Summary
Через двойное лечение колхицином может образоваться токсин, полученный из растений, который убивает делящиеся клетки, без нервов Hydra vulgaris . Эти Hydra не могут кормить или egest самостоятельно. В этой статье описывается улучшенный метод долгосрочного поддержания безрецидивной Hydra vulgaris в лаборатории.
Abstract
Интерстициальная клеточная линия Hydra включает в себя мультипотентные стволовые клетки и их производные: клетки железы, нематоциты, зародышевые клетки и нервные клетки. Интерстициальные клетки можно устранить с помощью двух последовательных обработок колхицином, производным токсином, который убивает делящиеся клетки, тем самым стирая потенциал для обновления дифференцированных клеток, которые получены из интерстициальных стволовых клеток. Это позволяет генерировать Hydra , у которых нет нервных клеток. Нервный полип не может открыть рот для кормления, egest или регулировать осмотическое давление. Однако такие животные могут выживать и размножаться на неопределенный срок в лаборатории, если их регулярно кормят и отрывают. Отсутствие нервных клеток позволяет изучать роль нервной системы в регулировании поведения и регенерации животных. Ранее опубликованные протоколы для поддержания работоспособности Hydra без нервов включали устаревшие методы, такие как пипетирование рта с помощью микропипетки с ручным приводом tIps для подачи и очистки Hydra . Здесь вводится улучшенный протокол для поддержания нервной системы Hydra . Щипцы с тонким наконечником используются, чтобы открыть рот и вставить недавно убитую Артемию . После принудительной подачи полость тела животного смывается свежей средой с помощью шприца и подкожной иглы для удаления непереваренного материала, называемого здесь «отрыжкой». Этот новый метод принудительного кормления и отрыжка нервной системы Hydra благодаря использованию щипцов и шприцев устраняет необходимость в пипетке для рта с помощью ручных наконечников микропипетки. Это делает процесс более безопасным и значительно более эффективным по времени. Чтобы исключить удаление нервных клеток в гипостоме, проводится иммуногистохимия с использованием антитирозинбукулина.
Introduction
Нервная система Hydra состоит из нервной сетки с нейронами, связанными с обоими эпителиальными тканевыми слоями 1 . Нервная сеть плотнее в гипостоме и цветоносе и менее плотная в колонке 2 тела. Нервные клетки происходят из интерстициальных стволовых клеток, которые являются мультипотентными стволовыми клетками, которые приводят к секреторным клеткам, нематоцитам, зародышевым клеткам и нейронам 1 . Можно исключить интерстициальные клетки Hydra vulgaris путем лечения колхицином 3 , 4 , производным токсином, который убивает делящиеся клетки. Хотя обнаружено, что колхицин ингибирует полимеризацию микротрубочек у других организмов, предыдущее исследование показало, что микротрубочки присутствуют в Hydra на протяжении всего лечения, что указывает на то, что колхицин не действует таким образом в Hydra 3 . Еще однаUdy предполагает, что колхицин не эффективно связывается с тубулином в некоторых организмах, включая Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas и Schizosaccharomyces pombe, что может объяснить эту разницу 5 . Обработка колхицином индуцирует фагоцитоз интерстициальных клеток эндодермальными эпителиальными клетками 3 и, таким образом, позволяет создавать животных, которым не хватает нервных клеток, клеток железы и нематоцитов. Неясно, почему интерстициальные клетки особенно восприимчивы к лечению колхицином. Учитывая, что как постмитотические интерстициальные клетки, так и линия интерстициальных стволовых клеток повреждены и фагоцитированы, Кэмпбелл пришел к выводу, что колхицин не оказывает непосредственного влияния на митотическую активность 3 . Примечательно, что обработка колхицином хорошо работает в Hydra vulgaris, но, как было показано, не работает также и у других видов, таких как Hydra oligactis 6 . Hydra viridis 7 . Таким образом, безрецидивная гидра (также иногда называемая «эпителиальная гидра » 8 ) является полезным инструментом для изучения ролей этих специализированных типов клеток из линии междоузельных клеток в тканевом гомеостазе и регенерации.
