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Medicine

Videomicroscopy का उपयोग करते हुए मानव वसा ऊतक Microvascular समारोह का मूल्यांकन

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56079
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Medicine and Whitaker Cardiovascular Institute, Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Videomicroscopy प्रणालियों शारीरिक और औषधीय उत्तेजनाओं के जवाब में अलग वसा ऊतक धमनियों के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस तकनीक का इस्तेमाल मोटे इंसानों में अलग वसा टिशू डोमेन में microvascular phenotypes की जांच के लिए किया जा सकता है ।

Abstract

जबकि मोटापा बारीकी से चयापचय और हृदय रोग के विकास से जुड़ा हुआ है, थोड़ा तंत्र है कि इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित के बारे में जाना जाता है । यह कल्पना की है कि समर्थक atherogenic विशेष रूप से केंद्रीय/आंत adiposity के साथ सहयोग में वसा ऊतकों से जारी मध्यस्थों रोगजनक संवहनी परिवर्तन को बढ़ावा देने के स्थानीय और प्रणालीबद्ध सकता है, और धारणा है कि हृदय रोग हो सकता है वसा ऊतक रोग का परिणाम विकसित करने के लिए जारी है । यहां, हम videomicroscopy की एक अनूठी विधि का वर्णन है कि vasodilator और बरकरार छोटे मानव की vasoconstrictor प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण शामिल मानव विषयों के रहने का वसा डिपो से हटा दिया धमनियों । Videomicroscopy औषधीय या शारीरिक उत्तेजनाओं एक दबाव प्रणाली है कि vivo परिस्थितियों में नकल का उपयोग करने के जवाब में अलग microvessels के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तकनीक pathophysiology और आणविक तंत्र है कि वसा ऊतक वातावरण के भीतर स्थानीय रूप से संवहनी रोग के लिए योगदान की समझ हासिल करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । इसके अलावा, वसा ऊतक microvasculature में विषमता भी प्रणालीगत रोगों के साथ जोड़ा गया है । हम इस तकनीक को लागू करने के लिए डिपो विशेष मोटापे से ग्रस्त विषयों में संवहनी प्रतिक्रियाओं की जांच । हम दोनों में वृद्धि हुई प्रवाह और acetylcholine वसा धमनियों में endothelium-निर्भर vasodilation का आकलन (५०-३५० µm आंतरिक व्यास, 2-3 मिमी लंबाई में) एक ही व्यक्ति से वसा सर्जरी के दौरान दो अलग बैरिएट्रिक डिपो से अलग । हम का प्रदर्शन किया है कि आंत वसा प्रदर्शन बिगड़ा endothelium-निर्भर vasodilation से धमनियों चमड़े के नीचे डिपो से अलग जहाजों की तुलना में । निष्कर्ष का सुझाव है कि आंत microenvironment संवहनी endothelial शिथिलता जो नैदानिक अवलोकन के लिए प्रासंगिक हो सकता है प्रणालीगत रोग तंत्र में वृद्धि हुई आंत adiposity जोड़ने के साथ जुड़ा हुआ है । videomicroscopy तकनीक विभिंन वसा डिपो से संवहनी phenotypes की जांच के रूप में अच्छी तरह के रूप में मोटापे और चयापचय रोग के विभिंन डिग्री के साथ व्यक्तियों भर में निष्कर्षों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि भी नैदानिक हस्तक्षेप के जवाब में longitudinally संवहनी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

Videomicroscopy मानव विषयों पूर्व विवोरहने से हटा दिया छोटे धमनियों के रक्तनली समारोह की जांच करने के लिए उपयोग एक उपयोगी तकनीक है । हमारी प्रयोगशाला विभिंन वसा ऊतक डिब्बों से छोटे microvessels बाहर विदारक पर ध्यान केंद्रित किया है microvasculature पर विभिंन वसा microenvironments के प्रभाव को चिह्नित । इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि रक्त वाहिकाओं मानव शरीर से हटा कार्यात्मक रहते है और बायोप्सी के बाद घंटे के लिए मिनट के भीतर आसानी से जांच की जा सकती है । शारीरिक स्थितियों को नकल उतारा और स्थिर transmural दबाव माइक्रो ग्लास cannulas के माध्यम से intraluminal अंतरिक्ष में बनाए रखा है जो vivo विशेषताओं में कई दोहराऊंगा । 1 , 2 इसके अतिरिक्त, एक विश्वसनीय videomicroscopy सेट-अप स्वचालित बढ़त का पता लगाने सॉफ्टवेयर के साथ दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है endothelium-निर्भर और-स्वतंत्र vasodilator और पृथक की vasoconstrictor क्षमता वास्तविक समय में जहाजों, शारीरिक और औषधीय उत्तेजनाओं के जवाब में तेजी से शारीरिक मूल्यांकन की अनुमति । 3 अंय microvascular तकनीक भी ऐसे तार myography के रूप में उपलब्ध है जो कम समय लगता है और एक शक्ति transducer द्वारा विभिंन एगोनिस्ट को मापने के तनाव प्रतिक्रियाओं हो जाता है ।

