Summary
Videomicroscopy מערכות משמשות כדי לבחון מאפיינים פונקציונליים של רקמת שומן מבודדת רבים בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ולא תרופתי. טכניקה זו ניתן לבחון פנוטיפים microvascular בתחומים שונים רקמת שומן בבני מהשמנת יתר.
Abstract
בעוד השמנה קשורה קשר הדוק להתפתחות מחלה מטבולית, לב וכלי דם, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המפקחים על תהליכים אלו. זה המשוערות כי מתווכים פרו-atherogenic שוחרר רקמות שומן במיוחד בשיתוף עם השמנה מרכזית/ויסצרלית עשוי לקדם שינויים בכלי הדם פתוגניים באופן מקומי, מערכתית, הרעיון כי מחלות לב וכלי דם עשוי להיות תוצאה של חוסר תפקוד רקמת שומן ממשיכה להתפתח. כאן, אנו מתארים שיטה ייחודית של videomicroscopy זה כרוך ניתוח של תגובות מרחיב כלי דם ומצר את כלי הדם של שלם רבים אנושי קטן יוסר בתחנה אדיפוז מהנושאים אנושי חי. Videomicroscopy משמש כדי לבחון מאפיינים פונקציונליים של microvessels מבודדים בתגובה לגירויים פיזיולוגיים או תרופתי באמצעות מערכת לחוץ המחקה תנאים ויוו . הטכניקה היא גישה שימושית כדי להשיג הבנה של פתופסיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים שתורמים בתפקוד כלי הדם באופן מקומי בתוך חצרו רקמת שומן. יתר על כן, חריגות בתוך microvasculature רקמת שומן גם קושרו עם מחלות מערכתיות. אנחנו מוחלים בטכניקה זו כדי לבחון תגובות וסקולרית דיפו ספציפיים בנושאים מהשמנת יתר. אנחנו העריכו אנדותל תלוית vasodilation הזרימה המוגברת והן אצל רבים אדיפוז (50-350 קוטר פנימי מיקרומטר, 2-3 מ מ אורך) מבודד שני מחסני אדיפוז שונים במהלך ניתוח בריאטרי מ באותו הפרט. להדגים כי רבים מן השומן מהבטן התערוכה vasodilation אנדותל תלוית לקוי לעומת כלי מבודד בתחנה תת עורית. הממצאים מראים כי הקרביים microenvironment קשורה בתפקוד אנדותל כלי הדם אשר עשוי להיות רלוונטי תצפיות קליניות קישור מהבטן השמנה מוגברת למנגנונים מחלה מערכתית. הטכניקה videomicroscopy יכול לשמש כדי לבחון פנוטיפים כלי דם מן המחסנים שומן שונים, כמו גם משווים ממצאים בין אנשים עם דרגות שונות של השמנת יתר, חוסר תפקוד מטבולי. השיטה יכולה לשמש גם כדי לבחון תגובות כלי הדם longitudinally בתגובה התערבויות קליניות.
Introduction
Videomicroscopy היא טכניקה שימושית מנוצל כדי לבחון את תפקוד עושות קטנים רבים מן החי ניסויים ex-vivo. המעבדה שלנו התמקדה לנתח את microvessels הקטן של תאי רקמת שומן שונים כדי לאפיין את ההשפעות של אדיפוז שונים microenvironments על microvasculature. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי כלי הדם של הגוף האנושי להישאר פונקציונלי יכולים להיבדק בקלות בתוך דקות עד שעות בעקבות ביופסיה. מצבים פיזיולוגיים הן חיקה ויציבה transmural הלחץ נשמר בשטח intraluminal באמצעות קנולות מיקרו-זכוכית אשר מסכם את הדברים מאפיינים רבים ויוו . 1 , 2 . בנוסף, מלכודת videomicroscopy אמין עם תוכנת זיהוי קצה אוטומטית מאפשרת עבור הערכה כמותית והן איכותית של אנדותל תלוית ועצמאית - מרחיב כלי דם, מצר את כלי הדם קיבולת של בודדים כלי ב בזמן אמת, המתיר הערכת פיזיולוגיים מהירה בתגובה לגירויים פיזיים ולא תרופתי. 3 טכניקות אחרות microvascular הינם גם זמינים כגון חוט myography, אשר נוטה להיות פחות זמן רב ולמדוד את המתח התגובות אגוניסטים שונים על ידי כוח מתמר.