Гидра может быть единственным известным примером животного, способного жить без нервной системы. Нервная гидра служит особенно полезной моделью для исследования роли нервной сети в регуляции регенерации Гидры , гомеостаза и поведения. Например, введение интерстициальных клеток в нервную гидру посредством трансплантации позволило характеризовать дифференцировку нервных клеток как специфическую для региона 9 . Кроме того, поскольку безрецидивная гидра может восстанавливаться, ониПозволяют исследовать альтернативные, не зависящие от нервной системы пути регенерации. Одним из таких примеров является апикальный нейрогенез и формирование головы, который, как было показано, зависит от функции cnox-2 в нервной системе у дикого типа Hydra , но, по-видимому, он не доступен в безрецидивной Hydra , что указывает на возможность альтернативного процесса регенерации головы 10 .
Нервная гидра также использовалась для изучения экспрессии эпителиальных клеток и регуляции нейрогенных и нейротрансмиссионных генов после потери нейрогенеза 11 . Нервируемая гидра не проявляет спонтанных спазмов 12 , что указывает на то, что эти всплески регулируются нервной системой. Гибридные нервы , однако, сокращаются в ответ на ущемление колонны тела с помощью щипцов, что указывает на то, что сокращение в ответ на механические раздражители опосредуется сочетаниемGh в эпителиальных клетках, тогда как спонтанное сократительное поведение опосредуется путем связывания через щелевые соединения в нервных клетках 13 .
Гидра без нервов не открывают рот, когда они снабжаются пищей или уменьшенным глутатионом 3 , что указывает на то, что сенсорные нейроны необходимы для обнаружения присутствия пищи и сигнала, чтобы открыть рот. Кроме того, нервная сеть, по-видимому, играет определенную роль в определении осмотического давления, поскольку животные без нервов неспособны автономно регулировать свое внутреннее гидростатическое давление через отверстие рта, вызывая их характерный вид, похожий на баллон 3 , 4 ( рисунок 1B ). Регулирование гидростатического давления в безрецидивной гидре при частой ручной дефляции приводило к потере некоторой аномальной морфологии в столбце гипостомы и тела. Однако хроническая дефляция привела к вмешательству в рост, elОрганизация, почкование и организация тканей 8 .
Хотя безрецидивная гидра неспособна самостоятельно кормить и самостоятельно, ее можно поддерживать в течение неопределенного времени в лаборатории путем принудительного кормления и отрыжка каждого животного. В предыдущих публикациях были описаны методы принудительного кормления и отрывания нервной системы Hydra , однако в этих протоколах использовались наконечники микропипетки, которые необходимо осторожно вытащить вручную до соответствующего размера, а также использовать мундштук, соединенный с пипеткой трубкой 14 . Здесь описан более простой, безопасный и более эффективный по времени метод кормления и отрыжка.
Кроме того, предыдущие исследования включали проверку отсутствия нервных клеток путем диссоциации фиксированных животных в отдельные клетки и исследование морфологии клеток 3 , 4 , 15 . ЧАСКроме того, иммуногистохимия с моноклональным антителом против тирозинированного карбоксильного конца альфа-тубулина использовалась в качестве бесплатного метода для мацерации для проверки истощения нейронов в гипостоме 13 , 16 . Предыдущие исследования показали, что нейроны в цветоносе могут также визуализироваться с использованием этого антитела 13 , однако эти нейроны, а также те, которые находятся в колонке тела, сложнее выявить. Хотя иммуногистохимия достаточна для подтверждения отсутствия нервных клеток в гипостоме и не требует опыта по морфологии клеточного типа, ее нельзя использовать для проверки отсутствия интерстициальных стволовых клеток и других производных этих клеток. Исследования диссоциации и клеточной морфологии более строги и могут дать количественный отчет о количестве каждого типа клеток, оставшихся после каждого этапа лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Двойная обработка колхицином
- Сделайте 0,4% колхицин (весовой / объемный) раствор в среде Hydra 3 , 4 , 17 .
