Summary
Videomicroscopy-systemer brukes til å undersøke funksjonelle egenskaper isolert fettvev arterioler svar på fysiologiske og farmakologiske stimuli. Denne teknikken kan brukes til å undersøke mikrovaskulær fenotyper i forskjellige fettvev domener i overvektige mennesker.
Abstract
Mens fedme er nært knyttet til utvikling av metabolske og hjerte sykdom, er lite kjent om mekanismer som styrer disse prosessene. Det er en teori om at pro-atherogenic meglere fra fettvev spesielt i samarbeid med sentral/visceral lokalisert fedme kan fremme patogene vaskulære endringene lokalt og systemisk, og forestillingen om at hjerte sykdom kan være den konsekvens av fettvev dysfunksjon fortsetter å utvikle seg. Her beskriver vi en unik metode for videomicroscopy som involverer analyse av vasodilator og vasoconstrictor svar av intakt små menneskelige arterioler fjernet fra adipose depot med levende menneskelige emner. Videomicroscopy brukes til å undersøke funksjonelle egenskaper isolert microvessels svar på farmakologiske eller fysiologiske stimuli bruke presset system som etterligner i vivo forhold. Teknikken er en nyttig tilnærming for å få forståelse av patofysiologi og molekylære mekanismer som bidrar til vaskulær dysfunksjon lokalt i fettvev miljøet. Videre har unormalt i fettvev microvasculature også blitt linket med systemiske sykdommer. Vi brukt denne teknikken for å undersøke depot-spesifikke vaskulære svar i overvektige fag. Vi vurdert endotelet avhengige av vasodilatasjon både økt flyt og acetylcholine i adipose arterioler (50-350 µm interne diameter, 2-3 mm i lengde) isolert fra to forskjellige adipose depoter under bariatric kirurgi fra samme individ. Vi viste at arterioler fra visceral fett ha svekket endotelet avhengige av vasodilatasjon sammenlignet fartøy isolert fra subkutan depot. Resultatene tyder på at den rå microenvironment er forbundet med vaskulær endotelial dysfunksjon som kan være relevante for klinisk observasjon koble økt visceral lokalisert fedme til systemisk sykdom mekanismer. Videomicroscopy teknikken kan brukes til å undersøke vaskulær fenotyper fra ulike fett depoter samt sammenligne resultatene på tvers av individer med ulike grader av fedme og metabolske dysfunksjon. Metoden kan også brukes til å undersøke vaskulær svar langs i respons til kliniske tiltak.
Introduction
Videomicroscopy er en nyttig teknikk benyttes for å undersøke vasomotor funksjonen til små arterioler fjernet fra levende mennesker ex vivo. Vårt laboratorium har fokusert på dissekere ut små microvessels fra forskjellige fettvev avdelinger å karakterisere effekten av ulike adipose microenvironments på microvasculature. En stor fordel med denne teknikken er at blodårer fjernet fra menneskekroppen fortsatt fungere og kan undersøkes lett gangavstand til timer etter biopsi. Fysiologiske forhold er etterlignet og jevn transmuralt trykket opprettholdes i feltet intraluminal via micro-glass cannulas som recapitulate mange i vivo egenskaper. 1 , 2 i tillegg gir et pålitelig videomicroscopy oppsett med automatisert kanten programvare for både kvalitativ og kvantitativ vurdering av endotelet avhengige av og -uavhengig vasodilator og vasoconstrictor kapasitet på isolerte fartøy i sanntid, tillater rask fysiologiske vurdering som svar på fysiske og farmakologiske stimuli. 3 andre mikrovaskulær teknikker er også tilgjengelig som wire myography som pleier å være mindre tidkrevende og måle spenning Svar å forskjellige agonister ved en force svinger.