हमारी प्रयोगशाला मोटापे और संवहनी रोग के बीच संबंधों की जांच करने के लिए videomicroscopy लागू किया गया है, vasculature पर विभिन्न वसा ऊतक डोमेन के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित. इंट्रा पेट आंत वसा के संचय के साथ केंद्रीय adiposity सबसे बारीकी से adipocytokine उत्पादन, चयापचय रोग, और cardiometabolic जोखिम से जुड़ा हुआ है । यह माने गया है कि वसा ऊतक के साथ रोग प्रो-atherogenic साइटोकिंस और adipokine dysregulation का उत्पादन दृढ़ता से इन प्रक्रियाओं में फंसा रहे हैं, लेकिन विशिष्ट विनियामक अणुओं और उपचार के लक्ष्य काफी हद तक रह अनदेखा. 4 इसके अलावा, स्थानीय वसा ऊतक स्तर पर, केशिका rarefaction और बिगड़ा छिड़काव वसा ऊतक pseudohypoxia और चयापचय dysregulation के लिए जोड़ा गया है । परिकल्पना है कि हृदय रोग वसा ऊतक रोग का परिणाम हो सकता है विकसित हो रहा है । प्रो atherogenic वसा से जारी मध्यस्थों, विशेष रूप से केंद्रीय/आंत adiposity के साथ सहयोग में, संभावना endothelial रोग और रोगजनक संवहनी परिवर्तन है कि स्थानीय रूप से वसा vasculature में प्रकट हो सकता है और का उपयोग कर पाया को बढ़ावा देने के करवायी गई कार्यप्रणाली बताई । 5

पृथक वसा ऊतक धमनियों के कार्यात्मक मूल्यांकन pathophysiology और आणविक तंत्र है कि मानव मोटापे में संवहनी रोग में योगदान की समझ हासिल करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है । तंत्र है कि वसा डिपो विशेष रोग के लिए योगदान की जांच करने के लिए, हम microvasculature के endothelium-निर्भर और स्वतंत्र vasodilatory प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए तरीके विकसित किया है, और विभिंन विनियामक की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन युग्मित आंत और चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) वसा ऊतक बैरिएट्रिक सर्जरी के समय मोटापे से ग्रस्त विषयों से प्राप्त नमूनों में उंमीदवारों ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल और उदाहरणों को बोस्टन विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी, प्रोटोकॉल #H-२५६४४) द्वारा अनुमोदित किया गया और हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया. सभी विषयों में भागीदारी से पहले लिखित सूचित सहमति प्रदान की ।

< p class = "jove_title" > 1. समाधानों की तैयारी और माइक्रो ग् Cannulas

  1. तैयार 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic अम्लीय खारा (HEPES) समाधान. 1 L के लिए, भंग ८.०५९ g NaCl, ०.२९८ g KCl, ०.२९६ g MgSO 4 & #8226; 7H 2 o, ०.२३५ छ CaCl 2 & #8226; 2H 2 o, ०.१६ g KH 2 पो 4 , ०.०१ g EDTA, १.०८१ g डी-ग्लूकोज, और २.३८३ ग्राम HEPES एसिड के ९५० मिलीलीटर में पानी. 1 एल करने के लिए मात्रा बनाने के लिए जल के साथ । NaOH का उपयोग कर ७.४ को पीएच समायोजित करें । HEPES बफर 7 दिन तक संग्रहित किया जा सकता है पर 4 & #176; ग.
  2. 20x साल्ट बफर स्टॉक तैयार करें । के लिए 1 L, add १४३.८ g NaCl, ७.० g KCl, ५.९ g MgSO 4 , व ७.४ g CaCl 2 & #8226; 2H 2 O में ९०० मिलीलीटर से आसुत जल । 1 L को मात्रा कर जल के साथ । स्टोर स्टॉक समाधान पर 4 & #176; C.
  3. 20x बफर स्टॉक तैयार करें । 1 L के लिए, add २६.८ g NaHCO 3 और ०.२ g EDTA & #903; 2H 2 O में ९०० मिलीलीटर पानी की । 1 L को मात्रा कर जल के साथ । स्टोर स्टॉक समाधान पर 4 & #176; C.
  4. शारीरिक प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किए जाने वाले KREBS सॉल्यूशन तैयार करते हैं । 1 L के लिए, ९०० मिलीलीटर पानी में जोड़ें, 20x बफर स्टॉक की ५० मिलीलीटर, 20x साल्ट बफर सॉल्यूशन की ५० मिलीलीटर, ०.९९ ग्राम डी-ग्लूकोज और ०.१६ जी KH 2 पो 4 । ७.४ के लिए पीएच का उपयोग कर एचसीएल समायोजित करें । बफर का पीएच बनाए रखने के लिए, लगातार हलचल और तेल या बुलबुला लगातार के साथ कवर ।
    1. हर 20 मिनट पीएच की जांच करें. KREBS समाधान ताजा दैनिक बनाओ ।
  5. के आंतरिक व्यास के साथ माइक्रो ग्लास cannulas बनाने के लिए ४०-२४० & #181; एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुई/पिपेट खींचने का उपयोग कर मीटर । कांच cannulas का आकार पृथक रक्त वाहिकाओं के आंतरिक व्यास के आकार से निर्धारित होता है (50-350 & #181; m) । वैकल्पिक रूप से, पूर्व निर्धारित आकार के माइक्रो ग्लास cannulas खरीद ।
< p class = "jove_title" > 2. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. acetylcholine (10 -2 मीटर, स्टॉक समाधान) तैयार करें । 10 मिलीलीटर पानी में १८.२९ ग्राम भंग । भंडार 1 मिलि aliquots के स्टॉक सॉल्यूशन (10 -2 M) पर-८० & #176; ग. प्रयोग के दिन प्रश्नपत्र पतला करने के लिए निंनलिखित कार्य सांद्रता प्राप्त करने के लिए: 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 एम.
  2. तैयार papaverine (2 x 10 -2 मीटर, स्टॉक समाधान) । 10 मिलीलीटर पानी में ०.०७५१७ ग्राम भंग । तैयार 10 & #181; L aliquots के स्टॉक सॉल्यूशन और स्टोर पर-८० & #176; ग. प्रश्नपत्र को पतला प्राप्त करने के लिए 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 मीटर पर प्रयोग के दिन.
  3. तैयार endothelin-1 (एट-1, 2 एक्स 10 -5 एम, स्टॉक समाधान) । भंग ५० & #181; g endothelin-1 में 1 मिलीलीटर 1% BSA/ भंडार 1 मिलीलीटर aliquots स्टॉक समाधान (2 x 10 -5 M) पर-८० & #176; C. प्रयोग के दिन पर एक काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पतला 10 -10 M प्रयोग के दिन पर.
  4. स्टोर रिएजेंट या तो-20 & #176; c या up-८० & #176; c फ्रीजर उपलब्ध के प्रकार पर निर्भर करता है, लेकिन 6 महीने से अधिक नहीं है ।
< p class = "jove_title" > 3. वसा ऊतक संग्रह और पोत तैयारी