Осторожно: Колхицин остро токсичен, смертелен при проглатывании, может вызвать генетические дефекты и может вызвать повреждение глаз. Обращайтесь с порошком в вытяжной шкаф и надевайте полное личное защитное оборудование (СИЗ). - Инкубируйте Hydra vulgaris (штамм AEP), который был голоден в течение 24 часов в 0,4% колхицина в соотношении 5 гидра на мл раствора колхицина в чашке Петри в течение 8 ч при комнатной температуре в темноте.
Примечание: 5 Колхицин Hydra / mL является ориентиром для определения того, сколько раствора использовать, чтобы избежать переполнения блюда Hydra . Используйте тот же объем решения для последующих чисток и изменений в решении. - Удалите раствор колхицина и замените егоС чистой средой Hydra без колхицина. Промывайте Hydra 5 раз путем последовательной передачи с помощью пипетки Pasteur в чистую среду Hydra, прежде чем переносить до 50 мкг / мл рифампицина в среде Hydra . Держите Hydra в инкубаторе 18 ° C.
Примечание. Достаточно 1000 мг рифампицина (50 мг / мл) в диметилсульфоксиде (ДМСО) в течение 1-2 недель лечения можно хранить при 4 ° С. Точная сумма может быть определена общим объемом раствора, используемым каждый день. Например, если есть 2 блюда, каждая из которых содержит 10 мл раствора, который необходимо менять два раза в день, в течение одного дня будет использоваться в общей сложности 40 мл раствора, что соответствует 40 мкл 1 000 гектаров в день или 560 мкл В течение двух недель. Затем продукт разбавляют 1: 1000 в среде Hydra после использования.
Осторожно: ДМСО является горючей жидкостью и легко проникает в кожу, позволяя другим растворенным химическим веществам попасть в организм. РукаЛи растворитель в вытяжном шкафу и носить полный СИЗ. Следует отметить, что ДМСО замерзает при 4 ° С - Изменяйте среду, содержащую рифампицин Hydra, два раза в день, пока гидра не прекратит вытеснять клетки в среду, как правило, через 1 неделю после лечения. В этот момент среда может меняться один раз в день. В течение дней после лечения Гидра полностью потеряет свои щупальца. Избегайте контакта Hydra друг с другом, так как они могут сливаться друг с другом и приводят к необычной форме Hydra ( рисунок 2 A ).
- Во избежание контакта избегайте кручения кругового движения. Вместо этого осторожно агитируйте блюдо в вертикальном и горизонтальном направлениях, пока Hydra не расстанутся. Осмотрите блюдо при помещении Hydra в инкубатор 18 ° C и при необходимости отрегулируйте.
Примечание. В течение дней, когда среда изменяется дважды, измените средуОдин раз утром и снова днем / вечером.
- Во избежание контакта избегайте кручения кругового движения. Вместо этого осторожно агитируйте блюдо в вертикальном и горизонтальном направлениях, пока Hydra не расстанутся. Осмотрите блюдо при помещении Hydra в инкубатор 18 ° C и при необходимости отрегулируйте.
- Как только щупальца начинают формироваться, начните подавать силы и отрывать гидру 3 до 4 раз в неделю (см. Разделы 2 и 3). Около 8-9 дней после лечения колхицином Hydra начнет расти своими щупальцами.