Vårt laboratorium har brukt videomicroscopy for å undersøke forholdet mellom fedme og vaskulær dysfunksjon, fokuserer på effekten av ulike fettvev domener på er blodkar. Sentral lokalisert fedme med opphopning av intra-abdominal visceral fett har vært tettest knyttet til adipocytokine produksjon, metabolske dysfunksjon og cardiometabolic risiko. Det har blitt postulert at fettvev dysfunksjon med over produksjon av pro-atherogenic cytokiner og adipokine feilregulering er sterkt involvert i disse prosessene, men bestemt regulatoriske molekyler og behandling mål forblir i stor grad uoppdagede. 4 videre på lokale fettvev nivå, kapillære rarefaction og svekket perfusjon har vært knyttet til fettvev pseudohypoxia og metabolske feilregulering. Hypotesen at hjerte sykdom kan være konsekvensen av fettvev dysfunksjon utvikler seg. Pro-atherogenic meglere fra fett, spesielt i forbindelse med sentrale/visceral lokalisert fedme, trolig fremme endotelial dysfunksjon og patogene vaskulære endringene som kan manifestere lokalt i er adipose blodkar og oppdaget bruker den Her beskrives metodikk. 5
Funksjonell vurdering av isolerte fettvev arterioler er en nyttig tilnærming for å få forståelse av patofysiologi og molekylære mekanismer som bidrar til vaskulær dysfunksjon i menneskelig fedme. Undersøke mekanismer som bidrar til fett depot-spesifikke dysfunksjon, har vi utviklet metoder for å undersøke endotelet avhengige av og - uavhengige vasodilatory svar av microvasculature, og evaluere uttrykk for ulike regulatoriske kandidater i sammenkoblede visceral og underhud (SC) fettvev eksemplarer innhentet fra overvektige fag ved bariatric kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollen og eksempler beskrevet her ble godkjent av Boston universitet skolen av medisin institusjonelle Review Board (IRB, protokollen #H-25644) og ble gjennomført i henhold til erklæringen i Helsinki. Alle fag gitt skriftlig samtykke før deltakelse.
1. forberedelse av løsninger og mikro-glass Cannulas
- forberede de 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic sure (HEPES) saltløsning. For 1 L, oppløse 8.059 g NaCl, 0.298 g KCl, 0.296 g MgSO 4 • 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2t 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1.081 g D-glukose og 2.383 g HEPES syre i 950 mL vaskebuffer vann. Utgjør volumet til 1 L med deionisert vann. Justere pH 7,4 bruker NaOH. HEPES buffer kan lagres til 7 dager på 4 ° C.
- Forberede 20 x Salt reservelager. For 1 L, legge 143.8 g NaCl, 7.0 g KCl, 5.9 g MgSO 4 og 7,4 g CaCl 2 • 2t 2 O i 900 mL destillert vann. Utgjør volumet til 1 L med deionisert vann. Lagre lagerløsning på 4 ° C.
- Forberede 20 x reservelager. For 1 L, legge 26.8 g NaHCO 3 og 0.2 g EDTA·2H 2 O i 900 mL deionisert vann. Utgjør volumet til 1 L med deionisert vann. Lagre lagerløsning på 4 ° C.
- Forberede KREBS løsningen under fysiologiske eksperimenter. Legge til 900 mL deionisert vann, 50 mL av 20 x reservelager, 50 mL av 20 x Salt Buffer løsning, 0,99 g D-glukose og 0,16 g KH 2 PO 4 1 L. Justere pH 7,4 bruker HCl. For å opprettholde pH i bufferen, rør hele tiden og dekke med parafin eller boble kontinuerlig.
- Sjekk pH hver 20 min. gjøre KREBS løsningen frisk daglig.
- Gjøre mikro-glass cannulas med en indre diameter på 40-240 µm ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig p/pipette avtrekker. Størrelsen på glass cannulas bestemmes av størrelsen på den interne diameteren isolert blodkar (50-350 µm). Du kan også kjøpe micro-glass cannulas av forhåndsbestemte størrelse.
