Summary
Videomicroscopy системы используются для изучения функциональных свойств изолированных жировой ткани артериол в ответ на физиологические и фармакологические стимулы. Этот метод может использоваться для изучения микрососудистой фенотипов доменов разных жировой ткани в тучных людей.
Abstract
В то время как ожирение тесно связано с развитием метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний, мало что известно о механизмах, которые регулируют эти процессы. Он предположил, что про атерогенные посредников, освобожден из жировой ткани, особенно в связи с Центральной/висцеральных ожирение может способствовать патогенных сосудистые изменения локально и системно, и понятие, сердечно-сосудистых заболеваний может быть следствием дисфункции жировой ткани продолжает развиваться. Здесь мы описываем уникальный метод videomicroscopy, который включает в себя анализ сосудорасширяющим и сосудосуживающие реакции нетронутыми малых человека артериол, удалены из жировых депо живых человеческих субъектов. Videomicroscopy используется для изучения функциональных свойств изолированных микрососудов в ответ на фармакологических или физиологические стимулы, используя давление системы, которая имитирует условия в естественных условиях . Методика является полезным подходом к пониманию патофизиологии и молекулярных механизмов, которые способствуют сосудистые дисфункции локально в среде жировой ткани. Кроме того ненормальности в жировой ткани microvasculature также были связаны с системными заболеваниями. Мы применили эту технику для изучения сосудистой ответы депо конкретных ожирением предметам. Мы оценивали эндотелий зависимой вазодилатация увеличение потока и ацетилхолина в жировой артериол (50-350 мкм внутренний диаметр, 2-3 мм в длину), изолированных от двух различных жировых депо во время бариатрической хирургии от того же лица. Мы продемонстрировали, что артериол от висцерального жира exhibit зрением эндотелий зависимой вазодилатации, по сравнению с судов, изолированный от подкожные депо. Результаты показывают, что висцеральных микроокружения ассоциируется с сосудистой эндотелиальной дисфункции, которые могут иметь отношение к клинические наблюдения, связывание увеличение висцеральных ожирение механизмы системного заболевания. Метод videomicroscopy может использоваться для изучения сосудистой фенотипов из различных жировых отложений, а также сравнивать результаты разных людей с разной степенью ожирения и метаболических дисфункции. Этот метод может также использоваться для изучения сосудистой ответы продольно в ответ на клинических вмешательств.
Introduction
Videomicroscopy является полезным методом, используется для изучения вазомоторной функции мелких артериол, удалены из живых человеческих субъектов ex vivo. Наша лаборатория была сосредоточена на разбор из крошечных микрососудов из различных жировой ткани отсеков для характеристики воздействия различных жировых микросреды на microvasculature. Основным преимуществом этого метода является что кровеносных сосудов, удаляется из организма человека оставаться функциональным и могут быть рассмотрены легко в течение нескольких минут до часов после биопсии. Физиологические условия являются передразнил и устойчивый Трансмуральное давление поддерживается в пространстве внутрипросветная через микро стекло канюли, которые пилки многие характеристики в естественных условиях . 1 , 2 Кроме того, надежный videomicroscopy установка с автоматизированной край обнаружения программного обеспечения позволяет для качественной и количественной оценки эндотелий зависимых и - независимый сосудорасширяющим и сосудосуживающие потенциала изолированных суда в режиме реального времени, позволяющей быстрого физиологических оценки в ответ на физическую и фармакологические стимулы. 3 другие микрососудистой техники также доступны такие как проволока миография, которая имеет тенденцию быть менее затратным по времени и измерить напряжение ответы на различные агонисты датчика силы.
