Summary
Videomicroscopy systemer bruges til at undersøge funktionelle egenskaber af isolerede fedtvæv arterioler i respons til fysiologiske og farmakologiske stimuli. Denne teknik kan bruges til at undersøge mikrovaskulære fænotyper i forskellige fedtvæv domæner hos overvægtige mennesker.
Abstract
Mens fedme er tæt forbundet med udviklingen af metaboliske og hjerte-kar-sygdom, er lidt kendt om mekanismer, der styrer disse processer. Det er en hypotese, pro-atherogene mæglere frigivet fra fedtvæv især i forening med central/visceral overvægt kan fremme patogene vaskulære ændringer lokalt og systemisk, og forestillingen om at hjerte-kar-sygdom kan være den konsekvens af fedtvæv dysfunktion fortsætter med at udvikle. Her, beskriver vi en unik metode til videomicroscopy, der involverer analyse af vasodilator og vasokonstriktor svar af intakt små menneskers arterioler fjernet fra den adipøst depot af levende forsøgspersoner. Videomicroscopy bruges til at undersøge funktionelle egenskaber af isolerede microvessels svar på farmakologiske eller fysiologiske stimuli ved hjælp af et presset system, der efterligner i vivo betingelser. Teknikken er en nyttig tilgang til forståelse af Patofysiologi og molekylære mekanismer, der bidrager til vaskulær dysfunktion lokalt i fedtvæv milieu. Derudover har abnormiteter i fedtvæv microvasculature også været forbundet med systemiske sygdomme. Vi har anvendt denne teknik til at undersøge depot-bestemt vaskulære svar hos overvægtige forsøgspersoner. Vi vurderede endotel-afhængig vasodilatation til både øget flow og acetylcholin i adipøst arterioler (50-350 µm indre diameter, længde 2-3 mm) isolerede fra to forskellige fedt depoter under fedmekirurgi fra samme individ. Vi viste, at arterioler fra visceralt fedt udviser nedsat endotel-afhængig vasodilatation i forhold til fartøjer, der er isoleret fra det subkutane depot. Resultaterne tyder på, at den viscerale mikromiljø er forbundet med vaskulære endotel dysfunktion, som kan være relevante for klinisk observation forbinder øget visceral overvægt til systemisk sygdomsmekanismer. Videomicroscopy teknik kan bruges til at undersøge vaskulære fænotyper fra forskellige fedt depoter samt sammenligne resultater på tværs af individer med forskellige grader af fedme og metabolisk dysfunktion. Metoden kan også bruges til at undersøge vaskulære svar på langs i svar til kliniske interventioner.
Introduction
Videomicroscopy er en nyttig teknik udnyttet til at undersøge den vasomotoriske funktion af små arterioler fjernet fra levende forsøgspersoner ex vivo. Vores laboratorium har fokuseret på dissekere ud lille microvessels fra forskellige fedtvæv rum til at karakterisere forskellige fedt microenvironments indvirkning på microvasculature. En stor fordel ved denne teknik er, at blodkarrene, der fjernes fra det menneskelige legeme forblive funktionelle og kan blive undersøgt umiddelbart inden for minutter til timer efter biopsi. Fysiologiske tilstande er efterlignede og støt transmural pres opretholdes i intraluminal plads via mikro-glas cannulas som sammenfatte mange i vivo karakteristika. 1 , 2 derudover en pålidelig videomicroscopy set-up med automatiseret edge detection software giver mulighed for både kvalitativ og kvantitativ vurdering af endotel-afhængig og -uafhængig karudvidende og vasokonstriktor kapacitet af isolerede fartøjer i realtid, tillader det hurtige fysiologiske vurdering som reaktion på fysiske og farmakologiske stimuli. 3 andre mikrovaskulære teknikker er også tilgængelige som wire blodkar, som har tendens til at være mindre tidskrævende og måle spænding svar til forskellige agonister med en krafttransducer.