Примечание: размножение щупальца варьируется у индивидуумов. Некоторым может потребоваться больше 8 - 9 дней, прежде чем показывать признаки роста щупальца. Те, которые не разворачивают свои щупальца, а также необычно сформированные ( рис. 2В ) животные или животные, слишком маленькие для кормления, должны быть удалены. Эти Hydra , вероятно, не переживут второго лечения. Гидра может также зарождаться. Однако у некоторых почек все еще могут быть интерстициальные клетки и они могут есть самостоятельно.- Удалите любые почки, которые могут питаться без посторонней помощи и отсоединяться от родительского животного. Определите этих животных, добавив живую Артемию кПодавая блюдо и наблюдая, поймают ли животные или едят Артемию самостоятельно. 1 или 2 Hydra также могут есть самостоятельно. Они также должны быть отброшены.
Примечание: Нервная гидра имеет характерную морфологию, подобную баллону, и щупальца, которые короче и тоньше, чем обычно (из-за потери нематоцитов), и поэтому их можно легко отличить от обычных животных ( рис. 1А, 1В ).
- Удалите любые почки, которые могут питаться без посторонней помощи и отсоединяться от родительского животного. Определите этих животных, добавив живую Артемию кПодавая блюдо и наблюдая, поймают ли животные или едят Артемию самостоятельно. 1 или 2 Hydra также могут есть самостоятельно. Они также должны быть отброшены.
- Через три недели после первого лечения колхицином повторите курс лечения колхицином (шаги 1.1-1.5). Второе лечение колхицина необходимо для устранения оставшихся интерстициальных клеток и нервных клеток 3 .
2. Силовое питание
- Добавьте кисты артемии в узкий и высокий стеклянный контейнер, который сужается внизу. Заполните контейнер водой Artemia (6,72 М NaCl). Избегайте1 г кист на 1 л воды для более высокого выхода люка.
- Накройте верхнюю часть контейнера парафильмом и вставьте 10 мл серологической пипетки через парафильм в контейнер. Обеспечьте аэрацию, подключив трубку к воздушному насосу аквариума и установите трубку вокруг пипетки. Убедитесь, что наконечник пипетки достигает нижней части контейнера и что кисты не установлены на дне. Артемия вылупится через 48 часов.
Примечание. Существует много разных способов вылупления Artemia, которые могут работать так же хорошо.
- Накройте верхнюю часть контейнера парафильмом и вставьте 10 мл серологической пипетки через парафильм в контейнер. Обеспечьте аэрацию, подключив трубку к воздушному насосу аквариума и установите трубку вокруг пипетки. Убедитесь, что наконечник пипетки достигает нижней части контейнера и что кисты не установлены на дне. Артемия вылупится через 48 часов.
- Проденьте артемию из воды Артемии в сети Artemia (можно получить у компаний по аквариуму) и промойте их в течение примерно 20 с в воде DI перед тем, как поместить их в блюдо с средой Hydra . Соленость воды Артемии слишком высока для Hydra , поэтому артемия должна быть вымыта до их использования.
- Под рассекающим микроскопом,Эвтаназии Артемии , слегка сжимая их с помощью пары тонких щипцов. Избегайте сдавливания достаточно сильно, чтобы вытеснить кишки, так как это будет прилипать к щипцам и затруднить кормление. Слегка сжимая артемию, прежде чем кормить ее в Hydra , поможет в процессе пищеварения 14 . Поместите свежеиспеченную артемию рядом с Hydra в блюдо, чтобы облегчить быстрое кормление.
Примечание. Все последующие шаги выполняются под рассекающим микроскопом. - Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать Hydra от стебля. Продолжайте держать плодоножку во время процесса подачи Hydra . Используя вторую пару щипцов, зажмите колонку корпуса, чтобы сделать контракт Hydra .
- Удерживая кончики второй пары щипцов вместе, нажмите в центре гипостомы (куполообразная структура устного конца животного). Это иногда заставляет рот открываться. яЕсли рот не открывается, постукивая, проколоть рот, вставив щипцы в центр гипостомы, а затем слегка отпустите давление на кончики щипцов. Это должно растянуть отверстие рта, сделанное проколом.