Наша лаборатория применял videomicroscopy для изучения взаимосвязи между ожирением и сосудистые дисфункции, сосредоточив внимание на воздействие различных жировой ткани доменов на сосудистую. Центральное ожирение с накоплением внутрибрюшного висцерального жира наиболее тесно связан с adipocytokine производства, метаболической дисфункцией и кардиометаболического риска. Он постулат, что дисфункции жировой ткани с чрезмерное производство про атерогенные цитокинов и АдипоКин dysregulation сильно вовлечены в эти процессы, но конкретные регуляторных молекул и цели лечения остаются во многом Неоткрытая. 4 . Кроме того, на уровне местных жировой ткани, капиллярные разрежения и нарушением перфузии были связаны с pseudohypoxia жировой ткани и регуляции метаболизма. Развивается гипотеза, что сердечно-сосудистых заболеваний может быть следствием дисфункции жировой ткани. Про атерогенные посредников, освобождены от жира, особенно в связи с Центральной/висцеральных ожирение, скорее всего, поощрять эндотелиальной дисфункции и патогенных сосудистых изменений, которые могут быть проявляются локально в жировой сосудистую и обнаружен с помощью Здесь описаны методики. 5
Функциональной оценки артериол изолированных жировой ткани является полезным подходом к пониманию патофизиологии и молекулярные механизмы, способствующие сосудистые дисфункции человека ожирения. Для изучения механизмов, которые способствуют жировых депо конкретных дисфункции, мы разработали методы для изучения эндотелий зависимых и - независимый сосудорасширяющих ответы microvasculature и вычислить выражение различных нормативных кандидаты в паре висцеральных и подкожной (SC) жировой ткани образцов получены из тучных субъектов в то время бариатрической хирургии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
протокол и примеры, описанные здесь были утверждены, Бостонского университета школа из медицины институциональных Наблюдательный Совет (IRB, протокол #H-25644) и были проведены в соответствии с Хельсинкской декларации. Все предметы условии письменного согласия до участия.
1. микро стекло канюли и подготовка решения
- подготовить решение 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic кислой физраствора (HEPES). Для 1 Л, растворяют 8.059 г NaCl, 0,298 г KCl, 0,296 г MgSO 4 • 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0,16 г х 2 PO 4, деионизированная 0,01 г ЭДТА, 1.081 g D-глюкозы и 2.383 г HEPES кислоты в 950 мл воды. Составляют объем до 1 Л деионизированной водой. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4, использующая NaOH. HEPES буфер может храниться до 7 дней при 4 ° C.
- Подготовить 20 x соли буферных запасов. На 1 Л, добавить 143.8 г NaCl, 7,0 г KCl, 5.9 g MgSO 4 и 7,4 г CaCl 2 • 2 H 2 O 900 мл дистиллированной воды. Составляют объем до 1 Л деионизированной водой. Хранят раствор на 4 ° C.
- Подготовить 20 x буферных запасов. На 1 Л добавьте 26.8 g NaHCO 3 и 0,2 г EDTA·2H 2 O 900 мл деионизованной воды. Составляют объем до 1 Л деионизированной водой. Хранят раствор на 4 ° C.
- Подготовить КРЕБС решение для использования в ходе физиологических экспериментов. На 1 Л добавьте 900 мл деионизированной воды, 50 мл 20 x буферных запасов, 50 мл 20 x раствор соли буфера, 0.99 g D-глюкозы и 0,16 г х 2 PO 4. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4, с использованием HCl. Для поддержания pH буфера, постоянно перемешивать и замазывают парафином или пузырь непрерывно.
- Проверить рН каждые 20 минут сделать решение КРЕБС свежий ежедневно.
- Сделать микро стекло канюли с внутренним диаметром 40-240 мкм, использование коммерчески доступных иглы/пипеткой съемник. Размер стекла канюли определяется размер внутреннего диаметра изолированной кровеносных сосудов (50-350 мкм). Кроме того, покупка микро стекло канюли заранее определенного размера.
2. Подготовка реагентов
- подготовить ацетилхолина (Ach, 10 -2 M, Стоковый раствор). Растворите 18.29 г в 10 мл деионизированной водой. Хранить 1 мл аликвоты раствора (10 -2 M) акций-80 ° c. В день эксперимента серийно разбавленных для получения следующей рабочей концентрации: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 м.