  1. भर्ती मोटापे से ग्रस्त पुरुषों और महिलाओं (बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) & #8805; ३५ kg/एम & #178;, आयु & #8805; 18 वर्ष) बोस्टन मेडिकल सेंटर (बीएमसी) में बैरिएट्रिक सर्जरी कार्यक्रम में दाखिला लिया. इन प्रयोगों में कुल ४० विषयों ने भाग लिया ।
  2. आपरेशन प्रदर्शन सर्जन द्वारा नियोजित बैरिएट्रिक सर्जरी के दौरान चमड़े के नीचे और आंत वसा ऊतक के नमूने एकत्र.
    1. निचले उदर की दीवार से चमड़े के नीचे वसा ऊतकों फसल और अधिक से अधिक ओमेंटम, क्रमशः आंत वसा । ठेठ वसा ऊतक नमूना आकार 3-10 मिलीग्राम ऊतक से भिन्न होता है.
    2. जगह के ऊतकों को तुरंत कोल्ड HEPES बफर सॉल्यूशन में ७.४ की pH के साथ और 4 & #176 पर स्टोर करें; C 24 ज.
      तक के लिए नोट: इसके अतिरिक्त, वसा धमनियों दुबला व्यक्तियों के रूप में अच्छी तरह से हर्निया की मरंमत या प्लास्टिक सर्जरी के रूप में सर्जरी के अंय प्रकार के दौरान से प्राप्त किया जा सकता है, और भी ट्रांस-चर्म पेट वसा पैड बायोप्सी के माध्यम से उपचर्म डिपो से biopsied जा सकता है < सुप class = "xref" > 6 .
  3. एक ऊतक विच्छेदन माइक्रोस्कोप, माइक्रो कैंची और सूक्ष्म संदंश का उपयोग कर, ध्यान से छोटे वसा धमनियों (५०-३५० & #181; एम intraluminal व्यास, 2-3 मिमी लंबाई में) से आसपास के वसा और संयोजी ऊतक को दूर.
  4. कांच केशिका पिपेट पर cannulating से पहले छोटे नायलॉन या रेशम टांके का उपयोग धमनियों पर सभी शाखाओं बंद टाई । ध्यान से टुकड़े धमनियों के बाद भी arteriole दीवार के मामूली क्षति महत्वपूर्ण कार्यात्मक परिवर्तन का कारण बनता है ।
    1. प्रकाश और गर्मी के लिए पोत जोखिम को कम करने के रूप में यह vasodilation कारण हो सकता है । चूंकि यह कभी-कभार venules से धमनियों भेद करना मुश्किल हो सकता है, जहाजों के सुझावों लेनेवाला द्वारा आकार और वाहिकाओं के चिकनी मांसपेशी टोन की पहचान । धमनियों आमतौर पर छोटे होते है और venules.
      2. की तुलना में अधिक से अधिक टोन का प्रदर्शन
  5. अंग कक्ष तैयार करते हैं. धीरे एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर KREBS समाधान के साथ कांच केशिका पिपेट और रबर टयूबिंग भरें ।
  6. एक बार रबर टयूबिंग भर जाता है और कांच केशिका पिपेट अंग कक्ष के भीतर KREBS समाधान में जलमग्न हैं, सुरक्षित धमनियों पर cannulate पिपेट और नायलॉन या रेशम टांका समुद्री मील ध्यान से arteriole के दोनों सिरों टाई ।
  7. ऊपर KREBS समाधान के साथ अंग चैंबर भरने के लिए 2 मिलीलीटर
  8. उल्टे माइक्रोस्कोप (आवर्धन 10x/0.25 उद्देश्य) और वीडियो कैमरा के साथ एक मंच पर अंग चैंबर सुरक्षित ।
  9. वास्तविक समय में 1 kHz (1 फ़्रेम/s) की एक नमूना दर पर स्ट्रीम है कि एज का पता लगाने सॉफ्टवेयर पर बारी.
  10. बुलबुले प्रयोगात्मक त्रुटि को लागू कर सकते हैं के रूप में KREBS समाधान भर दबाव microbubbles से मुक्त जलाशयों, करने के लिए प्रेशर ट्यूबिंग के एक तरफ कनेक्ट । अंग कक्ष के लिए दबाव ट्यूबिंग के दूसरे पक्ष कनेक्ट.
  11. स्वच्छ टयूबिंग के साथ दबाव transducer के लिए KREBS समाधान भरा दबाव जलाशयों कनेक्ट ।
  12. इन दोनों जलाशयों की ऊंचाई को विनियमित करके इंट्रा-चमकदार बहाव को नियंत्रित करता है; इस प्रकार, जब जलाशयों को एक ही ऊँचाई पर रखा जाता है, तो कोई भी अंतर-चमकीला प्रवाह नहीं होगा ।
  13. एक बार इन सभी प्रक्रियाओं को पूरा कर रहे हैं, हीटिंग ब्लॉक और सॉफ्टवेयर प्रोग्राम पर तापमान बनाए रखने के लिए चालू करें ३७ & #176; ग. लगातार perfuse KREBS सॉल्यूशन के साथ पोत और aerate के गैस मिश्रण से 5% कं 2 , 21% O 2 और ७४% N 2 < सुप class = "xref" > 7 , < सुप class = "xref" > 8 पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान.
    14. इि दाब insi को प्राप्त करने के
  14. de अलग जहाजों के लुमेन धीरे-myo-इंटरफ़ेस पैनल में दबाव नियंत्रण इकाई के माध्यम से intraluminal दबाव (5 mmHg, हर 5 मिनट) में वृद्धि, ऐसा करने के लिए एक धीमी दर से endothelial परत नुकसान से बचने के लिए कर रहे हैं ।
    नोट: एक बार दबाव ६० mmHg तक पहुंच जाता है, एक 20-30 मिनट equilibration अवधि के लिए पोत को स्थिर करने की आवश्यकता है । सभी संवहनी समारोह अध्ययन ६० mmHg और ३७ & #176 पर प्रदर्शन कर रहे हैं, पीएच ७.४ पर सी । < सुप वर्ग = "xref" > 7
< p class = "jove_title" > 4. वसा Microvascular समारोह का मूल्यांकन