Vores laboratorium har anvendt videomicroscopy for at undersøge forholdet mellem fedme og vaskulær dysfunktion, fokuserer på virkningerne af forskellige fedtvæv domæner på Vaskulaturen. Centrale overvægt med ophobning af intra-abdominalt visceralt fedt har været mest tæt knyttet til adipocytokine produktion, metabolisk dysfunktion og cardiometaboliske risiko. Det har været postuleret at fedtvæv dysfunktion med overproduktion af pro-atherogene cytokiner og adipokine dysregulering er stærkt involveret i disse processer, men konkrete lovgivningsmæssige molekyler og behandling mål forbliver stort set uopdagede. 4 Derudover lokale fedtvæv, kapillær rarefaction og nedsat perfusion har været knyttet til fedtvæv pseudohypoxia og metaboliske dysregulering. Den hypotese, at hjerte-kar-sygdom kan være en følge af fedtvæv dysfunktion er under udvikling. Pro-atherogene mæglere frigivet fra fedt, især i forbindelse med central/visceral overvægt, sandsynligvis fremme endotel dysfunktion og patogene vaskulære ændringer, der kan manifestere lokalt i adipøst Vaskulaturen og påvises ved hjælp af den heri beskrevne metode. 5
Den funktionelle vurdering af isolerede fedtvæv arterioler er en nyttig tilgang til forståelse af Patofysiologi og molekylære mekanismer, der bidrager til vaskulær dysfunktion i menneskers fedme. For at undersøge mekanismer, der bidrager til fedt depot-specifikke dysfunktion, vi har udviklet metoder til at undersøge endotel-afhængig og - uafhængig vasodepressivt svar af microvasculature, og evaluere udtryk for forskellige lovgivningsmæssige kandidater i parrede visceral og subkutane (SC) fedtvæv prøver fremstillet af fede fag på tidspunktet for fedmekirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokol og eksempler beskrevet her blev godkendt af Boston University skole af medicin institutionelle Review Board (IRB, protokol #H-25644) og blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Alle fag givet skriftlig informeret samtykke før deltagelse.
1. forberedelse af løsninger og mikro-glas Cannulas
- Forbered 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic sure saltvand (HEPES) løsning. For 1 L, opløses 8.059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0.296 g MgSO 4 • 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1.081 g D-Glucose og 2.383 g HEPES syre i 950 mL deioniseret vand. Fyldes op til 1 L med deioniseret vand. Justere pH til 7.4 ved hjælp af NaOH. HEPES buffer kan lagres til 7 dage ved 4 ° C.
- Forberede 20 x Salt stødpudelager. For 1 L, tilføje 143.8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 og 7,4 g CaCl 2 • 2 H 2 O til 900 mL destilleret vand. Fyldes op volumen på 1 L med deioniseret vand. Opbevar stamopløsning ved 4 ° C.
- Forberede 20 x stødpudelager. 1 L, tilføje 26,8 g NaHCO 3 og 0,2 g EDTA·2H 2 O til 900 mL deioniseret vand. Fyldes op volumen på 1 L med deioniseret vand. Opbevar stamopløsning ved 4 ° C.
- Forberede KREBS opløsning skal anvendes ved de fysiologiske forsøg. 1 L, tilføje 900 mL deioniseret vand, 50 mL af 20 x stødpudelager, 50 mL af 20 x Salt stødpudeopløsning, 0,99 g D-Glucose og 0,16 g KH 2 PO 4. Justere pH til 7.4 bruger HCl. For at opretholde pH af bufferen, rør hele tiden og dække med paraffin eller boble kontinuerligt.
- Check pH hvert 20 min. gøre KREBS løsning frisk dagligt.
- Gøre mikro-glas cannulas med en indre diameter på 40-240 µm ved hjælp af en kommercielt tilgængelig nål/pipette puller. Størrelsen af glas cannulas bestemmes af størrelsen af den indvendige diameter af isolerede blodkar (50-350 µm). Alternativt købe mikro-glas cannulas forudbestemt størrelse.