Примечание: Hydra может сдуваться и разрушаться при открытии рта ( рисунок 2 C ). Если это произойдет, артемия все еще может быть вставлена в Hydra . Если это слишком сложно сделать, перейдите к следующей Hydra и вернитесь к оригинальной Hydra через некоторое время и повторите попытку. Hydra, как правило, не выкалывают столько же во время последующих отверстий для рта. - Быстро возьмите Артемию с помощью щипцов и вставьте их в желудочную полость Hydra . Вставьте как можно больше артемий до тех пор, пока полость желудка не станет полной, и больше Артемия не может быть вставлена без повреждения гидры , несчастного случаяСоюзник, вытаскивающий любую артемию внутрь или предотвращая закрытие рта. В среднем это 5-6 артемий , однако до 12 животных кормили до 12 животных.
- Если рот начинает закрываться, снова растяните его с помощью щипцов, как описано выше; Однако следует проявлять осторожность, поскольку любая артемия, уже находящаяся внутри животного, может начать выходить, когда рот снова открывается.
- Если Hydra слишком мала для цельной артемии , вырежьте артемию с помощью скальпеля и кормите меньшие кусочки Hydra . Если Артемия не останется внутри Гидры , может потребоваться нажать на щипцы против Артемии, чтобы держать ее внутри Hydra, пока ее рот не закроется.
- Перенесите Hydra со стеклянной пипеткой Pasteur, чтобы избежать случайного отрыжка, на блюдо со свежим 50 мкг / мл рифампицином в среде Hydra . Если артемия была изгнана fРодите Hydra во время передачи, снова вставьте его в новое блюдо.
Примечание. Для переноса Hydra используется стеклянная пипетка, так как было установлено, что Hydra меньше по сравнению с пластиком. Длина пипетки не имеет значения, но использование 5-дюймовых пипеток может быть несколько проще.
3. Обрызгивание
- Burp the Hydra для удаления непереваренного материала в любое время между 8 и 20 ч после кормления.
- Песок вниз точки 30G подкожной иглы с P320 или аналогичной пескоструйной наждачной бумагой до кончика плоский.
Примечание: игла для подкожных инъекций 27G также будет работать, но предпочтительнее использовать меньший наконечник верхнего калибра. - Прикрепите иглу к одноразовому пластиковому шприцу объемом 1 мл и заполните шприц свежим 50 мкг / мл рифампицином в среде Hydra .
Примечание: Погрузка одной Hydra занимает около 0,05 мл до 0,1 мл раствора. 1 мл сириNge предпочтительнее, поскольку регулирование силы и объема выходящего раствора затруднено с помощью шприца большего объема. - Под рассекающим микроскопом держите стебель Hydra с помощью точечных пинцетов и нажмите в центре гипостомы иглой. Если рот не открывается, вставьте щипцы в гипостому и откройте рот, как описано выше для кормления.
Примечание. Все последующие шаги выполняются под рассекающим микроскопом. - Используйте шприц для промывки, очень осторожно, чтобы избежать выдувания всего животного, желудочной полости с помощью раствора рифампицина 50 мкг / мл до тех пор, пока все мусора не будут удалены. Игла не обязательно должна быть вставлена в Hydra, если размер Hydra не позволяет. Игла может удерживаться близко к отверстию для рта и направлена прямо в сторону рта.
- Используя стеклянную пипетку Пастера, перенесите Гидру на блюдо со свежим 5081 г / мл рифампицина в среде Гидры .
4. Контроль качества через иммуногистохимию
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующий протокол адаптирован из протоколов Shenk, M.A и др. 18 , и Böttger, A 19 . Все шаги выполняются при комнатной температуре (RT), если не указано иное. Нутатор можно использовать для инкубационных стадий и может улучшить качество окрашивания. Однако, если Hydra запутаться друг с другом, все шаги также могут выполняться без.
- Подготовьте блокирующий раствор: 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% ДМСО в 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Хранить это решение при 4 ° C до использования (шаги 4.6 и 4.11). Решение можно хранить в течение 1 - 2 дней.