המעבדה שלנו הוחל videomicroscopy שבחן את הקשר בין תפקוד כלי הדם, התמקדות השפעת תחומים שונים רקמת שומן על להערכת השמנה. השמנה מרכזית עם הצטברות שומן מהבטן התוך בבטן נקשרה הקרוב ביותר adipocytokine ייצור, חילוף חומרים לקוי של הסיכון cardiometabolic. זה הניחו כי תפקוד רקמת שומן עם ייצור יתר של pro-atherogenic dysregulation ציטוקינים ו adipokine הם בחריפות מעורבים תהליכים אלה, אך מולקולות ספציפיות רגולטוריות ומטרות הטיפול נותרו במידה רבה לא ידועות. 4 . זאת ועוד, רקמת שומן מקומית ברמה rarefaction נימי, זלוף לקוי קושרו רקמת שומן pseudohypoxia ו- dysregulation מטבולית. ההשערה כי מחלות לב וכלי דם עשוי להיות התוצאה של בעיות בתפקוד רקמת שומן הוא מתפתח. מתווכים פרו-atherogenic שוחרר שומן, במיוחד בשיתוף עם מרכז/מהבטן השמנה, סביר לקדם בתפקוד אנדותל, שינויים בכלי הדם פתוגניים שניתן להתבטא באופן מקומי להערכת אדיפוז וזוהה באמצעות במסמך זה תיאר מתודולוגיה. 5
הערכה תפקודית של רקמת שומן מבודדת רבים היא גישה שימושית כדי להשיג הבנה של פתופסיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים שתורמים בתפקוד כלי הדם האנושי ההשמנה. לחקור מנגנונים שתורמים תפקוד ספציפי דיפו השמן, פיתחנו שיטות לבחון אנדותל תלוית ותגובות - עצמאית vasodilatory של microvasculature, ולהעריך את הביטוי רגולטוריות שונות מועמדים לזווג הקרביים ו התת-עורית (SC) רקמת שומן דגימות המתקבל הנושאים כרסתן בזמנו של ניתוח בריאטרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול ואת דוגמאות המתוארים כאן אושרו על ידי בוסטון אוניברסיטת הנהלת בית הספר של רפואה מוסדיים סקירה (IRB, פרוטוקול #H-25644), נערכו בהתאם הצהרת הלסינקי. כל הנושאים הניתנים בכתב הסכמה מדעת לפני השתתפות.
1. ההכנה של פתרונות, מיקרו-זכוכית קנולות
- הכן הפתרון מלוחים חומצי 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). עבור 1 ליטר, להמיס 8.059 g NaCl, 0.298 גרם אשלגן כלורי, 0.296 g MgSO 4 • 7 שעות 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O. 0.16 g ח' 2 PO 4, 0.01 גרם EDTA, 1.081 g D-גלוקוז ו- 2.383 g HEPES חומצה ב- 950 מ"ל של יונים . מים. לבצע את עוצמת הקול 1 ליטר מים יונים. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות NaOH. HEPES מאגר ניתן לאחסן 7 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס
- להכין את 20 x מלאי מאגר מלח. עבור 1 ליטר, להוסיף 143.8 g NaCl, g 7.0 אשלגן כלורי, 5.9 גרם MgSO 4 ו- g 7.4 CaCl 2 • 2 H 2 O לתוך 900 מ ל מים מזוקקים. לבצע הווליום 1 ליטר מים יונים. לאחסן פתרון מניות ב- 4 מעלות צלזיוס
- להכין את 20 x מלאי מאגר. 1 ליטר, הוסיפו 26.8 g NaHCO 3 ו- 0.2 גר' EDTA·2H 2 O לתוך 900 מ ל מים יונים. לבצע הווליום 1 ליטר מים יונים. לאחסן פתרון מניות ב- 4 מעלות צלזיוס
- להכין את הפתרון קרבס לשמש במהלך הניסויים פיזיולוגיים. 1 ליטר, להוסיף 900 מ ל מים יונים, 50 מ של 20 x מלאי מאגר, 50 מ של 20 x בופר מלח, 0.99 g D-גלוקוז ו- 0.16 g ח' 2 PO 4. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות HCl. כדי לשמור על רמת החומציות של המאגר, מערבבים כל הזמן, לכסות עם פרפין או בועה ברציפות.