2. Forberedelse av reagenser
- forberede acetylkolin (Ach, 10 -2 M, lager løsning). Oppløse 18.29 g i 10 mL vaskebuffer vann. Lagre 1 mL dele lagerløsning (10 -2 M) på-80 ° C. På dagen for eksperimentet serielt fortynne å få de følgende jobbe-konsentrasjonene: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- Forberede papaverine (2 x 10 -2 M, lagerløsning). Oppløse 0.07517 g i 10 mL vaskebuffer vann. Forberede 10 µL dele lagerløsning og butikk på-80 ° C. serielt fortynne for å få 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M ved eksperimentet.
- Forberede endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, lagerløsning). Oppløse 50 µg endothelin-1 i 1 mL 1% BSA/PBS. Lagre 1 mL dele lagerløsning (2 x 10 -5 M) på-80 ° C. På dagen for eksperimentet fortynne å få en fungerende konsentrasjon av 10 -10 M dagen av eksperimentet.
- Lagre reagenser i enten 20 ° C eller opp til-80 ° C avhengig av typen fryser tilgjengelig, men ikke lenger enn 6 måneder.
3. Fettvev innsamling og fartøy forberedelse
- rekruttere overvektige menn og kvinner (kroppsmasseindeks (BMI) ≥ 35 kg/m², alder ≥ 18 år) i programmet bariatric kirurgi på Boston Medical Center (BMC). Totalt 40 fag deltok i disse eksperimentene.
- Oppsamling subkutan og visceral fettvev under planlagte bariatric kirurgi kirurgen utfører operasjonen.
- Harvest på subcutaneous liggende under adipose vev fra lavere bukveggen og visceral fett fra større omentum, henholdsvis. Typisk fettvev utvalgsstørrelsen varierer fra 3-10 mg av vev.
- Sted vev umiddelbart i kalde HEPES buffer løsning med en pH på 7,4 og butikk på 4 ° C i opptil 24 h.
Merk: I tillegg adipose arterioler kan fås fra magre personer samt under andre typer operasjoner som Brokk reparasjoner eller plastisk kirurgi, og kan også være biopsied fra subkutan depot via trans-cutaneous abdominal fett pad biopsi < sup class = "xref" > 6.
- Bruker en vev disseksjon mikroskop, mikro-saks og mikro-tang, forsiktig fjerne omkringliggende fett og bindevev fra de små adipose arterioler (50-350 µm intraluminal diameter, 2-3 mm i lengde).
- Slips av alle grener på arterioler med liten nylon eller silke suturer før cannulating på glass kapillær pipetter. Nøye analysere arterioler siden selv mindre skade på arteriole veggen forårsaker betydelig funksjonelle endringer.
- Minimer fartøyet eksponering for lys og varme som det kan forårsake vasodilatasjon. Siden det kan være noen ganger vanskelig å skille arterioler fra venules, identifisere størrelse og glatt muskel tone fartøy ved nipping tips av fartøyene. Arterioler er vanligvis mindre og vise større tone sammenlignet venules.
- Forberede orgel kammeret. Sakte fylle glass kapillær Pipetter og gummi tubing KREBS løsning bruker en 10 mL sprøyte.
- Når gummi tubing fylles og glass kapillær Pipetter senkes i KREBS løsning innenfor orgel kammeret, cannulate arterioler sikkert på de sikret Pipetter og knytte begge ender av arteriole med nylon eller silke Sutur knop nøye.
- Fylle opp til orgel kammeret KREBS løsning opptil 2 mL.
- Sikre orgel kammer på en med invertert mikroskopet (forstørrelse 10 X / 0,25 mål) og videokamera.
- Slå på kanten gjenkjenning programvare som er streamet i sanntid på en samplingsfrekvens på 1 kHz (1 rammen/s).
- Koble ene trykksatt slangen til KREBS løsningen fylt press reservoarer gratis microbubbles, bobler kan innføre eksperimentelle feil. Koble den andre siden av trykksatt rør til orgel chamber.
- Koble KREBS løsning fylt press reservoarene til trykktransduceren med ren rør.
- Kontrollere intra-luminal flyt ved å regulere høyden på disse to reservoarer; dermed når reservoarene er plassert i samme høyde, ingen intra-luminal flyt oppstår.