Примечание. Все решения, используемые в этом протоколе, должны быть надлежащим образом собраны в качестве опасных отходов. - Расслабьте Hydra в 200 мкл 2% уретана в Hydra mEdium в течение 1 мин в 1,7 мл микроцентрифужных пробирках. Используйте 5 гидр на пробирку для каждого из 4 состояний: без нервов, необработанных, необработанных без первичных антител и необработанных без вторичного антитела.
Примечание: не превышайте 1 мин. Время здесь критическое, поскольку животные будут в плохом состоянии, потратив слишком много времени на уретан. - Удалите уретан и зафиксируйте Hydra в 200 мкл 4% параформальдегида (PFA) в среде Hydra в течение 15 мин.
- Промывайте образцы 3 раза 1х PBS в течение 10 минут каждый.
Примечание. Все промывки с PBS и PBSTx производятся с 500 мкл раствора. - Пермеабилизируйте с 500 мкл 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин.
- Удалите 0,5% Triton X-100 и добавьте 500 мкл блокирующего раствора. Заблокируйте образцы в течение не менее 1 часа.
- Разбавьте антитирозин-тубулиновое антитело 1: 200 в блокирующем растворе.
Примечание. Эта концентрация былаЭкспериментально. Если сигнал в элементах управления окажется слишком слабым, можно, возможно, увеличить концентрацию. Если существует неспецифическое связывание, необходимо уменьшить концентрацию. Предварительная инкубация антитела также может помочь уменьшить неспецифическое связывание. - Удалите блокирующий раствор из образцов и добавьте 200 мкл первичного антитела к безрецидивной гидре , необработанные контрольные образцы и необработанные контрольные образцы без вторичных. Для необработанных контролей без первичных веществ добавляйте только 200 мкл блокирующего раствора без антитела.
- Инкубируйте образцы в течение ночи (> 12 ч) при 4 ° С.
Примечание: В качестве альтернативы, инкубируйте 5-6 часов при комнатной температуре. - Удалите первичное антитело и тщательно промойте образцы 0,3% Triton X-100 в 1x PBS (PBSTx).
Примечание. Сохраните первичное антитело и храните его при 4 ° C, так как его можно использовать повторно как минимум 2 - 3 раза. - Разбавляют козьим антимышиным hP вторичным антибиотикомOdy 1: 500 в блокирующем растворе. Добавьте 200 мкл в нервную систему Hydra , необработанные элементы управления и необработанные элементы управления без первичной обработки. Для необработанных контролей без вторичных, добавьте только 200 мкл блокирующего раствора без антитела.
Примечание: В качестве альтернативы можно использовать флуоресцентное вторичное антитело, для которого не требуются шаги 4.13-4.17. Использование флуоресцентной вторичной памяти экономит время и, как правило, адекватно, но вторичная hP обеспечивает повышенную чувствительность. Концентрация вторичной среды определялась экспериментально. Если обнаружено, что сигналы в элементах управления слишком слабы, возможно, необходимо увеличить концентрацию. Если существует неспецифическое связывание, необходимо уменьшить концентрацию. - Инкубируйте образцы в течение ночи при 4 ° C.
- Удалите вторичное антитело и тщательно промойте образцы PBSTx.
- Приготовить 1x PBT: 0,2% бычий сывороточный альбумин (вес / объем) и 0,05% Tween20 в 1x PBS. Инкубируйте sАмпулы в 1x PBT в течение 30 мин.
- Удалите 1 × PBT и инкубируйте образцы в 1: 1000 NHS-флуоресцеин и 1: 10000 H 2 O 2 в 1x PBT в течение 15 минут в темноте. На этом этапе держите образцы в темноте как можно больше, так как флуоресцентный сигнал будет уменьшаться по мере того, как они подвергаются воздействию света.
Примечание: NHS-флуоресцеин был приготовлен по подробному протоколу FISH King, RS и Newmark, PA 20 - Промойте образцы 3 раза с PBSTx быстро, затем 2 раза в течение 30 минут.