- סימון ה-pH בכל 20 דקות להפוך את הפתרון קרבס טריים מדי יום.
- להפוך קנולות מיקרו-זכוכית עם קוטר פנימי של 40-240 מיקרומטר באמצעות של פולר המחט זמינים מסחרית/פיפטה. הגודל של זכוכית קנולות נקבע לפי גודל הקוטר הפנימי של כלי הדם מבודדים (50-350 מיקרומטר). לחלופין, לרכוש מיקרו-זכוכית קנולות של גודל שנקבע מראש.
2. הכנה של ריאגנטים
- הכן האצטילכולין (אחח, 10 -2 מ', פתרון מניות). להמיס 18.29 g ביונים 10 מ"ל מים. חנות aliquots 1 מ"ל של מניות פתרון (10 -2 מ') ב- 80 ° c ביום של הניסוי באופן סדרתי לדלל להשיג ריכוז העבודה הבאות: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 מ'
- להכין את papaverine (2 x 10 -2 מ', פתרון מניות). להמיס 0.07517 g ביונים 10 מ"ל מים. הכינו 10 aliquots µL של פתרון מניות וחנות ב-80 ° ג באופן סדרתי לדלל כדי לקבל 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 מ' ביום של הניסוי-
- להכין את endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 מ', פתרון מניות). להמיס 50 µg endothelin 1-1 מ של 1% BSA/PBS. לאחסן 1 מ"ל aliquots של פתרון מניות (2 x 10 -5 מ') ב- 80 ° c ביום של הניסוי לדלל בריכוז העבודה 10 -10 מ' ביום של ניסוי.
- לאחסן ריאגנטים גם-20 ° C או עד-80 מעלות בהתאם לסוג מקפיא זמין, אך לא יותר מ 6 חודשים.
3. רקמת שומן איסוף והכנת כלי
- לגייס גברים שמנים ונשים (מדד מסת הגוף (BMI) ≥ 35 kg/m ², גיל ≥ 18 שנה) שהשתתפו בתוכנית ניתוח בריאטרי ב בוסטון רפואי מרכז (BMC). סך של נושאים 40 השתתפו בניסויים אלה.
- לאסוף דגימות רקמת שומן תת עורית של הקרביים במהלך ניתוחים בריאטרי המתוכנן על ידי המנתח מבצע את.
- הקציר תת עורית רקמות adipose מ לקיר הבטן התחתונה, מהבטן שומן שנשאב omentum greater, בהתאמה. גודל המדגם טיפוסי רקמת שומן משתנה בין 3-10 מ ג של רקמת.
- המקום רקמות באופן מיידי תוך קר HEPES מאגר פתרון עם pH של 7.4 וחנות ב 4 ° C עבור עד 24 ח'
הערה: בנוסף, אדיפוז רבים ניתן לקבל מאנשים רזה כמו גם במהלך סוגים אחרים של ניתוחים כגון בקע תיקונים או ניתוח פלסטי, וניתן גם ביופסיה מן בתחנה תת עורית באמצעות ביופסיה טרנס-עורית כרית שומן בטן < מה המצב class = "xref" > 6.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה רקמות, ומספריים מיקרו מיקרו-מלקחיים, הסר בזהירות שמסביב שומן ורקמות רבים אדיפוז קטן (50-350 מיקרומטר intraluminal קוטר, 2-3 מ מ אורך).
- לקשור את כל הענפים על רבים באמצעות ניילון קטנה או התפרים משי לפני cannulating על מכשור ניסוי ברטט נימי זכוכית. בזהירות לנתח רבים מאז נזק אפילו מזערי של הקיר arteriole גורם משמעותי לשינויים פונקציונליים.