2. Forberedelse af reagenser
- Forbered acetylkolin (Ach, 10 -2 M, stamopløsning). Opløse 18.29 g i 10 mL deioniseret vand. Gemme 1 mL alikvoter af stamopløsningen (10 -2 M) ved-80 ° C. På dagen af forsøget seriefremstillede fortyndet at opnå følgende arbejder koncentrationer: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- Forberede papaverin (2 x 10 -2 M, stamopløsning). Opløses 0.07517 g i 10 mL deioniseret vand. Forberede 10 µL delprøver af stamopløsning og opbevares ved-80 ° C. seriefremstillede fortyndes for at få 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M på dagen af forsøget.
- Forberede endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, stamopløsning). Opløses 50 µg endothelin-1 i 1 mL 1% BSA/PBS. Gemme 1 mL alikvoter af stamopløsningen (2 x 10 -5 M) ved-80 ° C. På dagen af forsøget fortyndet til en fungerende koncentration af 10 -10 M på dagen af forsøget.
- Opbevar reagenser i enten-20 ° C eller op til-80 ° C afhængigt af typen af fryser tilgængelige, men ikke mere end 6 måneder.
3. Fedtvæv samling og fartøj forberedelse
- rekrut overvægtige mænd og kvinder (body mass index (BMI) ≥ 35 kg/m², alder ≥ 18 år) indskrevet i programmet Fedmekirurgi på Boston Medical Center (BMC). 40 emner i alt deltog i disse eksperimenter.
- Indsamle subkutane og visceralt fedtvæv prøver under planlagte bariatriske operationer af den kirurg, der udfører handlingen.
- Høst det subkutane fedtvæv fra den nederste bugvæggen og visceralt fedt fra den større omentum, henholdsvis. Typiske fedtvæv prøvestørrelse varierer fra 3-10 mg væv.
- Sted væv straks i koldt HEPES buffer løsning med en pH-værdi på 7,4 og opbevares ved 4 ° C i op til 24 h.
Bemærk: Derudover adipøst arterioler kan fås fra lean enkeltpersoner samt under andre typer af operationer såsom brok reparationer eller plastikkirurgi, og kan også være biopsi fra den subkutane depot via trans-kutan abdominal fedt pad biopsi < sup Class = "xref" > 6.
- Ved hjælp af en væv dissektion mikroskop, mikro-saks og mikro-pincet, forsigtigt fjerne omkringliggende fedt og bindevæv fra de lille adipøst arterioler (50-350 µm intraluminal diameter, 2-3 mm i længden).
- Tie off alle grene på arterioler ved hjælp af bittesmå nylon eller silke suturer før cannulating på glas kapillær pipetter. Omhyggeligt dissekere arterioler, da selv små skader arteriole muren medfører betydelige funktionelle ændringer.
- Minimer fartøj udsættelse for lys og varme som det kan forårsage vasodilatation. Da det kan nogle gange være vanskeligt at skelne arterioler fra venules, identificere den størrelse og glat muskel tone af fartøjer af nipping tips af fartøjer. Arterioler er normalt mindre og vise større tone i forhold til venules.
- Forberede orgel kammer. Langsomt fylde glas kapillær pipetter og gummi slanger med KREBS løsning ved hjælp af en 10 mL sprøjte.
- Når gummi slange er fyldt, og glas kapillær pipetter er neddykket i KREBS løsning inden for orgel kammer kanyleres arterioler sikkert på de sikrede pipetter og binde begge ender af arteriole med nylon eller silke sutur knob omhyggeligt.
- Fylde orgel kammer med KREBS løsning op til 2 mL.
- Sikre orgel salen på en scene med den omvendte mikroskop (forstørrelse 10 X / 0,25 mål) og videokamera.
- Tænder på edge detection software, der er streamet i realtid på en samplingsfrekvens på 1 kHz (1 frame/s).
- Tilsluttes én side af trykisoleret slangen KREBS løsning fyldt pres reservoirer gratis mikrobobler, som bobler kan indføre eksperimentel fejl. Tilslut anden siden af tryk slange til orgel afdeling.
- Tilsluttes tryktransduceren med ren slanger KREBS løsning fyldt pres reservoirer.
- Styre intra-luminale flow ved at regulere højden af disse to reservoirer, derfor, hvornår reservoirer placeres i samme højde, opstår der ingen intra-luminale flow.