- Подготовить папаверин (2 x 10 -2 M, Стоковый раствор). Растворяют 0.07517 г в 10 мл деионизированной водой. Подготовка 10 мкл аликвоты Стоковый раствор и магазина на -80 ° C. серийно разбавляют до получения 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 М в день эксперимента.
- Подготовить эндотелина-1 (ET-1, 2 x 10 -5 М, Стоковый раствор). Растворяют 50 мкг эндотелина-1 в 1 мл 1% BSA/PBS. Хранить 1 мл аликвоты Стоковый раствор (2 x 10 -5 М)-80 ° c. В день эксперимента разбавленных для получения рабочей концентрации 10 -10 M в день эксперимента.
- Хранения реагентов в любом-20 ° C или до-80 ° C, в зависимости от типа морозильной камеры доступны, но не дольше, чем 6 месяцев.
3. Жировая ткань сбор и подготовка судна
- набирать ожирением мужчины и женщины (индекс массы тела (ИМТ) ≥ 35 кг/м², возраст ≥ 18 лет) участвуют в программе бариатрической хирургии в Бостонский Медицинский центр (BMC). В общей сложности 40 предметов, участвовали в этих экспериментах.
- Собирать пробы подкожного и висцеральных жировой ткани во время запланированного бариатрической хирургии хирург, выполняющего операцию.
- Урожай подкожной жировой ткани из нижней брюшной стенки и висцерального жира из большого сальника, соответственно. Типичный жировой ткани размер выборки колеблется от 3-10 мг ткани.
- Место ткани сразу в холодную HEPES буферного раствора с pH 7,4 и хранить при 4 ° C до 24 ч.
Примечание: Кроме того, жировой артериол, могут быть получены из мяса людей, а также в ходе других видов хирургических операций, таких как грыжа ремонта или пластической хирургии, а также может быть биопсию подкожные депо через транс кожный брюшной жировой ткани биопсии < sup класс = «внешней» > 6.
- С помощью микроскопа рассечение тканей, микро ножницы и микро щипцы, тщательно удалить окружающих жира и соединительной ткани из небольшой жировой артериол (50-350 мкм внутрипросветная диаметр, 2-3 мм в длину).
- Галстук от всех ветвей на артериолы, используя крошечные нейлона или шелковыми швами до cannulating на стеклянные капиллярные пипетки. Тщательно анализировать артериол, поскольку даже незначительные повреждения противовоспали стены вызывает значительные функциональные изменения.
- Свернуть судна воздействие света и тепла, как это может вызвать вазодилатацию. Так как это может быть иногда трудно отличить от венулы артериол, определите размер и гладких мышц тонус сосудов, колючий советы судов. Артериолы обычно меньше и продемонстрировать большую тон, по сравнению с венулы.
- Подготовить орган палаты. Медленно стеклянные капиллярные пипетки и резиновой трубки заполняют раствором КРЕБС, используя шприц 10 мл.
- После того, как заполнены резиновой трубки и стеклянные капиллярные пипетки погружали в растворе КРЕБСА в зале орган, иглу артериол безопасно на обеспеченного пипетки и обе рулевые противовоспали с нейлон или шелка шовные knots тщательно.
- Заполнить вверх орган палаты растворе КРЕБСА до 2 мл.
- Обеспечить орган палаты на сцену с инвертированным микроскопом (увеличение 10 X / 0,25 Цель) и видео-камеры.
- Включите программное обеспечение обнаружения края, которое передается в режиме реального времени со скоростью дискретизации 1 кГц (1 кадр/сек).
- Подключите одну сторону под давлением трубопровода к решению КРЕБС, заполненные давлением резервуаров бесплатно микропузырьков, как пузыри могут ввести экспериментальной ошибки. Подключите другую сторону под давлением трубопровода к палате орган.
- Подключить КРЕБС решение заполнены давлением резервуаров к датчик давления с чистой труб.