- מזער חשיפה כלי אור וחום כפי שהוא עלול לגרום vasodilation. מכיוון שזה יכול להיות לפעמים קשה להבחין רבים מן venules, לזהות את הטון הגודל של שריר חלק של כלי על ידי קטיעת את הטיפים של כלי. רבים הם בדרך כלל קטנים יותר ומדגימים צליל גדול יותר בהשוואה venules.
- להכין את החדר אורגן. לאט לאט למלא פיפטות נימי זכוכית של צינורות גומי עם הפתרון קרבס באמצעות מזרק 10 מ ל-
- פעם אבובים מגומי מלא פיפטות נימי זכוכית טובע בפתרון קרבס בתוך תא איברים, נקרר רבים וישבו לבטח על פיפטות מאובטחת ו לקשור בשני קצוות arteriole עם ניילון או משי תפר קשרים בזהירות.
- למלא תא איברים עם פתרון קרבס עד 2 מ"ל.
- לאבטח לחדר עוגב על הבמה עם המיקרוסקופ הפוכה (הגדלה 10 X / 0.25 המטרה), מצלמת וידאו-
- להפעיל בתוכנת איתור קצה המוזרם ב בזמן אמת בקצב דגימה של 1 קילו-הרץ (מסגרות לשנייה 1).
- לחבר צד אחד של הצנרת מווסת הפתרון קרבס לחץ מילוי מאגרי חינם של microbubbles, כמו בועות ניתן להציג שגיאה ניסיוני. להתחבר לצד השני של צינורות בלחץ תא איברים.
- להתחבר קרבס פתרון מלא לחץ המאגרים מתמר לחץ עם אבובים נקי.
- לשלוט זרימה אינטרה-luminal על ידי ויסות הגובה של אלה שני מאגרים; לכן, כאשר מאגרי ממוקמים באותו גובה, אין זרימת אינטרה-luminal תתרחש.
- לאחר כל התהליכים האלה, הושלמו, להפעיל חימום לחסום תוכנית תוכנה כדי לשמור על טמפרטורה 37 ° ג ברציפות perfuse את הכלי עם פתרון קרבס, לאוורר עם תערובת גז של 5% CO 2, 21% O 2 ו- 74% N 2 7 , 8 לאורך כל תהליך ניסיוני.
- כדי להשיג את הלחץ הרצוי בתוך מעבד הדה לומן של כלי מבודד להגדיל בהדרגה את הלחץ intraluminal (5 מ מ כספית, כל 5 דקות) באמצעות יחידת בקרת לחץ בחלונית ' myo ממשק, כך בקצב איטי כדי למנוע נזק שכבת אנדותל.
הערה: לאחר הלחץ מגיע ל- 60 מ מ כספית, תקופה equilibration 20-30 דקות נדרשת כדי לייצב את הספינה. כל תפקוד כלי הדם מחקרים מבוצעים ב 60 מ מ כספית ל 37 ° C ב- pH 7.4. 7
4. הערכה של אדיפוז פונקציה Microvascular
הערה: באופן כללי, יכול להיות elicited arteriole אדיפוז תלויי-אנדותל vasodilation בתגובה פיזיולוגית (זרימה-induced), גירויים תרופתי (Ach-induced).
- Vasodilation בתיווך זרימה, תלויי-אנדותל
- בעקבות לחץ, להקליט את הקוטר של arteriole אדיפוז במנוחה (Di). זה נקרא קוטר הבסיס מנוחתו.
- מראש מתכווצים כלי הדם ~ 55% מקוטר בסיס המנוחה (Dp) על-ידי הוספת 1 µL של endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 מ') ישירות אל אמבט ואל חכה 5 דקות לקבלת אפקט. חזור על תהליך זה עד להגיע % ~ 55 להזמנה מראש מכווץ המדינה.
- בעקבות ההתכווצות קדם, זירוז זרימה רציפה לתוך מרחב intraluminal של רקמת שומן רבים, שוויון, בכיוונים מנוגדים כך הבדל לחץ יכול להתפתח ברחבי הספינה מבלי לשנות את הלחץ intraluminal רשע של 60 מ מ כספית.