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: सामान्य तौर पर, वसा arteriole endothelial-निर्भर vasodilation शारीरिक (प्रवाह प्रेरित) और औषधीय उत्तेजनाओं (के साथ-प्रेरित) के जवाब में किया जा सकता है ।

  1. प्रवाह-मध्यस्थता, endothelial-आश्रित vasodilation
    1. म् प्रणा, रर त का व्यास वसा arteriole पर आराम (Di) । यह आराम आधारभूत व्यास के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
    2. पूर्व-कसना रक्त वाहिकाओं के लिए ~ ५५% आराम से आधारभूत व्यास (डीपी) जोड़कर 1 & #181; L के endothelin-1 (ET-1, 10 & #8722; 10 M) सीधे स्नान करने के लिए और प्रभाव के लिए 5 मिनट रुको । इस प्रक्रिया को दोहराने तक पहुंचने तक वांछित ~ ५५% पूर्व सीमित राज्य ।
    3. के बाद पूर्व कसना, वसा ऊतक धमनियों के intraluminal अंतरिक्ष में निरंतर प्रवाह प्रेरित, बराबर और विपरीत दिशाओं में इतना है कि एक दबाव फर्क मतलब intraluminal दबाव बदलने के बिना पोत भर में विकसित किया जा सकता है की ६० mmHg.
      नोट: उदाहरण के लिए, एक जलाशय ऊंचाई में 10 सेमी से ऊपर ले जाता है, तो अन्य एक दबाव ढाल बदलने के लिए 10 सेमी से नीचे ले जाया जा करने की जरूरत है और इस तरह intraluminal प्रवाह की दर बदल जाते हैं । यदि अधिक सटीक प्रवाह दर माप वांछित हैं, एक मात्रात्मक प्रवाह मीटर प्रणाली प्रयोगात्मक सेट अप करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
      4. प्रवाह प्रेरण की दीक्षा के बाद
    4. माप प्रवाह-मध्यस्थता फैलाव 3-5 मिनट । intraluminal प्रवाह (दबाव ढाल) के स्तर 0-100 cmH 2 की सीमा में हो सकता हे । दबाव ढाल के प्रत्येक वेतन वृद्धि के द्वारा & #916; 10 cmH 2 ओ हर 5-6 मिनट, अधिकतम १०० cmH 2 ओ
      नोट: लुमेन में स्थिर लामिना प्रवाह प्रेरित करने के लिए, दोनों माइक्रो ग्लास प्रवेशनी टिप आकार धमनियों के भीतरी व्यास के बहुत करीब होने की जरूरत है; अंयथा, यह लुमेन के अंदर अशांत प्रवाह का उत्पादन और अवांछित माप त्रुटियों को प्रेरित करेगा ।
    5. प्रवाह मध्यस्थता फैलाव आकलन के बाद, एक ही ऊंचाई (६० mmHg) के लिए दबाव जलाशयों वापसी.
    6. फिर, तुरंत चैंबर से समाधान को हटाने और ताजा KREBS समाधान के साथ बदलने के द्वारा arteriole और चैंबर धोने । यह सावधानी के रूप में कक्ष के भीतर निलंबित arteriole को बाधित नहीं करने के साथ किया जाता है ।
    7. इस प्रक्रिया को दोहराने 20-30 मिनट के लिए 3-4 बार, या जब तक अलग पोत आराम आधारभूत व्यास के लिए रिटर्न ।
  2. Acetylcholine-मध्यस्थता, endothelial-आश्रित, vasodilation
    1. जब वसा arteriole आराम आधारभूत व्यास के लिए वापस आ गया है, पूर्व-कसना पोत ~ ५५% प्रशासन द्वारा endothelin-1 (एट-1, 10 & #8722; 10 M) सीधे नहाने के लिए, के रूप में खंड 4.1.2 में ऊपर वर्णित है ।