- Når alle disse processer er komplet, Tænd varme blok og software program til at holde temperatur på 37 ° C. kontinuerligt perfuse fartøj med KREBS løsning og lufte med en gasblandingen i 5% CO 2, 21% O 2 og 74% N 2 7 , 8 hele hele forsøgsmetoden.
- At opnå ønskede tryk inside lumen af de isolerede fartøjer gradvist øge intraluminal pres (5 mmHg, hvert 5 min) via pres styreenheden i panelet myo-interface gør det med en langsom hastighed til at undgå skader på endotel lag.
Bemærk: Når trykket når 60 mmHg, en 20-30 min ækvilibrering periode er forpligtet til at stabilisere fartøjet. Alle kar funktion undersøgelser udføres på 60 mmHg og 37 ° C ved pH 7,4. 7
4. Vurdering af fedt mikrovaskulære funktion
NOTE: I almindelighed, fedt arteriole endotel afhængig vasodilatation kan være fremkaldt i respons til fysiologiske (flow-induceret) og farmakologiske stimuli (Ach-induceret).
- Flow-medieret, endotel afhængig vasodilatation
- efter opretholdelse, tryk i hovedbrandledningssystemet optage diameteren af den adipøst arteriole i hvile (Di). Dette kaldes den hvilende baseline diameter.
- Pre snøre blodkar til ~ 55% af de hvilende baseline diameter (Dp) ved at tilføje 1 µL af endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkte til bad og vent 5 min for effekt. Gentag denne proces, indtil at nå den ønskede ~ 55% pre trange tilstand.
- Efter pre konstriktion, fremkalde kontinuerlig flow ind i intraluminal rummet af fedtvæv arterioler, i lige og modsatte retninger så at en trykforskellen kan udvikles på tværs af fartøjet uden at ændre den gennemsnitlige intraluminal pres af 60 mmHg.
Bemærk: For eksempel, hvis et reservoir bevæger sig af 10 cm i højden, anden en skal flyttes med 10 cm til at ændre presset gradienter og dermed ændre intraluminal strømningshastighed. Evt nøjagtigere flow hastighed målinger, en kvantitativ flowmeter system kan anvendes til den eksperimentelle set-up. - Måling af flow-medieret dilatation 3-5 min efter indledningen af flow induktion. Niveauer af intraluminal flow (presset gradienter) kan være i intervallet fra 0 - 100 cmH 2 O. øge hver tilvækst af trykgradient ved Δ10 cmH 2 O hver 5-6 min, dog højst 100 cmH 2 O.
Bemærk: For at fremkalde stabil laminar flow i lumen, begge mikro glas kanyle tip størrelser nødt til at være meget tæt på indre diameter af arterioler; ellers det vil producere turbulent strømning inde i lumen og fremkalde uønskede målefejl. - Efter flow-medieret dilatation vurdering, returnere pres reservoirer til samme højde (60 mmHg).
- Derefter vaske arteriole og kammer ved straks at fjerne løsningen fra salen og erstatte med friske KREBS løsning. Dette gøres med forsigtighed, ikke forstyrre den suspenderede arteriole i prøvelokalet.
- Gentag denne proces, 3 - 4 gange i 20-30 min, eller indtil isolerede fartøjet vender tilbage til den hvilende baseline diameter.
- Acetylcholin-medieret, endotel-afhængig, vasodilation
- når den adipøst arteriole er vendt tilbage til den hvilende baseline diameter, pre snøre fartøj ~ 55% ved at administrere endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkte til badet, som beskrevet ovenfor i afsnit 4.1.2.
- Efter pre konstriktion, sekventielt administrere stigende doser (2 µL) af acetylcholin, hvilket er en receptor-medieret, nitrogenoxid agonist (Ach, 10 -9 til 10 -5 M) direkte til badet. Registrere ændringen i arteriolære diameter 5 min efter administration af hver dosis.
- Når fartøjet har nået et plateau efter administration af den endelige dosis, Ach, vaske fartøj 3 - 4 gange med KREBS løsning. Giver mulighed for 20-30 min for fartøj til at restituere sig og vende tilbage til hvile oprindelige diameter. For at hjælpe med at opretholde pH i orgel camber, ændre KREBS løsning hver 15 min.