הערה: לדוגמה, אם מאגר אחד עולה על ידי 10 ס מ גובה, השני צריך להיות ירדו על ידי 10 ס מ לשנות מעברי צבע בלחץ, ובכך לשנות את קצב הזרימה intraluminal. אם מדידת קצב זרימה מדויקים יותר הם הרצויה, מערכת זרימה כמותית-מד ניתן ליישם את הסידור ניסיוני. - למדוד התארכות בתיווך זרימה 3-5 דקות לאחר אתחול של אינדוקציה זרימה. רמות intraluminal זרימה (לחץ מעברי צבע) יכולים להיות בטווח של 0 - 100 cmH 2 O. להגדיל כל תוספת לחץ שיפוע על-ידי Δ10 cmH 2 O כל 5-6 דקות, עד למקסימום של 100 cmH 2 O.
הערה: על מנת לזרז את הלידה זרימה שכבתית יציב ב לומן, בשני גדלים עצה בצינורית זכוכית מיקרו צריכה להיות מאוד קרובה הקוטר הפנימי של רבים; אחרת, היא לייצר תזרים מערבולות בתוך לומן, זירוז שגיאות מדידה לא רצויים. - בעקבות זרימה-מתווכת המבדק התארכות, להחזיר את הלחץ מאגרים לאותו גובה (60 מ מ כספית).
- לאחר מכן, לשטוף arteriole קאמרית מאת מיד הסרת פתרון קאמרית ולהחליף עם פתרון קרבס טריים. פעולה זו מתבצעת בזהירות כדי לא לשבש את arteriole על תנאי בתוך התא.
- חזור על תהליך זה 3 - 4 פעמים במשך 20-30 דקות, או עד הספינה מבודדת מחזירה עד לקוטר בסיסית מנוחתו.
- Vasodilation בתיווך אצטילכולין, תלוית אנדותל,
- כאשר arteriole אדיפוז חזר עד לקוטר בסיסית מנוחתו, מראש מתכווצים כלי ~ 55% על-ידי ניהול endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 מ') ישירות אל האמבטיה, כפי שתואר לעיל בסעיף 4.1.2.
- בעקבות ההתכווצות קדם, לנהל ברצף הגדלת מינון (2 µL) של אצטילכולין שהוא קולטן בתיווך, תחמוצת החנקן אגוניסט (אחח, 10 -9 עד 10 -5 מ') ישירות אל בית המרחץ. להקליט את השינוי arteriolar קוטר 5 דקות לאחר מתן של מנה לכל.
- פעם כלי הקיבול הגיעה מישור בעקבות ניהול של המנה הסופית Ach, לשטוף את כלי הקיבול 3 - 4 פעמים עם פתרון קרבס. לאפשר 20-30 דקות על הכלי להתאושש ולחזור נח בסיסית בקוטר. כדי לסייע לשמור על pH של קאמבר איברים, לשנות קרבס פתרון כל 15 דקות
- דגירה של arteriole עם N w - ניטרו - l-ארגינין מתיל אסטר (L-שם, 10 -4 מ'), מעכב של תחמוצת החנקן סינתאז למשך 30 דקות, ואז אני חוזר 4.2.1 ו 4.2.2 לאפיין את התרומה היחסית של תחמוצת החנקן כדי vasodilation בתיווך אוה.
- להעריך vasodilation אנדותל-עצמאית (הפונקציה השריר החלק בכלי הדם) ואת הכדאיות כלי מאת המינהל רציפים של מינונים הגוברת של papaverine (10 -8 עד 10 -4 מ') ישירות אל בית המרחץ. אם קוטר הכלי לא לחזור, או יעלה על הקוטר בסיסית (Di) מנוחתו בתגובה papaverine (דהיינו vasodilation המתאים), שקול את כלי הקיבול כלכלית ולמחוק נקודות נתונים.