    2. के बाद पूर्व-कसना, क्रमिक रूप से बढ़ती खुराक (2 & #181; L) acetylcholine के जो एक रिसेप्टर मध्यस्थता है, नाइट्रिक ऑक्साइड एगोनिस्ट (10 -9 करने के लिए 10 -5 मीटर) सीधे स्नान करने के लिए. प्रत्येक खुराक के प्रशासन के बाद arteriolar व्यास 5 मिनट में परिवर्तन रिकॉर्ड.
    3. एक बार पोत अंतिम का प्रशासन के बाद एक पठार तक पहुंच गया है, KREBS समाधान के साथ पोत 3-4 बार धो । पोत को ठीक करने और आधारभूत व्यास आराम करने के लिए वापसी के लिए 20-30 मिनट की अनुमति दें । मदद करने के लिए अंग वक्रता में पीएच बनाए रखने, परिवर्तन KREBS समाधान हर 15 मिन.
  3. arteriole N डब्ल्यू -नाइट्रो-एल-arginine मिथाइल एस्टर (एल-नाम, 10 -4 मीटर), 30 मिनट के लिए नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस के एक अवरोधक, और फिर दोहराने 4.2.1 और 4.2.2 के सापेक्ष योगदान की विशेषताएं नाइट्रिक ऑक्साइड को vasodilation.
  4. का आकलन endothelium-स्वतंत्र vasodilation (संवहनी चिकनी मांसपेशी समारोह) और पोत व्यवहार्यता papaverine की खुराक बढ़ाने के एक अनुक्रमिक प्रशासन द्वारा (10 -8 करने के लिए 10 -4 मीटर) सीधे स्नान करने के लिए. यदि पोत व्यास को वापस नहीं करता है, या papaverine ( यानी उचित vasodilation) के जवाब में आराम आधारभूत (Di) व्यास से अधिक है, पोत गैर व्यवहार्य और डेटा बिंदुओं को त्यागने पर विचार करें ।
< p class = "jove_title" > 5. डेटा विश्लेषण और गणना

  1. संवहनी जेट की गणना । पोत व्यास में आधारभूत अंतर के लिए खाता करने के लिए डेटा व्यंजक के लिए प्रतिशत vasodilation का उपयोग करें और निम्न समीकरण का उपयोग करने की गणना:
    % vasodilation = (डीटी-डीपी/Di-dp) & #215; १००
    जहां डीटी एक निश्चित समय बिंदु पर दर्ज व्यास है (अधिकतम व्यास), डीपी वाहिकासंकीर्णन एजेंट ( यानी के अलावा के बाद दर्ज व्यास है । एट-1 प्रेरित कसना व्यास), और Di व्यास वाहिकासंकीर्णन एजेंट के अलावा तुरंत पहले दर्ज की गई है (आधारभूत व्यास आराम) । < सुप वर्ग = "xref" > ९
  2. vasodilation और वाहिकासंकीर्णन संवेदनशीलता (खुराक-प्रतिक्रिया) को परिभाषित करने के लिए एक एगोनिस्ट की एकाग्रता के रूप में, papaverine, या एट-1 कि अधिक से अधिक की प्रतिक्रिया (ईसी ५० ) जो एक द्वारा परिभाषित किया जा सकता है ५०% बटोरता sigmoidal पैरामीटर और प्लॉट किए गए, जैसा कि पहले बताया गया है । < सुप वर्ग = "xref" > 10
    नोट: vasodilation वसा के अंतर-प्रेक्षक reproducibility अध्ययनों ने हमारी प्रयोगशाला में ०.९९ (n = 10 पोत प्रयोगों) का एक उच्च सहसंबंध गुणांक (CC) किया है । microvessels
    3. < p class = "jove_title" > 6. सांख्यिकीय विश्लेषण