- Inkuberes arteriole med N w - nitro - l-arginin methylester (L-navn, 10 -4 M), en hæmmer af nitrogenoxid syntase i 30 min, og derefter gentage 4.2.1 og 4.2.2 at karakterisere den relative bidrag nitrogenoxid til Ach-medieret vasodilation.
- Vurdere endotel-uafhængig vasodilatation (vaskulære glatte muskelceller funktion) og fartøj levedygtigheden af en sekventiel indgift af stigende doser af papaverin (10 -8 til 10 -4 M) direkte til badet. Hvis fartøjet diameter ikke vende tilbage til eller overstiger den hvilende baseline (Di) diameter svar på papaverin (dvs. passende vasodilation), overveje fartøjet ikke-levedygtige og kassér datapunkter.
5. Analyse af data og beregning
- Beregn den vaskulære reaktivitet. Bruge procent vasodilation for data udtryk med hensyn til baseline forskelle i fartøjet diameter og beregne ved hjælp af følgende ligning:
% vasodilation = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
hvor DT er indspillet diameter på et givet tidspunkt (maks. diameter), Dp er diameteren registreres efter tilsætning af vasokonstriktion agent (dvs. ET-1 induceret konstriktion diameter), og Di er diameteren registreres umiddelbart før tilsætning af vasokonstriktion agent (hvilende baseline diameter). 9 - definere vasodilatation og vasokonstriktion følsomhed (dosis-respons) til en agonist som koncentrationen af Ach, papaverin eller ET-1 der fremkalder 50% af den maksimale svar (EF 50) som kan defineres ved en sigmoide parameter og plottet, som tidligere beskrevet. 10
Bemærk: Inter observatør reproducerbarhed undersøgelser af vasodilation af fedt microvessels har en høj korrelationskoefficient (CC) af 0,99 (n = 10 fartøj eksperimenter) i vores laboratorium.
6. statistisk analyse
- Express kontinuerlige målinger som betyder ± SEM. Disse har tendens til at være normalt fordeles. Analysere vaskulære reaktivitet i adipøst arterioler af gentaget-foranstaltninger to-vejs ANOVA.
- Sammenligne alternativt arealet under kurven (AUC) af plot for kumulative vasodilation til dosis-respons mellem behandlingsgrupper. I alle tilfælde overveje P < 0,05 statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores laboratorium har brugt videomicroscopy til at undersøge endotel-afhængig og - uafhængig vasodilatation, samt vasocontractile funktion af fedtvæv arterioler isoleret fra subkutane og visceralt fedt hos overvægtige mennesker. Den karakteristiske eksperimentelle set-up vises i figur 1A. Fedtvæv arterioler er suspenderet mellem to glas kapillær pipetter og fastgjort med suturer inden for orgel salen som vist i figur 1B. Som beskrevet ovenfor i afsnit 5.1, kan arteriolær svar så vurderes ved at undersøge fartøj ved baseline (figur 2A), efterfulgt af pre konstriktion med ET-1 til ~ 55% af baseline diameter (figur 2B), og derefter agonist-induceret vasodilation og afslapning af vaskulær lumen som vist i figur 2 c.
Vi og andre har observeret at endotel-afhængig vasodilatation svar til øget flow (shear stress)11 og Ach12 betydeligt var afrundede i visceral i forhold til subkutan fedt arterioler (figur 3A, 3B ) i menneskelige fedme. Dog var endotel-uafhængig vasodilatation i svar til papaverin ikke varierende ændret mellem de to depoter (fig. 3 c). Sammen, disse resultater tyder på, at vaskulær dysfunktion i visceral domæner er i vid udstrækning et resultat af dysfunktion på niveauet af endotel, mindst i tidlige stadier af sygdommen. Denne teknik tillader systematisk analyse af vasodilator svar af intakt små menneskers arterioler og kan også anvendes til andre tilgængelige områder af den menneskelige Vaskulaturen. Ex vivo -system kan manipuleres ved hjælp af talrige farmakologiske metoder som svar til insulin som et indeks af vaskulære endotel insulin resistens6, eller dosis-respons undersøgelser til nitroglycerin for at teste vaskulære glatte muskulatur lag funktion. 12 biologiske metoder såsom silencing RNA kan også være indført13 potentielt udvikle mekanistiske rammer for at forstå kritiske regulatorer, der giver vaskulær dysfunktion under specifikke sygdomstilstande.