5. ניתוח נתונים וחישוב
- חשב תגובתיות כלי הדם. השתמש vasodilation אחוז לביטוי נתונים כדי להסביר הבדלים בסיסית בקוטר כלי ולחשב באמצעות המשוואה הבאה:
% vasodilation = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
איפה DT הקוטר מוקלטות בנקודת זמן נתון (מקסימום קוטר), Dp הוא בקוטר שנרשם לאחר התוספת של סוכן vasoconstriction (כלומר. ET-1 המושרה קוטר הכיווץ), והוא די הקוטר נרשם מיד לפני התוספת של סוכן vasoconstriction (קוטר הבסיס בזמן מנוחה). 9 - מגדירים רגישות vasodilation ו- vasoconstriction (מנה-תגובה) כדי אגוניסט הריכוז של Ach, papaverine או ET-1 ולחושים 50% של התגובה מקסימלי (EC 50) אשר יכולה להיות מוגדרת על-ידי הפרמטר sigmoidal, המותווים, כפי שתואר לעיל. 10
הערה: לימודי בין הצופה הפארמצבטית vasodilation של אדיפוז microvessels יש מקדם המתאם (CC) גבוהה של 0.99 (n = 10 ניסויים כלי) במעבדה שלנו.
6. ניתוח סטטיסטי
- אקספרס רציפה מדידות אומר ± ב- SEM... אלה נוטים בדרך כלל להיות מופץ. לנתח את כלי הדם תגובתיות של אדיפוז רבים על ידי אמצעים חזר ANOVA דו-כיווני.
- . לחלופין, להשוות בין השטח מתחת לעקומה (AUC) של העלילה עבור vasodilation המצטבר מינון-תגובות בין קבוצות הטיפול. בכל המקרים, שקול P < 0.05 סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המעבדה שלנו השתמשה videomicroscopy כדי לבחון אנדותל תלוית ו- vasodilation עצמאיים, וכן תפקוד vasocontractile של רקמת שומן רבים מבודד שומן תת עורית ואת הקרביים של בני אדם שמנים. הסידור ניסיוני האופיינית מוצג איור 1A. רקמת שומן רבים מושעה בין שני פיפטות נימי זכוכית, מאובטחת במקום עם תפרים בתוך החדר אורגן כפי שמוצג באיור 1B. כפי שתואר לעיל בסעיף 5.1, arteriolar תגובות אז יכול להידרש על ידי בחינת הכלי בנקודת ההתחלה (איור 2 א), ואחריו לתעוקה מראש עם ET-1 ~ 55% מקוטר בסיסית (איור 2B) ולאחר מכן אגוניסט-induced vasodilation ורגיעה של לומן כלי הדם כפי שמוצג ב- 2C איור.
אנחנו ואחרים הבחינו כי התגובות אנדותל תלוית vasodilation הזרימה המוגברת (גזירה)11 ו- Ach12 היו באופן משמעותי קהה בתוך הקרביים לעומת רבים אדיפוז תת עורית (איור 3 א, 3B ) ההשמנה אנושי. עם זאת, ללא תלות אנדותל vasodilation בתגובה papaverine לא באופן שונה שונה בין מחסני שני (איור 3C). יחד, ממצאים אלה מראים את תפקוד כלי הדם בתחומים מהבטן הוא במידה רבה תוצאה של תפקוד ברמה של אנדותל, לפחות בשלבים מוקדמים של המחלה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח שיטתי של תגובות מרחיב כלי דם רבים אנושי קטן שלם, ניתן להחיל גם לאזורים אחרים נגיש להערכת אנושי. המערכת ex-vivo ניתן לטפל באמצעות שיטות תרופתי רבים כמו התגובות אינסולין כמו אינדקס של עמידות לאינסולין אנדותל כלי הדם6, או מינון-תגובות מחקרים כדי ניטרוגליצרין כדי לבדוק את השריר החלק בכלי הדם פונקציית שכבה. 12 שיטות ביולוגיות כמו להשתיק RNA ניתן גם הציג13 פוטנציאל לפיתוח מסגרות מכניסטית להבנת הרגולטורים קריטי המקנים בתפקוד כלי דם בתנאים מחלה ספציפית.