    1. व्यक्त सतत मापन के रूप में माध्य & #177; SEM. ये आम तौर पर वितरित किया जाता है । दोहराया द्वारा वसा धमनियों में संवहनी जेट विश्लेषण-उपाय दो तरह ANOVA.
    2. वैकल्पिक रूप से, के अंतर्गत क्षेत्र की तुलना करें (ईमेज) प्लॉट के लिए संचई vasodilation-उपचार समूह के बीच प्रतिसाद । सभी मामलो म, गौर P & #160; & #60; ०.०५ सांख्यिकीय भरपुर.

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Representative Results

हमारी प्रयोगशाला videomicroscopy का इस्तेमाल किया है endothelium निर्भर है और स्वतंत्र vasodilation, साथ ही वसा ऊतक धमनियों के vasocontractile समारोह की जांच के चमड़े के नीचे और मोटापे से ग्रस्त मनुष्यों की आंत वसा से अलग । विशेषता प्रयोगात्मक सेट-अप में प्रदर्शित किया जाता है चित्र 1a। वसा ऊतक धमनियों दो ग्लास केशिका पिपेट के बीच निलंबित कर दिया और अंग कक्ष के भीतर टांके के साथ जगह में सुरक्षित के रूप में चित्र 1bमें दिखाया गया है । के रूप में ५.१ धारा में ऊपर वर्णित है, arteriolar प्रतिक्रियाओं तो आधार रेखा (चित्र 2a) पर पोत की जांच द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, एट-1 के साथ पूर्व-कसना के बाद आधारभूत व्यास के ~ ५५% (चित्रा बी2), और फिर एगोनिस्ट-प्रेरित vasodilation और संवहनी लुमेन की छूट के रूप में चित्रा 2cमें प्रदर्शित.

हम और दूसरों को मनाया है कि endothelium-निर्भर vasodilation प्रतिक्रियाओं को बढ़ा प्रवाह (कतरनी तनाव)11 और12 के लिए काफी आंत में चमड़े के नीचे की तुलना में कुंद कर दिया गया वसा धमनियों (चित्र 3, 4 बी ) मानव मोटापे में. हालांकि, papaverine के जवाब में endothelium-स्वतंत्र vasodilation दो डिपो (चित्रा 3सी) के बीच अंतर नहीं बदला गया था । साथ में, इन निष्कर्षों का सुझाव है कि आंत डोमेन में संवहनी शिथिलता काफी हद तक रोग के प्रारंभिक दौर में, endothelium के स्तर पर शिथिलता का परिणाम है । यह तकनीक बरकरार छोटे मानव धमनियों के vasodilator प्रतिक्रियाओं के व्यवस्थित विश्लेषण परमिट और भी मानव vasculature के अंय सुलभ क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है । पूर्व vivo प्रणाली ऐसी संवहनी endothelial इंसुलिन प्रतिरोध के एक सूचकांक के रूप में इंसुलिन के लिए प्रतिक्रियाओं के रूप में कई औषधीय तरीकों का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है6, या खुराक-प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए नाइट्रोग्लिसरीन संवहनी चिकनी मांसपेशी परीक्षण परत लिहितो. 12 मुंह आरएनए के रूप में जैविक तरीकों को भी संभावित नियामकों को समझने के लिए यंत्रवत चौखटे को विकसित करने के लिए13 पेश किया जा सकता है कि विशिष्ट रोग की स्थिति के तहत संवहनी रोग प्रदान.

Figure 1
चित्र 1: Videomicroscopy सेट-अप. (A) videomicroscopy अंग कक्ष के घटकों को दर्शाने वाली छवि । (ख) अंग कक्ष में दो ग्लास केशिका पिपेट के बीच घुड़सवार मानव वसा arteriole की छवि । शारीरिक और औषधीय उत्तेजनाओं कि जांच की जा सकती है और मात्रा विशेष विश्लेषण सॉफ्टवेयर और प्रणाली में एक औंधा कैमरा लगाव का उपयोग कर के जवाब में पोत व्यास परिवर्तन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: दबाव videomicroscopy का उपयोग करके microvascular vasodilation का चित्रण. (क) आराम आधारभूत arteriolar व्यास (पद-प्रणा व्यास, कोई एगोनिस्ट या उत्तेजना: डि) (ख) पूर्व-कसना व्यास (बाद एट-१ प्रेरित कसाव व्यास: डीपी), (ग) एगोनिस्ट-प्रेरित vasodilated व्यास (बाद में जोड़ा गया था: DT) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Endothelium-निर्भर, और-स्वतंत्र vasodilation बनाम आंत में वसा धमनियों मोटापे से ग्रस्त मनुष्यों में । Endothelium-निर्भर vasodilation काफी आंत में चमड़े के नीचे वसा ऊतक धमनियों की तुलना में क्षीण हो गया था जब (ए) द्वारा मूल्यांकन (एक) वृद्धि हुई प्रवाह (चमड़े के नीचे और आंत वाहिकाओं, n = 20), या (बी) acetylcholine खुराक प्रतिक्रिया के साथ/बिना L-नाम (युग्मित चमड़े के नीचे और आंत वाहिकाओं, n = 16). (ग) Endothelium-स्वतंत्र vasodilation आंत और चमड़े के नीचे धमनियों के बीच अंतर से बदल नहीं था जब papaverine खुराक प्रतिक्रिया (युग्मित चमड़े के नीचे और आंत वाहिकाओं, n = 8) द्वारा मूल्यांकन किया गया । * डिपो के बीच समूह मतभेद का अर्थ है; † का अर्थ है डिपो-acetylcholine के बीच विशिष्ट मतभेद L-acetylcholine की तुलना में अकेले नाम; एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM, p & #60; ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