- Оставьте образцы в PBSTx в течение ночи при 4 ° C для продолжения стирки.
- Сделайте еще несколько стирок с 1x PBSTx. Чтобы визуализировать ядра клеток, выполните следующие необязательные стадии для контрастирования ДНК с использованием 4 ', 6-диаминдино-2-фенилиндола, дигидрохлорида (DAPI). В противном случае образцы могут быть отображены сейчас.
- Разбавьте 5 мг / мл запаса DAPI до рабочей концентрации 1: 500 в PBSTx и добавьте 200 мкл к каждой пробирке. INCUПроцедить образцы в течение 30 мин.
Осторожно: DAPI - известный канцероген. Носите полный СИЗ. - Удалите DAPI и промойте образцы 2 - 3 раза PBSTx перед визуализацией с помощью флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сразу после начального 8-часового лечения колхицином все гидра выживают. У некоторых из этих Hydra останутся только останки щупальца ( рис. 3 A ), в то время как другие полностью потеряют свои щупальца ( рис. 3 B ). В течение следующих 1 или 2 дней щупальца будут продолжать сокращаться, пока все Hydra не потеряют щупальца. Примерно через 1 неделю после лечения у Hydra появятся признаки восстания щупальца с небольшими заглушками, такими как щупальца ( рис. 3 C ), прежде чем они полностью регенерируют свои щупальца ( рис. 3 D ). Из оригинальной Hydra , около 50-60% в конечном итоге регенерируют свои щупальца в течение 1-2 недель после лечения.
ПослеВ то время как после первого лечения восстановление животных аналогично восстановлению. Таким образом, около 10% исходного количества животных, которые попадали в обе процедуры, восстанавливаются и растут до размера, подходящего для экспериментов ( рис. 1В ). У этих Hydra есть щупальца, которые кажутся тоньше, чем у необработанных животных, имеют более прозрачную ткань и будут казаться раздутыми из-за невозможности открыть рот, чтобы снять осмотическое давление ( рис. 1А , 1В). Любые животные, которые не кормят, могут выживать в течение нескольких недель, однако незаживающие животные будут уменьшаться в размерах и становятся все труднее кормить.
Гидра, которая восстанавливается после второй обработки, может поддерживаться на неопределенный срок. Эти животные могут почуствовать, тем самым поддерживая и увеличивая население. Кроме того, население может быть выращеноРазрезая этих животных и позволяя им регенерировать 4 .
Иммуногистохимия подтверждает потерю нейронов в гипостоме после второй обработки колхицином. Плотную нервную сетку в гипостоме можно визуализировать с использованием антитирозин-тубулинового антитела 13 , 16 и демонстрировать различные волокна, излучающие наружу из рта и явные клеточные тела ( рис. 4А ). Эти волокна отсутствуют в безрецидивной Hydra , которые были получены путем двойной обработки колхицином ( рисунок 4 B ). Кроме того, совместное окрашивание с DAPI обнаруживает уменьшенное количество ядер клеток в нервной гидре по сравнению с необработанными контрольными средствами из-за потери клеток линии междоузельных клеток в результате обработки колхицином ( рисунок4А, 4В ).
Рисунок 1 . Сравнение безрецидивной и необработанной гидры .
(A) Необработанная гидра . (B) Гидра без нервов через 22 дня после второй обработки колхицином. Обратите внимание на распухшую колонну тела и тонкие щупальца у невесомого животного. Шкалы шкалы составляют 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 . Примеры деформированной гидры .
(A) Две гидры (B) Нечетная форма Hydra . (C) Гидра , которая сдулась после открытия рта. Масштабирование составляет 400 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 . Репрезентативные изображения Hydra после первого 8-часового лечения колхицином.