- Управления интра просветный потока, регулируя высоту этих двух водоемов; таким образом, когда водохранилищ находятся на той же высоте, произойдет не intra просветный потока.
- После того, как все эти процессы являются полными, включите Отопление блока и программное обеспечение программы для поддержания температуры при 37 ° C. непрерывно perfuse сосуд раствором КРЕБС и аэрации с газовой смеси 5% CO 2, 21% O 2 и 74% N 2 8 7 , на протяжении всей экспериментальной процедуры.
- Для достижения требуемого давления ИНСИде просвета сосудов, изолированные постепенно увеличивать давление внутрипросветная (5 mmHg, каждые 5 мин) через блок управления давлением в панели myo интерфейса это медленными темпами, чтобы избежать повреждения эндотелия слой.
Примечание: После того, как давление достигает 60 мм рт.ст., период уравновешивания 20-30 мин требуется для стабилизации судна. Все функции сосудистого исследования выполняются на 60 мм рт.ст и 37 ° C при рН 7,4. 7
4. Оценка жировой микрососудистой функции
Примечание: В общем, жировой противовоспали эндотелия зависимых вазодилатация может вызвали в ответ на физиологические (поток индуцированной) и фармакологические раздражителей (Ach индуцированной).
- Потока опосредованной, зависящих от эндотелия сосудов после наддув, запишите диаметр жировой противовоспали в состоянии покоя (Di). Это называется покоя базовый диаметр.
- Предварительно сжимают кровеносные сосуды ~ 55% от покоя базового диаметра (Dp), добавив 1 мкл эндотелина-1 (ET-1, 10 − 10 М) непосредственно в ванной и подождать 5 мин для эффекта. Повторяйте этот процесс до достижения желаемого ~ 55% сократились государства.
- После предварительной сужения, побудить непрерывного потока в пространстве внутрипросветная жировой ткани артериол, в равных и противоположных направлениях, таким образом, чтобы перепад давления может быть разработан через судна не изменяя давление означает внутрипросветная из 60 мм рт.ст..
Примечание: например, если одного резервуара поднимается на 10 см в высоту, другой должен быть перемещен вниз на 10 см, чтобы изменять градиенты давления и таким образом изменить скорость потока внутрипросветная. При необходимости более точные измерения скорость потока, систему количественных расходомер может применяться к экспериментальной установки. - Измерения потока опосредованной дилатация 3-5 мин после начала потока индукции. Уровни внутрипросветная потока (градиенты давления) может быть в диапазоне от 0 - 100 КМЗ 2 O. увеличить каждый шаг градиента давления на Δ10 КМЗ 2 O каждые 5-6 мин, максимум 100 КМЗ 2 O.
Примечание: Для того, чтобы побудить стабильной ламинарного потока в просвете, обоих размеров кончика канюля микро стекла должны быть очень близко к внутренний диаметр артериол; в противном случае, он будет производить турбулентного потока внутри просвета и вызвать нежелательные измерения ошибки. - После потока-опосредованной оценки дилатация, возвращение давлением резервуаров на той же высоте (60 mmHg).
- Затем промывочный артериолы и камеры немедленно удалить решение из камеры и заменить свежим раствором КРЕБС. Это делается с осторожностью, чтобы не нарушить приостановлено противовоспали внутри камеры.
- Повторить этот процесс, 3 - 4 раза за 20-30 мин, или до тех пор, пока изолированных судно возвращается отдыха базовый диаметр.
- Ацетилхолину опосредованной, эндотелия зависимых, вазодилатацию
- когда жировой противовоспали вернулся в отдыхая базовый диаметр, предварительно сжимают судно ~ 55% управляющими эндотелина-1 (ET-1, 10 − 10 М) непосредственно в ванне, как описано выше в разделе 4.1.2.
- После предварительной сужения, последовательно управлять увеличение дозы (2 мкл) ацетилхолина, который является рецептор опосредованный, оксид азота агонистов (Ach, 10 -9-10 -5 М) непосредственно в ванне. Запись изменений артериол диаметром 5 мин после приема каждой дозы.