- Når alle prosessene er fullført, slår på oppvarming blokk og programvare program å opprettholde temperaturen på 37 ° C. kontinuerlig perfuse fartøyet med KREBS løsning og aerate med en gassblanding av 5% CO 2, 21% O 2 og 74% N 2 7 , 8 gjennom hele eksperimentelle prosedyren.
- å oppnå ønsket trykk inside lumen av isolerte fartøyene gradvis øke intraluminal trykket (5 mmHg, hver 5 min) via press kontrollenheten i panelet myo-grensesnitt gjør det med ett langsom rate å unngå endothelial lag skader.
Merk: Når trykket når 60 mmHg, en 20-30 min balanse periode er pålagt å stabilisere fartøyet. Alle vaskulære funksjon studier er utført på 60 mmHg og 37 ° C ved pH 7.4. 7
4. Vurdering av Adipose mikrovaskulær funksjon
Merk: generelt adipose arteriole endothelial-avhengige vasodilatasjon kan være elicited svar på fysiologiske (flyt-indusert) og farmakologiske stimuli (Ach-indusert).
- Flyt-mediert, endothelial-avhengige vasodilatasjon
- etter pressurization, registrere diameteren på den adipose arteriole på rest (Di). Dette kalles hvile opprinnelige diameter.
- Pre constrict blodkar ~ 55% av hvile opprinnelige diameter (Dp) ved å legge til 1 µL av endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkte til bad og vent 5 min effekt. Gjenta denne prosessen til å nå de ønskede ~ 55% pre innsnevret staten.
- Etter før innsnevring, indusere kontinuerlig strøm inn i intraluminal løpet av fettvev arterioler, lik og motsatt retning slik at en press forskjell kan utvikles over fartøyet uten å endre mener intraluminal trykket av 60 mmHg.
Merk: For eksempel hvis en reservoaret flytter 10 cm i høyden, den andre en må flyttes av 10 cm endre press graderinger og dermed endre intraluminal gjennomstrømning. Eventuelt mer nøyaktig flyten hastighet målinger er en kvantitativ gjennomstrømningsmåler system kan brukes på den eksperimentelle set-up. - Måle flyt-mediert dilatasjon 3-5 minutter etter oppstart av flyt induksjon. Nivåene av intraluminal (trykkgradienter) kan være fra 0 - 100 cmH 2 O. øker hver økning av trykkgradient av Δ10 cmH 2 O hver 5-6 min, maks 100 cmH 2 O.
Merk: For å indusere stabil laminær strømning i lumen, begge mikro glass kanyle tips størrelser må være svært nær diameter på arterioler; ellers vil produsere turbulente flyt i lumen og indusere feil av uønskede måling. - Etter den flow-mediert dilatasjon evalueringen tilbake press reservoarene til samme høyde (60 mmHg).
- Deretter vaske arteriole og kammer ved å umiddelbart fjerne løsningen fra kammeret og erstatte med fersk KREBS løsning. Dette gjøres med forsiktighet som ikke forstyrre den suspendert arteriole innenfor kammeret.
- Gjentagelse denne forarbeide 3 - 4 ganger i 20-30 minutter, eller til isolerte fartøyet tilbake til hvile opprinnelige diameter.
- Acetylcholine-mediert, endothelial-avhengige, vasodilatasjon
- når den adipose arteriole tilbake til hvile opprinnelige diameter, pre constrict fartøyet ~ 55% ved å tilsette endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkte til badet, som beskrevet over i del 4.1.2.
- Etter før innsnevring, sekvensielt administrere økende doser (2 µL) av acetylcholine som en reseptor-mediert, nitrogenoksid Agonistiske (Ach, 10 -9 til 10 -5 M) direkte til badet. Spille inn endringen i arterioler diameter 5 min etter administrasjon av hver dose.
- Når fartøyet har nådd et platå etter administrasjon av siste Ach dose, vask fartøyet 3 - 4 ganger med KREBS løsning. Tillate 20-30 min for fartøy å gjenopprette og hvile opprinnelige diameter. For å opprettholde pH i orgel camber, endre KREBS løsning hver 15 min.