विच्छेदन और वसा धमनियों की अलगाव ऊतक आसपास से एक समय लेने वाली और श्रम विस्तार और तकनीकी प्रोटोकॉल के लिए सावधान ध्यान के साथ गहन प्रक्रिया हो सकती है । microdissection प्रक्रिया जटिल कौशल और विशेष विच्छेदन बर्तन चिकनी मांसपेशी या microvasculature के endothelial कोशिका परतों को संभावित नुकसान को रोकने की आवश्यकता है । यहां तक कि arteriolar दीवार में छोटे आकस्मिक पंचर intraluminal प्रणा और एक असफल प्रयोग में परिणाम को रोका जा सकता है । इसके अतिरिक्त, cannulation धमनियों का उपयोग टांके पोत के प्रत्येक छोर पर कांच केशिका पिपेट सुझावों के बीच धमनियों सुरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

मानव पृथक microvessels ६० mmHg पर प्रणा के 30-40 मिनट के बाद सहज myogenic टोन विकसित कर सकते हैं । हालांकि, हमने पाया है कि मानव वसा धमनियों आम तौर पर आकार ५०-३५० आंतरिक चमकदार व्यास के µm संवहनी चिकनी मांसपेशियों की विरल परतों के साथ अपेक्षाकृत छोटे होते हैं, और कंकाल की मांसपेशी धमनियों की तुलना में महत्वपूर्ण myogenic टोन विकसित करने के लिए नहीं करते हैं । हम इस प्रकार वाहिकाविस्फारक के लिए जोखिम से पहले एट-1 का उपयोग कर इन छोटे धमनियों के पूर्व कसना प्रेरित । हम पाते है कि एट-1 एक अधिक पूर्वानुमान vasoconstrictor प्रतिक्रिया डालती है, जबकि कुछ मामलों में वहां phenylephrine जैसे अल्फा रिसेप्टर एगोनिस्ट के लिए प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता हो सकता है । यह एक वांछित ~ ५५% पूर्व कसना प्रेरित करने के लिए उपयुक्त एगोनिस्ट का चयन करने के लिए आवश्यक है; हालांकि यह भी खुराक और पोत को विषाक्त नुकसान को रोकने के लिए पूर्व कसना एजेंट की सही मात्रा का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम धारा 4.1.2 में वर्णित के रूप में कम रेंज खुराक और अप-titrating प्रभाव के साथ शुरू करने से यह हासिल ।

वसा ऊतक में धमनियों पीएच और तापमान में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं; 14 इसलिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान उचित पीएच (७.४) और तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) पर नजर रखने और नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि videomicroscopy एक कसकर विनियमित तापमान नियंत्रित प्रणाली है, यह प्रयोग भर में KREBS समाधान के पीएच की निगरानी करने के लिए परिवर्तन है कि परिणाम तिरछा हो सकता है से बचने के लिए आवश्यक है । KREBS समाधान और समाधान के प्रतिस्थापन प्रणा और धुलाई कदम के दौरान हर 15 मिनट के सतत bubbling समय के साथ पीएच बदलाव कम हो जाएगा ।

जबकि videomicroscopy microvessels के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है, तकनीक एक पर्याप्त सीखने की अवस्था है और विशेष रूप से संवहनी अलगाव की प्रक्रिया के दौरान श्रम गहन हो सकता है । ऊतक है कि biopsied है के प्रकार पर निर्भर करता है, वसा ऊतक microvessels के साथ हमारे अनुभव का प्रदर्शन किया है कि cannulation प्रक्रिया समय और धैर्य की महत्वपूर्ण राशि ले सकते हैं । इसके अतिरिक्त, वहां निहित समय शरीर के बाहर वाहिकाओं के रूप में प्रयोग करने के लिए संवेदनशीलता है समय के साथ अपने शारीरिक और कार्यात्मक गुण खो देते हैं । इस प्रकार, प्रयोगों के लिए मिनट के जहाजों के व्यवहार्य खिड़की शल्य बायोप्सी के बाद अंतिम ऊतक क्षय से पहले करने के लिए की जरूरत है ।