- После того, как судно прибыло плато, после окончательного дозы Ach, помыть сосуд 3 - 4 раза в растворе КРЕБСА. Разрешить 20-30 мин для судна, чтобы восстановиться и вернуться к отдыха базовый диаметр. Чтобы помочь сохранить pH в орган прогиба, изменить КРЕБС решение каждые 15 минут
- Инкубировать противовоспали с N w - нитро - l-аргинин метилового эфира (L-NAME, 10 -4 М), ингибитора синтазы оксида азота на 30 минут и затем повторить 4.2.1 и 4.2.2 характеризовать относительный вклад оксида азота в Ach опосредованной вазодилатации.
- Оценить эндотелий независимые вазодилатацию (функция сосудистой гладкой мускулатуры) и жизнеспособности судна администрацией последовательного увеличения доз папаверин (10 -8 до 10 -4 М) непосредственно в ванне. Если диаметр сосуда не вернуться к, или превышать покоя диаметр базовых (Di) в ответ на папаверин (то есть соответствующие вазодилатация), рассмотреть судна нежизнеспособных и отбросить точек данных.
5. Анализ данных и расчет
- Расчет сосудистой реактивности. Использовать процент вазодилатация для выражения данных для учета базовых различий в диаметре судна и рассчитать с помощью следующего уравнения:
вазодилатации % = (DT-Dp/ди-Dp) × 100
где DT-записанные диаметр в данный момент точке (максимум диаметр), Dp-диаметр регистрируется после добавления вазоконстрикция агента (т.е. ET-1 индуцированных диаметр сужения), и ди-диаметр, записанная непосредственно перед добавлением вазоконстрикция агента (покоя базовый диаметр). 9 - определить вазодилатацию и вазоконстрикция чувствительность (доза реакция) для агонистов как концентрация Ach, папаверин или ET-1, что вызывает 50% максимальной реакции (50 EC) которые могут быть определены сигмоид параметр и печати, как описано ранее. 10
Примечание: Интер наблюдателя воспроизводимости исследований вазодилатация жировой микрососудов имеет высокий коэффициент корреляции (CC) 0,99 (n = 10 судно эксперименты) в нашей лаборатории.
6. Статистический анализ
- Экспресс непрерывного измерения как означает ± SEM. Они, как правило, нормально распределены. Анализировать сосудистой реактивности в жировой артериол, неоднократные меры двустороннего ANOVA.
- В качестве альтернативы, Сравните площадь под кривой (AUC) участка для кумулятивного вазодилатация доза реакция между группами лечения. Во всех случаях, рассмотреть P < 0,05 статистически.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наша лаборатория использовала videomicroscopy для изучения эндотелий зависимых и - независимый вазодилатации, а также функции vasocontractile жировой ткани артериол изолированы от подкожного и висцерального жира тучных людей. Характеристика экспериментальной установки отображается на рисунке 1A. Жировой ткани артериол подвешенном состоянии между двумя стеклянные капиллярные пипетки и закрепленным в месте шва в пределах органа камеры, как показано на рисунке 1B. Как описано выше в разделе 5.1, артериол ответы затем может оцениваться путем изучения судна на базовых (рисунок 2A), следуют до сужения с ET-1 ~ 55% базового диаметра (рис. 2B), а затем агонист индуцированной вазодилатацию и расслабление сосудов просвета как отображаемый в рисунке 2 c.