- Ruge arteriole med N w - nitro - l-arginin metyl ester (L-navn, 10 -4 M), en inhibitor av nitrogenoksid syntase i 30 min, og deretter gjenta 4.2.1 og 4.2.2 å karakterisere relative bidrag nitrogenoksid til Ach-mediert vasodilatasjon.
- Vurdere endotelet-uavhengig vasodilatasjon (vaskulær glatt muskel funksjon) og fartøy levedyktighet av en sekvensiell administrasjon av økende doser av papaverine (10 -8 til 10 -4 M) direkte til badet. Hvis fartøyet diameter ikke tilbake til, eller overskrider hvile planlagte (Di) diameter som svar på papaverine (dvs. riktig vasodilatasjon), vurdere fartøyet ikke-levedyktige og forkaste datapunkt.
5. Dataanalysering og beregning
- Beregn det vaskulære reaktivitet. Bruke prosent vasodilatasjon data uttrykk hensyn til planlagte forskjeller i fartøy diameter og beregne hjelp av følgende ligning:
% vasodilatasjon = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
der DT er registrert diameteren på et gitt tidspunkt (maksimum diameter), Dp er diameteren registreres etter tillegg av vasokonstriksjon agent (dvs. ET-1 indusert innsnevring diameter), og Di er diameteren registreres umiddelbart før en vasokonstriksjon agent (hvile opprinnelige diameter). 9 - definere vasodilatasjon og vasokonstriksjon følsomhet (dose-respons) til en Agonistiske som konsentrasjonen av Ach, papaverine eller ET-1 som utløser 50% av maksimal svaret (EF 50) som kan defineres av en sigmoidal parameter og plottet, som beskrevet tidligere. 10
Merk: Inter observatør reproduserbarhet studier av vasodilatasjon av adipose microvessels har en høy korrelasjonskoeffisient (CC) av 0,99 (n = 10 fartøy eksperimenter) i vårt laboratorium.
6. statistikkanalyse
- Express kontinuerlig målinger som betyr ± SEM. Dette pleier å være normalfordelt. Analysere vaskulær reaktivitet i adipose arterioler ved gjentatt-tiltak toveis VARIANSANALYSE.
- Sammenligne eventuelt området under kurven (AUC) av tomten for kumulative vasodilatasjon dose-svar mellom behandlingsgrupper. I alle tilfeller vurdere P < 0,05 statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vårt laboratorium har brukt videomicroscopy for å undersøke endotelet avhengige av og - uavhengig vasodilatasjon, samt vasocontractile funksjon av fettvev arterioler isolert fra subkutan og visceral fett av overvektige mennesker. Den karakteristiske eksperimentelle set-up vises i figur 1A. Fettvev arterioler er mellom to glass kapillær Pipetter og sikret ved suturer innenfor orgel kammeret som vist i figur 1B. Som beskrevet ovenfor under 5.1, kan arterioler svar deretter bli vurdert ved å undersøke fartøyet ved baseline (figur 2A), etterfulgt av før innsnevring med ET-1 ~ 55% av opprinnelige diameter (figur 2B), og deretter agonist-indusert vasodilatasjon og avslapning av det vaskulære lumen som vist i figur 2C.
Vi og andre har observert at endotelet avhengige av vasodilatasjon Svar å økt flyt (skjæring stress)11 og Ach12 var betydelig avstumpet i visceral sammenlignet subkutan adipose arterioler (figur 3A, 3B ) i menneskelig fedme. Imidlertid var endotelet-uavhengig vasodilatasjon svar på papaverine ikke ulikt endret mellom de to depoter (Figur 3 c). Sammen disse funnene tyder det vaskulære dysfunksjon i visceral domener er et resultat av dysfunksjon på nivå med endotelet, minst i tidlige stadier av sykdommen. Denne teknikken gir systematisk analyse av vasodilator svar av intakt små menneskelige arterioler og kan også brukes til andre tilgjengelige regioner av den menneskelige blodkar. Ex vivo systemet kan manipuleres med mange farmakologiske metoder som svar på insulin som en indeks for vaskulær endotelial insulin resistens6eller dose-svar studier nitroglyserin teste vaskulær glatt muskel Lag-funksjonen. 12 metoder som stanse RNA kan også være introdusert13 å utvikle potensielt mekanistisk rammeverk for å forstå kritiske regulatorer som overdrar vaskulær dysfunksjon under spesifikke sykdomstilstander.