איור 1: הגדרת Videomicroscopy. (א) תמונה המתארת את מרכיבי התא איבר videomicroscopy. (B) דימוי האדם arteriole אדיפוז רכוב בין שני פיפטות נימי זכוכית בבית הבליעה איברים. קוטר הכלי משתנה בתגובה לגירויים פיזיולוגיים, תרופתי, כך שניתן יהיה לבחון, באמצעות כימות והתמחה ניתוח תוכנה, קובץ מצורף המצלמה הפוך במערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איור של microvascular vasodilation באמצעות הלחץ videomicroscopy. (א) בזמן מנוחה בסיסית arteriolar קוטר (לחץ פוסט-קוטר, אין אגוניסט או גירוי: Di) קוטר מראש מכווץ (B) (לאחר ET-1 המושרה קוטר מכווץ: Dp), vasodilated הנוצרות על-ידי אגוניסט (C) קוטר (לאחר Ach נוספה: DT). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: vasodilation תלויי-אנדותל, ועל - העצמאית ב לעומת הקרביים אדיפוז רבים בבני אדם שמנים תת-עורי. תלויי-אנדותל vasodilation היה משמעותי הקלוש בתוך הקרביים לעומת רקמת השומן התת עורית רבים כאשר לאומדן (A) גדל זרימה (לזווג תת עורית הקרביים וספינות, n = 20), או (B) אצטילכולין מינון תגובה עם/בלי L-שם (לזווג תת עורית הקרביים וספינות, n = 16). (ג) אנדותל ללא תלות vasodilation לא השתנה באופן שונה בין הקרביים ו התת-עורית רבים כאשר מוערך על ידי תגובת המינון papaverine (לזווג תת עורית הקרביים וספינות, n = 8). * מציין קבוצה ההבדלים בין מחסני; †Denotes דיפו ספציפיים ההבדלים בין אצטילכולין בשם L-לעומת אצטילכולין לבד; NS: לא משמעותי. הנתונים מוצגים כמו mean± SEM, p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקרע ובידוד של אדיפוז רבים מן הרקמות הסובבות יכול להיות תהליך מהגידולים ועתירת זהיר תשומת לב לכל פרט טכני פרוטוקול. ההליך microdissection דורש מוקפד מיומנויות וכלי ניתוח מיוחדים כדי למנוע נזק אפשרי של שריר חלק או אנדותל תא שכבות microvasculature. דקירות מקרית קטנה בקיר arteriolar יכול למנוע intraluminal לחץ ותוצאות ניסוי לא מוצלח. בנוסף, תעלות של רבים ניצול התפרים חיוני להבטיח רבים בין קצות פיפטה נימי זכוכית בכל קצה של כלי השיט.
Microvessels מבודד האנושי יכול לפתח הטון myogenic ספונטנית לאחר 30-40 דקות של לחץ על 60 מ מ כספית. עם זאת, מצאנו כי רבים אדיפוז האנושית בדרך כלל בגודל 50-350 מיקרומטר של קוטר פנימי luminal קטנות יחסית עם שכבות דלילה של השריר החלק בכלי הדם, ואת לא נוטים לפתח הטון myogenic משמעותית לעומת רבים שרירי השלד. אנחנו ובכך לגרום קדם ההתכווצות של אלה רבים קטנים באמצעות ET-1 לפני החשיפה vasodilators. אנו מוצאים כי ET-1 מפעילה תגובה מצר את כלי הדם יותר צפוי בעוד במקרים מסוימים ייתכן השתנות התגובות אגוניסטים לקולטן אלפא כגון phenylephrine. זה חיוני כדי לבחור את אגוניסטים המתאימה לזירוז כיווץ ~ 55% מראש הרצוי; עם זאת חשוב גם כדי לבחור את הסכום הנכון של סוכן מגבילות מראש כדי למנוע מעל המינון ונזק רעיל לכלי השיט. נוכל להשיג זאת על ידי מתחיל עם מינון נמוך יותר טווח ו- up-titrating אפקט כמתואר בסעיף 4.1.2.
רבים בתוך רקמת שומן רגישים לשינויים ב- pH וטמפרטורה; 14 . לכן, זה הכרחי לפקח ולשלוט pH המתאים (7.4) וטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) במהלך תהליך ניסיוני. בעוד videomicroscopy היא מערכת מבוקרת טמפרטורה בחוזקה מוסדר, זה הכרחי כדי לנטר את ה-pH של התמיסה קרבס לאורך כל הניסוי כדי למנוע שינויים במאזן עשוי להטות את תוצאות. בעבוע רציף של פתרון קרבס, החלפה של פתרון כל 15 דקות במהלך לחץ ושטיפת צעדים יהיה להפחית וריאציות pH לאורך זמן.