(A) Гидра с острыми щупальцами сразу после лечения. (B) Гидра , полностью потерявшая свои щупальца сразу после лечения. (C) Гидра, которая начинает восстанавливать свои щупальца через 8 дней после лечения. (D)Гидра , которая полностью восстановила свои щупальца через 13 дней после лечения. Масштабирование составляет 400 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 . Потеря нервных клеток в гипостоме может быть подтверждена иммуногистохимией.
(А) Гипостат необработанной Гидры и (В) гипостомы безрецидивной Гидры приблизительно через 2 недели после второй обработки колхицином, помеченной (i) антителом против тирозина-тубулина и (II) DAPI. (Iii) показывает наложение. * Указывает местоположение рта. Максимальные проекции z были сделаны из стекольных флуоресценции z спиннингового диска, взятых с eXposures 500 мс (GFP) и 15 мс (DAPI). Яркость и контраст были скорректированы для улучшения видимости. Шкалы шкалы составляют 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гистидные интерстициальные клетки могут быть устранены с помощью двойной обработки колхицином 3 , 4 . В дни, следующие за первой обработкой, крайне важно предотвратить контакт между отдельными Hydra, чтобы избежать слияния кусков Hydra в деформированную Hydra . Кроме того, животные, которые могут питаться без посторонней помощи после первой обработки, должны быть удалены, так как вторая обработка колхицином может быть недостаточной для удаления оставшихся интерстициальных клеток у таких животных. Чтобы максимизировать выживаемость безрецидивной гидры после второй обработки колхицином, животных следует кормить как можно больше артемий после восстановления после первой обработки, с 1 до 2 дней между кормлениями для восстановления и роста. Каждая обработка колхицина приводит к тому, что Hydra значительно уменьшаются по размеру, поскольку клетки подвергаются фекализации, поэтому чем больше Hydra находится перед каждой обработкой, bЧто Гидра восстановится до размера, который можно кормить и поддерживать.
Из-за низкой выживаемости Hydra после каждого лечения может быть желательно начать со многих Hydra . Однако следует проявлять осторожность при начале лечения слишком много Hydra . Это сделает кормление после первого лечения сложным и чрезвычайно трудоемким. Животные, кормящиеся после первой обработки, восстанавливаются до более крупных размеров и, следовательно, имеют более высокую выживаемость после второй обработки. Таким образом, может быть более продуктивным начать с меньшего количества и сосредоточиться на кормлении лучше. Как правило, начиная с 50 - 100 животных можно управлять 1 - 2 человек. Также лучше всего начать с самой большой Гидры , поскольку они лучше выживут в двух обработках.
Метод принудительного кормления и отрыжка Hydra , которые отсутствуют в нервных клетках, описанных здесь, безопаснее, проще и больше времени-эффективности, чем методы, описанные в прошлых 3 , 4 , 14 . Использование коммерчески доступных щипцов и шприцев устраняет необходимость в ручных вытяжках микропипетки, которые требуют много времени и трудностей в изготовлении. Использование этих инструментов также позволяет избежать пипетки. Принудительное питание с использованием щипцов может быть затруднено сначала, но при достаточном времени и практике это становится довольно простым и эффективным. Сначала нужно практиковать силовое кормление и отрываться от нормальной Hydra, чтобы понять, сколько силы использовать с инструментами и как манипулировать Hydra . Были проверены различные размеры щипцов и игл, чтобы найти оптимальные инструменты для принудительной подачи и отрыжка.
Использование окрашивания антител, как описано здесь, является достаточным для проверки отсутствия нервных клеток в гипостоме. Чтобы исключить удаление всех интерстициальных клеток, животных можно мацерировать иТипы присутствующих клеток можно исследовать 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарны д-ру Дику Кэмпбеллу (UC Irvine) за обсуждения первоначального протокола для создания и поддержки животных, свободных от нервов, г-жу Руи Ван за помощь в адаптации техники шприца и иглы, и г-жа Даниэль Хагстром и д-р Роб Стил (UC Irvine) для комментариев к рукописи. Эта работа была поддержана грантом RCSA и NSF CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