Figur 1: Videomicroscopy set-up. (A) billedet skildrer komponenterne i videomicroscopy orgel kammer. (B) billede af en menneskelige adipøst arteriole monteret mellem to glas kapillær pipetter i salen, orgel. Fartøj diameter ændringer i respons til fysiologiske og farmakologiske stimuli, der kan undersøges og kvantificerede ved hjælp af specialiseret analyse software og en inverteret kamera vedhæftet fil i systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Illustration af mikrovaskulære vasodilatation ved hjælp af pres videomicroscopy. (A) hvilende baseline arteriolære diameter (efter opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet diameter, ingen agonist eller stimulation: Di) (B) pre sammensnøret diameter (efter ET-1 induceret sammensnøret diameter: Dp), (C) Agonist-induceret vasodilated diameter (efter Ach blev tilføjet: DT). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: endotel-afhængig og -uafhængig vasodilatation i subkutan vs visceralt fedt arterioler hos overvægtige mennesker. Endotel-afhængig vasodilatation var betydeligt svækket i visceral sammenlignet med subkutane fedtvæv arterioler når vurderet af (A) øget flow (parret subkutane og visceralt fartøjer, n = 20), eller (B) acetylcholin dose respons med/uden L-navn (parret subkutane og visceralt fartøjer, n = 16). (C) endotel-uafhængig vasodilation var ikke varierende ændret mellem visceral og subkutane arterioler når vurderet af papaverin dose respons (parret subkutane og visceralt fartøjer, n = 8). * Betegner gruppe forskelle mellem depoter; †Denotes depot-specifikke forskelle mellem acetylcholin med L-navn i forhold til acetylcholin alene; NS: ikke signifikant. Data præsenteres som mean± SEM, p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissektion og isolering af fedt arterioler fra omkringliggende væv kan være en tidskrævende og arbejdskrævende proces med omhyggelig opmærksomhed for detaljer og teknisk protokol. Microdissection procedure kræver omhyggelig færdigheder og specialiserede dissektion redskaber til at forebygge potentielle skader den glatte muskulatur eller endotel celle lag af microvasculature. Selv små utilsigtet punkteringer i arteriolære væggen kan forhindre intraluminal opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet og resultater i et mislykket eksperiment. Derudover er cannulation af arterioler udnytte suturer afgørende at sikre arterioler mellem glas kapillær pipette tips i hver ende af skibet.
Menneskelige isolerede microvessels kan udvikle spontane myogenic tone efter 30-40 min for opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet ved 60 mmHg. Dog fandt vi, at menneskelige adipøst arterioler generelt størrelse 50-350 µm af interne luminale diameter er forholdsvis lille med tyndt lag af vaskulære glatte muskelceller, og har tendens til ikke at udvikle væsentlige myogenic tone i forhold til skeletmuskulatur arterioler. Vi dermed inducere pre konstriktion af disse små arterioler ved hjælp af ET-1 før eksponering for vasodilatorer. Vi finder, at ET-1 udøver en mere forudsigelig vasokonstriktor svar mens i nogle tilfælde kan der være variation i svar til alpha receptor agonister såsom phenylephrin. Det er bydende nødvendigt at vælge de passende agonister til at fremkalde en ønsket ~ 55% før konstriktion; men det er også afgørende at vælge den korrekte mængde af præ snærende agent til at forhindre over dosering og giftige skade på fartøjet. Vi opnå dette ved at starte med den lavere række dosis og up-tilsætningen til virkning som beskrevet i afsnit 4.1.2.