Figur 1: Videomicroscopy oppsett. (A) bilde som viser komponentene i videomicroscopy orgel kammeret. (B) bilde av en menneskelige adipose arteriole montert mellom to glass kapillær Pipetter i orgel kammeret. Fartøyet diameter endringer i svaret til fysiologiske og farmakologiske stimuli som kan undersøkes og kvantifisert bruker spesialiserte analyseprogramvare og invertert kameraet vedlegg i systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: illustrasjon av mikrovaskulær vasodilatasjon bruker press videomicroscopy. (A) hvile planlagte arterioler diameter (etter pressurization diameter, ingen Agonistiske eller stimulering: Di) (B) pre trange diameter (etter ET-1 indusert trange diameter: Dp), (C) Agonist-indusert vasodilated diameter (etter Ach ble lagt til: DT). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: endotelet avhengige av og -uavhengig vasodilatasjon i subcutaneous vs visceral adipose arterioler i overvektige mennesker. Endotelet avhengige av vasodilatasjon var betydelig dempes i visceral sammenlignet subkutan fettvev arterioler når vurdert av (A) økt flyt (sammenkoblet subkutan og visceral fartøyer, n = 20), eller (B) acetylcholin dose svar med/uten L-navn (sammenkoblet subkutan og visceral fartøyer, n = 16). (C) endotelet-uavhengig vasodilatasjon var ikke ulikt endret mellom visceral og underhud arterioler når vurdert av papaverine dose svar (sammenkoblet subkutan og visceral fartøyer, n = 8). * Angir gruppe forskjeller mellom depoter; †Denotes depot-spesifikke forskjeller mellom acetylkolin med L-NAME sammenlignet acetylkolin alene; NS: ubetydelig. Dataene presenteres som mean± SEM, p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disseksjon og isolering av adipose arterioler fra omkringliggende vev kan være en tidkrevende og arbeidskrevende prosess med forsiktig oppmerksomhet på detaljer og teknisk protokoll. Microdissection prosedyren krever nitid ferdigheter og spesialiserte disseksjon kjøkkenutstyr å forhindre skader til glatt muskel eller endothelial celle lag av microvasculature. Selv små utilsiktet punkteringer i arterioler veggen kan hindre intraluminal pressurization og resultater i et mislykket forsøk. Dessuten er cannulation av arterioler utnytte suturer avgjørende for å sikre arterioler mellom glass kapillær pipette tips i hver ende av fartøyet.
Menneskelige isolert microvessels kan utvikle spontan myogenic tone etter 30-40 minutter av pressurization på 60 mmHg. Vi fant imidlertid at menneskelige adipose arterioler generelt størrelse 50-350 µm av interne luminal diameter er relativt små med sparsom lag av vaskulær glatt muskel, og pleier ikke å utvikle betydelig myogenic tone sammenlignet med skjelettmuskulatur arterioler. Vi induserer dermed før innsnevring av disse små arterioler bruker ET-1 før eksponering for vasodilatorer. Vi finner at ET-1 utøver en mer forutsigbar vasoconstrictor respons selv i noen tilfeller kan det være variasjon i svar på alpha reseptor agonister som phenylephrine. Det er viktig å velge de aktuelle agonister å indusere en ønsket ~ 55% før innsnevring; men det er også viktig å velge riktig mengde pre constricting agent å forhindre dosering og giftige skade på fartøyet. Vi oppnå dette ved å starte med den lavere spekter dosen og opp-titrating til effekten som beskrevet i del 4.1.2.