בעוד videomicroscopy היא טכניקה שימושית כדי לבחון את המאפיינים הפונקציונליים של microvessels, הטכניקה יש עקומת למידה משמעותית, וייתכן שהוא עמל רב במיוחד במהלך התהליך של בידוד כלי הדם. בהתאם לסוג של רקמה זו ביופסיה, הניסיון שלנו עם רקמת שומן microvessels הוכיחה כי ההליך תעלות עלול לקחת כמות משמעותית של זמן וסבלנות. בנוסף, יש זמן הגלום רגישות הניסויים ככלים מחוץ לגוף נוטות לאבד את תכונותיהם הפיזיולוגיות ופונקציונליים לאורך זמן. לפיכך, הניסויים צריך להתבצע בתוך חלון קיימא של כלי של דקות עד שעות לאחר ביופסיה כירורגית לפני ריקבון רקמת בסופו של דבר.
הרלוונטיות הקלינית ורציונל של מודל ניסיוני זה ניצול videomicroscopy עבור לומדים רבים נתמך על-ידי היכולת שלנו ישירות בדיקה פתופסיולוגיה בקטעים כל שלם של כלי דם אנושי יוסר חיים הנושאים, אשר לא ניתן לשכפל על ידי הדמיה לא פולשנית. למעשה, היכולת שלנו לגשת ישירות ולבחון לקוי האנושית במערכת הדם, לדוגמה גוף שמנים, יכול לספק לנו הזדמנויות כדי לזכות בתובנה מסלולים זה באופן שונה שונו תנאי המחלה ולגלות את הרומן מטרות טיפוליות. יתר על כן, נתונים שפורסמו המעבדה שלנו ועוד להראות את ההערכה הזאת ex-vivo של פונקציה arteriolar אדיפוז בקורלציה עם in vivo פונקציה אנדותל מערכתית תגובות במיטות כלי דם אחרים בתוך הפרט, ולשייך עם גורמי סיכון קרדיווסקולריים כולל יתר לחץ דם, עישון, סוכרת, דלקת. 12 , 15 , 16 גם פרסמנו נתונים הוכחת מתאם משמעותי בין immunohistochemical הממצאים הרלוונטיים תחמוצת החנקן לביולוגיה בתאי האנדותל אדיפוז הקרביים איחתי vasodilation בתיווך זרימה עורקית רומז ליקויים מקבילים שומן ו circulations מערכתית. 17 , בהתחשב באופי בתפקוד אנדותל מערכתית, אנו מאמינים כי טכניקה זו מייצג גישה פרגמטית כדי ללמוד לא רק עילאיים. מרקמות אך גם פוטנציאל לנצל שיטה זו של בעלי החיים, מחקרים קליניים אורכי כדי בחן את השפעות הטיפול. טכניקות אחרות כדי לבחון את microvasculature הינם גם זמינים כגון חוט myography, אשר נוטה להיות פחות מבחינה טכנית קשה לבצע ומאפשר אמצעים איזומטרי מתיחות של ספינות בודדות כדי אגוניסטים שונים באמצעות מתמר כוח. אמנם שיטה זו מספקת גם מידע לגבי התכונות הפיזיולוגיות של microvessels, הסידור לא לנצל את מערכת לחוץ אינטרה-luminal שיכולים להפוך אותה פחות נוטה לסכם התנאים ויוו . היתרון videomicroscopy הוא היכולת לגרום לחץ intraluminal קבועים יחסית מזעור השינויים הטיה של לומן. השיטה ניתן ליישם microvessels בגודל דומה לבני אדם והן חיות. 9 , 12 , 18 . סוף סוף, יצויין כי מספר מערכות videomicroscopy זמינים מסחרית זמינים עבור רכישה והתקנה; עם זאת המושגים פיזיולוגיים באופן כללי הם אחידה למדי בכל הפלטפורמות. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לעורכים יש אין גילויים או ניגודי עניינים לדווח.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות המתנדבים בשל השתתפותם מחקרים אלה ואת הצוות הכירורגי במרכז הרפואי בבוסטון למתן ביופסיות רקמת שומן. ד ר Gokce נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים HL081587, HL114675 ו- HL126141. ד ר Farb נתמך על-ידי NIH להעניק K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