Arterioler i fedtvæv er følsomme over for ændringer i pH og temperatur; 14 derfor, det er afgørende at overvåge og kontrollere de relevante pH (7.4) og temperatur (37 ° C) under den eksperimenterende proces. Mens videomicroscopy er en stramt reguleret temperatur kontrolleret system, er det nødvendigt at overvåge pH i opløsningen KREBS i hele eksperiment at undgå forskydninger, som kan give en skævhed resultater. Kontinuerlig boblende af KREBS løsning og udskiftning af løsning hver 15 min under opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet og vaske trin vil reducere pH variationer over tid.
Mens videomicroscopy er en nyttig teknik til at undersøge de funktionelle egenskaber af microvessels, teknikken har en betydelig indlæringskurve og muligvis arbejdsintensive især i løbet af processen af vaskulære isolation. Afhængigt af væv, der er biopsi, har vores erfaring med fedtvæv microvessels vist, at cannulation proceduren kan tage betydelig mængde af tid og tålmodighed. Derudover er der iboende tid følsomhed over for eksperimenterne som fartøjer uden for kroppen tendens til at miste deres fysiologiske og funktionelle egenskaber over tid. Forsøgene skal således udføres i vinduet levedygtige af fartøjer fra minutter til timer efter kirurgisk biopsi før eventuel væv forfald.
Den kliniske relevans og begrundelsen for denne eksperimentelle model udnytter videomicroscopy, for at studere arterioler understøttes af vores evne til direkte sonde Patofysiologi i intakt hele segmenter af menneskelige blodkar fjernet fra levende emner, som ikke kan gentages af ikke-invasive billeddannelse. I virkeligheden, vores evne til direkte adgang og undersøge dysfunktionelle menneskelige blodkar i, for eksempel en overvægtig krop, kan give os mulighed for at få indsigt i veje, der er varierende ændres i sygdomstilstande og oplev roman terapeutiske mål. Desuden publicerede data fra vores laboratorium og andre vise at ex vivo vurdering af fedt arteriolære funktion korrelerer med in vivo systemisk endotelfunktion svar i andre vaskulære senge inden for individ, og knytte med hjerte-kar-risiko faktorer, herunder forhøjet blodtryk, rygning, sukkersyge og betændelse. 12 , 15 , 16 vi har også offentliggjort data, der viser en markant sammenhæng mellem immunhistokemiske resultater relevante for nitrogenoxid biologi i visceralt fedt endotelceller og brachialis arterielle flow-medieret vasodilation tyder på parallelle abnormiteter i fedtholdigt og systemisk oplag. 17 eftersom den systemisk karakter af endotel dysfunktion, mener vi, at denne teknik er en pragmatisk tilgang til at studere ikke blot menneskelige karvæv men også potentielt udnytte denne metode i dyr og kliniske longitudinelle studier til undersøge behandling effekter. Andre teknikker til at undersøge microvasculature fås også som wire blodkar, som har tendens til at være mindre teknisk vanskeligt at udføre og giver mulighed for foranstaltninger af isometrisk spænding af isolerede fartøjer til forskellige agonister ved hjælp af en krafttransducer. Denne metode giver også oplysninger om fysiologiske egenskaber af microvessels, udnytte set-up ikke en intra-luminale presset system, der kan gøre den mindre egnet til at sammenfatte i vivo betingelser. En fordel ved videomicroscopy er evnen til at fremkalde en forholdsvis konstant intraluminal pres minimere ændringer i shear i lumen. Metoden kan anvendes til lignende mellemstore microvessels i både mennesker og dyr. 9 , 12 , 18 endelig skal det bemærkes at en række af kommercielt tilgængelige videomicroscopy systemer er tilgængelige for køb og partnerskaber; men de generelle fysiologiske begreber er ret ensartet på tværs af alle platforme. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger eller interessekonflikter til betænkningen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke frivillige for deres deltagelse i disse undersøgelser og kirurgiske personale på Boston Medical Center for at levere fedtvæv biopsier. Dr. Gokce er understøttet af nationale kontorer i Health (NIH) tilskud HL081587, HL114675 og HL126141. Dr. Farb understøttes af NIH give K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