Arterioler i fettvev er følsomme for endringer i pH og temperatur; 14 derfor er det avgjørende å overvåke og kontrollere riktig pH (7.4) og temperatur (37 ° C) under eksperimentelle prosessen. Mens videomicroscopy er et strengt regulert temperatur kontrollert system, er det viktig å overvåke pH i KREBS løsningen gjennom å unngå Skift som kan forskyve resultatene. Kontinuerlig boblende KREBS løsning og utskifting av løsning hvert 15 min under pressurization og vaske trinn reduserer pH variasjoner over tid.
Videomicroscopy er en nyttig teknikk å undersøke funksjonelle egenskaper microvessels, teknikken har en betydelig læringskurve og kan være arbeidsintensiv spesielt under av vaskulær isolasjon. Avhengig av vev som er biopsied, har vår erfaring med fettvev microvessels vist at cannulation prosedyren kan ta mye tid og tålmodighet. Det er iboende tid sensitivitet til eksperimenter som skip utenfor kroppen tendens til å miste sine fysiologiske og funksjonelle egenskaper over tid. Dermed må eksperimenter utføres i vinduet levedyktig av fartøyene i minutter timer etter kirurgisk biopsi før eventuell vev forfall.
Klinisk betydning og begrunnelsen for denne eksperimentell modell utnytte videomicroscopy for studerer arterioler støttes av vår evne til å direkte undersøke patofysiologi i intakt hele segmenter av menneskelig blod fartøy fjernet fra levende fag, som kan ikke replikere av ikke-invasiv tenkelig. Faktisk, vår evne til å direkte tilgang og undersøke dysfunksjonelle menneskelig blod fartøy i, for eksempel en overvektige kroppen, kan gi oss muligheter til å få innsikt i veier som er ulikt endret under sykdom forhold og oppdage roman terapeutiske mål. Videre publiserte data fra vårt laboratorium og andre viser at ex vivo vurdering av adipose arterioler funksjonen korrelerer med in vivo systemisk endothelial funksjon svar i andre vaskulær senger innen et individ, og knytte med kardiovaskulære risikofaktorer inkludert hypertensjon, røyking, diabetes og betennelse. 12 , 15 , 16 vi har også publisert data viser en signifikant sammenheng mellom immunohistochemical funn relevant for nitrogenoksid biologi i visceral adipose endotelceller og brachialis arteriell flyt-mediert vasodilatasjon tyder parallell unormalt i liggende under adipose og systemisk rundskriv. 17 gitt den systemiske naturen endotelial dysfunksjon, tror vi at denne teknikken representerer en pragmatisk tilnærming å studere ikke bare menneskelig vaskulær vev, men også potensielt bruke denne metoden i dyr og klinisk longitudinelle studier til undersøke behandling effekter. Andre teknikker for å undersøke microvasculature er også tilgjengelig som wire myography, som pleier å være mindre teknisk vanskelig å utføre og gir tiltak isometrisk spenning av isolerte fartøy til ulike agonister bruker en force svinger. Mens denne metoden gir også informasjon om fysiologiske egenskapene til microvessels, utnytter ikke satt opp et intra-luminal presset system som kan gjøre det mindre tilbøyelige til å recapitulate i vivo forhold. En fordel med videomicroscopy er evnen til å indusere en relativt konstant intraluminal trykk minimere endringer i skjær i lumen. Metoden kan brukes lignende størrelse microvessels i både mennesker og dyr. 9 , 12 , 18 endelig det bør bemerkes at en rekke kommersielt tilgjengelige videomicroscopy systemer er tilgjengelig for kjøp og oppsett; men generelt fysiologiske konsepter er ganske jevnt over alle plattformer. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer eller interessekonflikter rapporten.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke frivillige for deres deltakelse i disse studiene og kirurgisk personalet ved Boston Medical Center for å gi fettvev biopsier. Dr. Gokce støttes av National Institutes of Health (NIH) tilskudd HL081587, HL114675 og HL126141. Dr. Farb støttes av NIH gi K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