Мы и другие отметили, что вазодилатация эндотелий зависимой ответы на увеличение потока (касательное напряжение)11 и12 Ach значительно затуплены в висцеральных по сравнению с подкожной жировой артериол (Рисунок 3А, 3Б ) человека ожирения. Однако эндотелий независимые вазодилатация в ответ на папаверин не было изменено дифференциально между двух складов (рис. 3 c). Вместе, эти результаты показывают, что сосудистые дисфункции в висцеральных доменов является во многом результатом дисфункции эндотелия, на уровне по крайней мере на ранних стадиях заболевания. Эта техника позволяет систематический анализ ответов сосудорасширяющим нетронутыми малых человека артериол и может также применяться в других доступных регионах человека сосудистую. Система ex vivo можно манипулировать, используя многочисленные фармакологические методы, такие как ответы на инсулин как индекс сосудистого эндотелия инсулин сопротивление6, или исследования "доза реакция" для нитроглицерина для тестирования сосудистой гладкой мышцы слой функция. 12 биологические методы, такие как глушителей РНК также может быть представлен13 потенциально развивать механистический рамок для понимания важнейших регуляторов, которые возлагают сосудистые дисфункции в условиях конкретного заболевания.
Рисунок 1: Установка Videomicroscopy. (A) изображение с изображением компоненты videomicroscopy орган палаты. (B) образ человека жировой противовоспали монтируется между двумя стекла капиллярные пипетки в зале орган. Диаметр сосуда изменения в ответ на физиологические и фармакологические раздражители, которые могут быть изучены и количественных используя специализированное программное обеспечение анализа и вложение Перевернутый камеры в системе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Иллюстрация микрососудистой вазодилатации, используя давление videomicroscopy. (A) упокоения базовых артериол диаметр (диаметр после наддув, не агонистов или стимуляции: ди) предварительно сужения диаметра (B) (после того, как ет-1 индуцированной свёрнутые диаметр: Dp), агонист индуцированной vasodilated (C) Диаметр (после того, как была добавлена Ach: DT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: эндотелий зависимой и - независимый вазодилатация в подкожной против висцеральных жировой артериол в тучных людей. Эндотелий зависимой вазодилатация был значительно ослаблены в висцеральных по сравнению с подкожной жировой клетчатки артериол при оценке (A) увеличение потока (паре подкожной и висцеральных сосудов, n = 20), или (B) ацетилхолин доза ответ с/без L-NAME (паре подкожной и висцеральных сосудов, n = 16). (C) эндотелий независимые вазодилатация не было изменено дифференциально между висцеральных и подкожной артериол, когда оцениваются папаверин доза ответ (паре подкожной и висцеральных сосудов, n = 8). * Обозначает группу различия между депо; †Denotes депо специфические различия между ацетилхолина с L-NAME, по сравнению с ацетилхолина в одиночку; NS: не значительные. Данные представлены в виде mean± SEM, p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рассечение и изоляции жировой артериол от окружающих тканей может быть длительным и трудоемким процессом с тщательным вниманием к деталям и технический протокол. Microdissection процедура требует тщательной навыки и специализированных рассечение посуды для предотвращения потенциального ущерба для гладких мышц или эндотелиальных клеток слои microvasculature. Даже крошечный случайных проколов в стенке артериол может предотвратить внутрипросветная подпора и результаты в неудачный эксперимент. Кроме того катетеризации артериол, используя швы имеет решающее значение для обеспечения артериол между стеклянные капиллярные пипетки советы на каждом конце судна.
Человека изолированных микрососудов может развиться после 30-40 мин наддув на 60 мм рт.ст спонтанное миогенных тон. Однако мы обнаружили, что человека жировой артериол обычно размером 50-350 мкм диаметром внутреннего Люминал относительно малы с разреженными слоями гладких мышц сосудов и не склонны развивать значительные миогенных тон, по сравнению с скелетной мускулатуры артериол. Мы таким образом побудить предварительно сужение этих мелких артериол, используя ET-1 перед воздействием вазодилататоров. Мы находим, что ET-1 оказывает более предсказуемого реагирования вазоконстриктора в то время как в некоторых случаях может быть изменчивости в ответах на альфа-рецепторов агонистов как фенилэфрин. Важно, чтобы выбрать соответствующие агонисты побудить желаемого ~ 55% до сужения; Однако важно также, чтобы выбрать правильное количество предварительно сжимает агента для предотвращения над дозировка и токсические повреждения судна. Мы достигаем этого, начиная с низкой дозы диапазоне и до титрования для эффекта, как описано в разделе 4.1.2.