नैदानिक प्रासंगिकता और इस प्रयोगात्मक धमनियों अध्ययन के लिए videomicroscopy का उपयोग मॉडल के तर्क हमारे सीधे मानव रक्त जहाजों के बरकरार पूरे क्षेत्रों में रहने वाले विषयों से हटा pathophysiology जांच करने की क्षमता का समर्थन किया है, जो नॉन-इनवेसिव इमेजिंग द्वारा दोहराया नहीं जा सकता । वास्तव में, हमारे सीधे उपयोग और में बेकार मानव रक्त वाहिकाओं की जांच करने की क्षमता, उदाहरण के लिए एक मोटापे से ग्रस्त शरीर, हमें रास्ते में अंतर्दृष्टि लाभ है कि अंतर रोग की स्थिति और खोज उपंयास में बदल रहे है के साथ प्रदान कर सकते है चिकित्सीय लक्ष्य । इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला से प्रकाशित डेटा और दूसरों को पता चलता है कि वसा arteriolar समारोह के पूर्व vivo आकलन एक व्यक्ति के भीतर अन्य संवहनी बिस्तरों में vivo प्रणालीगत endothelial समारोह प्रतिक्रियाओं में के साथ संबंधित है, और सहयोगी उच्च रक्तचाप सहित हृदय जोखिम कारकों के साथ, धूम्रपान, मधुमेह, और सूजन. 12 , 15 , 16 हम भी आंत वसा endothelial कोशिकाओं और बाहु धमनी प्रवाह में नाइट्रिक ऑक्साइड जीवविज्ञान के लिए प्रासंगिक immunohistochemical निष्कर्षों के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध का प्रदर्शन डेटा प्रकाशित किया है-मध्यस्थता vasodilation सुझाव वसा और प्रणालीगत संचलन में समानांतर विषमता । 17 endothelial शिथिलता के प्रणालीगत प्रकृति दिया, हम मानते है कि इस तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है एक व्यावहारिक दृष्टिकोण न केवल मानव संवहनी ऊतक अध्ययन करने के लिए, लेकिन यह भी संभावित पशुओं में इस विधि का उपयोग और नैदानिक अनुदैर्ध्य अध्ययन करने के लिए उपचार प्रभाव की जांच करें । अंय तकनीकों microvasculature की जांच करने के लिए भी ऐसे तार myography के रूप में उपलब्ध हैं, जो कम करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन प्रदर्शन और अलग जहाजों के isometric तनाव के उपायों के लिए अनुमति देता है विभिंन एगोनिस्ट एक बल transducer का उपयोग कर । हालांकि इस विधि भी microvessels के शारीरिक गुणों के बारे में जानकारी प्रदान करता है, सेट अप एक अंतर-चमकदार दबाव प्रणाली है जो यह कम vivo में दोहराऊंगा के लिए उपयुक्त प्रदान कर सकते है उपयोग नहीं करता है स्थितियों । videomicroscopy का एक लाभ के लुमेन में कतरनी में परिवर्तन को कम करने के लिए एक अपेक्षाकृत लगातार intraluminal दबाव पैदा करने की क्षमता है । विधि दोनों मनुष्यों और पशुओं में समान आकार microvessels के लिए लागू किया जा सकता है । 9 , 12 , 18 अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध videomicroscopy प्रणालियों के एक नंबर खरीद और सेट अप के लिए उपलब्ध हैं; हालांकि समग्र शारीरिक अवधारणाओं सभी प्लेटफार्मों भर में काफी समान हैं । 2 , ६ , 18

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट में कोई प्रकटीकरण या हितों का टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इन अध्ययनों में अपनी भागीदारी के लिए स्वयंसेवकों को धंयवाद देना चाहूंगा और वसा ऊतक बायोप्सी प्रदान करने के लिए बोस्टन मेडिकल सेंटर में शल्य चिकित्सा स्टाफ । डॉ Gokce स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) अनुदान HL081587, HL114675, और HL126141 द्वारा समर्थित है । Dr. Farb NIH ग्रांट K23 HL135394 द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Name
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Endothelin-1 Sigma Aldrich E7764
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride Sigma Aldrich N5751
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
Potassium chloride (KCL) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Papaverine Sigma Aldrich P3510
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) Sigma Aldrich S9638
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Forceps Finescience tools 15000-08
Inverted microscope Zeiss Achromat
Laboratory tubing Euro-Pharm 250100306F999
Needle/pippette puller David kopf instruments 720
Ophthalmic monofilament nylon suture Surgical specialties A7756N
Scissors Finescience tools 150000-08
Vessel Chamber DMT VAS v.2.1

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References

  1. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
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  18. Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).

Tags

चिकित्सा अंक १२७ फिजियोलॉजी microvasculature वसा ऊतक प्रतिरोध धमनियों मोटापा endothelium
Videomicroscopy का उपयोग करते हुए मानव वसा ऊतक Microvascular समारोह का मूल्यांकन
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Farb, M. G., Park, S. Y., Karki, S., Gokce, N. Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy. J. Vis. Exp. (127), e56079, doi:10.3791/56079 (2017).

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