra gelişebilir. Ancak, insan yağ arteriyoller genellikle 50-350 µm iç luminal çapının vasküler düz kas seyrek katmanları ile nispeten küçüktür ve kas iskelet arteriyoller karşılaştırıldığında önemli myogenic sesi geliştirmek değil eğilimindedir boyutlu bulundu. Böylece bu küçük arteriyoller vazodilatör maruz önce ET-1 kullanarak ön daralma neden. Bulduğumuz bazı durumlarda olsa da değişkenlik phenylephrine gibi alfa reseptör agonistleri yanıt içinde ET-1 daha öngörülebilir bir vasoconstrictor yanıt uygular. İstenen % ~ 55 öncesi daralma ikna etmek için uygun agonistler seçmek zorunludur; Ancak dozaj ve toksik hasar üzerinde gemi önlemek için önceden kısıtlayıcı Aracısı doğru miktarını seçmek için önemlidir. Bu alt aralığı doz ile başlayan ve yukarı-4.1.2 bölümünde açıklandığı gibi etkisi için titrating tarafından elde etmek.
Yağ dokusu içinde arteriyoller pH ve sıcaklık değişikliklerine duyarlıdır; Bu nedenle, 14 uygun pH (7,4) ve sıcaklık (37 ° C) deneysel işlemi sırasında denetlemek ve izlemek önemlidir. Videomicroscopy sıkı bir şekilde düzenlenmiş sıcaklık kontrollü sistem olmakla birlikte, bu sonuçları çarpık vardiya önlemek için deney boyunca KREBS çözüm pH izlemek için zorunludur. KREBS çözüm ve çözüm her 15dk yerine basınçlandırma sırasında sürekli köpüren ve adımları yıkama pH varyasyonları zamanla azaltacaktır.
Videomicroscopy yüzdeki fonksiyonel özelliklerini incelemek için yararlı bir yöntem olmakla birlikte, teknik önemli bir öğrenme eğrisi vardır ve emek özellikle vasküler yalıtım işlemi sırasında yoğun olabilir. Biyopsi doku türüne bağlı olarak, bizim deneyim ile yağ dokusu yüzdeki cannulation yordam önemli miktarda zaman ve sabır gerektirir göstermiştir. Ayrıca, doğal zaman deneyler hassasiyeti damarlar vücut dışında olarak zaman içinde kendi fizyolojik ve fonksiyonel özelliklerini kaybederler eğilimi var. Böylece, deneyler dakika saat sonra nihai doku çürümesi önce cerrahi biyopsi gemilerin kalıcı pencere içinde gerçekleştirilmesi gerekir.
Klinik önemi ve mantığı arteriyoller eğitim doğrudan patofizyolojisi yaşayan bir konu, kaldırıldı insan kan damarlarının bozulmamış tüm kesimleri içinde yoklama yeteneğimizi tarafından desteklenen için videomicroscopy kullanan bu deneysel modelin hangi tarafından non-invaziv görüntüleme yinelenemez. Aslında, bizim yetenek doğrudan erişim ve vücutta, örneğin bir obez, işlevsel olmayan insan kan damarları incelemek için bize bu differentially hastalık koşullarında değişmiş ve roman keşfetmek yolları bir anlayış kazanmak için fırsatlar verebilir tedavi hedefleri. Ayrıca, bizim laboratuvar ve diğerleri yayımlanmış veri adipose arterioler işlevi ilişkilendirir vivo içinde ile bu ex vivo değerlendirilmesi bireyin içinde diğer vasküler yatak sistemik endotel fonksiyonları yanıt-e doğru göstermek ve ilişkilendirme kardiyovasküler risk faktörleri ile hipertansiyon, Sigara, şeker hastalığı ve inflamasyon da dahil olmak üzere. 12 , 15 , 16 biz de immunohistokimyasal bulgular visseral adipoz endotel hücreleri nitrik oksit Biyoloji ile ilgili ve Brakiyal arter akışı aracılı vazodilatasyon düşündüren arasında önemli bir ilişki gösteren veri yayımlanmıştır yağ ve sistemik dolaşımları paralel anormallikleri. 17 disfonksiyon endotel sistemik doğası göz önüne alındığında, biz bu teknik sadece insan damar dokusu çalışma ama da potansiyel hayvanlar ve klinik uzunlamasına çalışmalar için bu yöntemi kullanmak için pragmatik bir yaklaşım temsil inanıyorum tedavisinin etkileri inceleyin. Microvasculature incelemek için başka teknikler de tel myography, hangi yapmak daha az teknik olarak zor olma eğilimindedir ve önlemler için bir güç çevirici kullanarak çeşitli agonistler izole gemilerin izometrik gerginlik sağlar gibi mevcuttur. Bu yöntem Ayrıca yüzdeki fizyolojik özellikleri ile ilgili bilgi sağlarken, set-up vivo içinde koşullar özetlemek daha az uygun hale getirebilir bir içi luminal baskı sistemi kullanmaz. Videomicroscopy avantajı nispeten sabit intraluminal basınç makas Lümen içinde değişiklikleri en aza ikna etmek için yeteneğidir. Yöntem hem insanlar hem de hayvanlar benzer büyüklükte yüzdeki uygulanabilir. 9 , 12 , 18 son olarak, bu piyasada bulunan videomicroscopy sistemleri bir dizi satın alma ve kurulum için kullanılabilir olması gerekmektedir; Ancak genel olarak fizyolojik kavramlar tüm platformlar arasında oldukça düzgün. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir açıklamaları ya da rapor için çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar gönüllü katılımlarını bu çalışmalar ve yağ doku biyopsisi sağlamak için Boston Tıp Merkezi cerrahi personel için teşekkür etmek istiyorum. Dr. Gökçe Ulusal Enstitüleri (NIH) sağlık hibe HL081587, HL114675 ve HL126141 tarafından desteklenir. Dr. Farb NIH tarafından desteklenmektedir K23 HL135394 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