Артериол в жировой ткани, чувствительны к изменениям рН и температуры; 14 таким образом, важно контролировать и управлять соответствующим pH (7,4) и температуры (37 ° C) во время процесса экспериментальной. В то время как videomicroscopy представляет собой систему жестко регулируемой температуры, необходимо контролировать pH раствора КРЕБС на протяжении эксперимента, чтобы избежать смещения, которые могут исказить результаты. Непрерывное восходящей КРЕБС решения и замену раствора каждые 15 мин в течение подпора и мытье шаги снизит рН вариации с течением времени.
В то время как videomicroscopy является полезным методом для изучения функциональных свойств микрососудов, техника имеет существенные кривой обучения и может быть трудоемким, особенно во время процесса сосудистой изоляции. В зависимости от типа ткани, биопсию наш опыт работы с жировой ткани микрососудов продемонстрировал, что катетеризации процедура может занять значительное количество времени и терпения. Кроме того есть присущие время чувствительность к эксперименты как судов за пределами тела, как правило, теряют их физиологических и функциональных свойств с течением времени. Таким образом эксперименты должны быть выполнены в окне жизнеспособных судов минут до часов после хирургической биопсии до возможного ткани распада.
Клиническое значение и смысл этой экспериментальной модели, используя videomicroscopy для изучения артериол поддерживается нашей способности непосредственно зонд патофизиологии в неповрежденной целых сегментов кровеносных сосудов человека удалены из живых субъектов, которые не может быть воспроизведена в неинвазивной визуализации. В самом деле, наша способность напрямую доступ и изучение неблагополучных человека кровеносных сосудов, например ожирением тела, может предоставить нам возможность разобраться в пути, которые изменяются дифференцировано в условиях заболевания и обнаружить роман терапевтических целей. Кроме того опубликованные данные из нашей лаборатории и другие показать что ex vivo оценки жировой артериол функции коррелирует с в vivo системные функции эндотелия ответы в других сосудистых кровати в лицо и ассоциированных с сердечно-сосудистых факторов риска, включая гипертонии, Курение, сахарный диабет и воспаления. 12 , 15 , 16 мы также опубликовали данные, демонстрируя существенная корреляция между иммуногистохимических выводы отношение к биологии оксида азота в висцеральных жировых клетках эндотелия и плечевая артериальная вазодилатация, поток опосредованной предлагая параллельные аномалии в жировой и системной тиражах. 17 Учитывая систематический характер эндотелиальной дисфункции, мы считаем, что этот метод представляет собой прагматичный подход к исследования сосудистых тканей не только человека, но также потенциально использовать этот метод в животных и клинические продольных исследований Изучите эффекты лечения. Например, миография, проволока, которая имеет тенденцию быть менее технически трудно выполнить и позволяет для мер Изометрические напряжения изолированных судов различных агонисты, используя преобразователь силы также доступны другие методы для изучения microvasculature. Хотя этот метод также предоставляет информацию о физиологических свойств микрососудов, настройки не используют интра просветный давление системы, которая может сделать его менее склонны пилки в vivo условий. Преимуществом videomicroscopy является способность вызывать относительно постоянной внутрипросветная давления, сведения к минимуму изменения сдвига в просвете. Этот метод может применяться для аналогичного размера микрососудов в организме человека и животных. 9 , 12 , 18 и наконец, следует отметить, что ряд коммерчески доступных videomicroscopy систем доступны для покупки и установки; Однако в целом физиологические концепции довольно одинаковы на всех платформах. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют раскрытия или коллизии интересов в отчет.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить добровольцев за их участие в этих исследованиях и хирургического персонала в Бостонский Медицинский центр для предоставления биопсий жировой ткани. Д-р ГОКе поддерживается национальных институтов здравоохранения (НИЗ) грантов, HL081587, HL114675 и HL126141. Д-р Farb поддерживается NIH Грант K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
