Summary
A través de un doble tratamiento con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, Hydra vulgaris libre de nervios puede ser generado. Estos Hydra no puede alimentar o egest en sus los propios. Este artículo describe un método mejorado para el mantenimiento a largo plazo de Hydra vulgaris libre de nervios en el laboratorio.
Abstract
El linaje celular intersticial de Hydra incluye células madre multipotentes, y sus derivados: células de las glándulas, nematocitos, células germinales y células nerviosas. Las células intersticiales se pueden eliminar a través de dos tratamientos consecutivos con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, eliminando así el potencial de renovación de las células diferenciadas que se derivan de las células madre intersticiales. Esto permite la generación de Hydra que carecen de células nerviosas. Un pólipo libre de nervios no puede abrir su boca para alimentar, egestar o regular la presión osmótica. Estos animales, sin embargo, pueden sobrevivir y ser cultivados indefinidamente en el laboratorio si se alimentan regularmente con fuerza y eructaron. La falta de células nerviosas permite estudiar el papel del sistema nervioso en la regulación del comportamiento animal y la regeneración. Los protocolos publicados previamente para el mantenimiento de Hydra sin nervios implican técnicas anticuadas, como la pipeta de boca con micropipeta manualIps para alimentar y limpiar la Hydra . Aquí, se introduce un protocolo mejorado para el mantenimiento de la hidra libre de nervios. Pinzas de punta fina se utilizan para forzar la apertura de la boca e insertar recién muertos Artemia . Después de la alimentación forzada, la cavidad corporal del animal se limpia con un medio fresco utilizando una jeringuilla y una aguja hipodérmica para retirar el material no digerido, denominado aquí "eructo". Este nuevo método de alimentación forzada y eructar a la hidra sin nervios mediante el uso de fórceps y jeringas elimina la necesidad de pipetear la boca usando puntas de micropipeta tiradas a mano. Por lo tanto, hace que el proceso más seguro y significativamente más tiempo eficiente. Para asegurar que las células nerviosas en el hypostome han sido eliminadas, inmunohistoquímica utilizando anti-tirosina-tubulina se lleva a cabo.
Introduction
El sistema nervioso de Hydra consiste en una red nerviosa, con neuronas asociadas con ambas capas de tejido epitelial 1 . La red nerviosa es más densa en el hypostome y pedúnculo y menos densa en la columna corporal 2 . Las células nerviosas se originan a partir de células madre intersticiales, que son células madre multipotentes que dan lugar a células secretoras, nematocitos, células germinales y neuronas 1 . Es posible eliminar las células intersticiales de Hydra vulgaris a través del tratamiento con colchicine 3 , 4 , una toxina derivada de plantas que mata a las células en división. Aunque se ha encontrado que la colchicina inhibe la polimerización de microtúbulos en otros organismos, un estudio previo ha demostrado que los microtúbulos están presentes en Hydra durante todo el tratamiento, lo que sugiere que la colchicina no actúa de esta manera en Hydra 3 . OtraUdy sugiere que la colchicina no se une eficazmente a la tubulina en algunos organismos, incluyendo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas y Schizosaccharomyces pombe, lo que puede explicar esta diferencia 5 . El tratamiento con colchicina induce la fagocitosis de las células intersticiales por las células epiteliales endodérmicas 3 y permite así la creación de animales que carecen de células nerviosas, glándulas y nematocitos. No está claro por qué las células intersticiales son particularmente susceptibles al tratamiento con colchicina. Dado que tanto las células intersticiales post-mitótico y el linaje de las células madre intersticiales están dañados y fagocitados, Campbell llegó a la conclusión de que la colchicina no estaba afectando directamente a la actividad mitótica [ 3] . En particular, el tratamiento con colchicina funciona bien en Hydra vulgaris, pero se ha demostrado que no funciona tan bien en otras especies, como Hydra oligactis 6 . Hydra viridis libre de nervios 7 . La Hydra libre de nervios (también denominada a veces " Hydra epitelial" 8 ) es por lo tanto una herramienta útil para estudiar las funciones de estos tipos celulares especializados del linaje celular intersticial en la homeostasis y regeneración de los tejidos.
Hydra puede ser el único ejemplo conocido de un animal capaz de vivir sin un sistema nervioso. La hidra libre de nervios sirve como un modelo particularmente útil para diseccionar el papel de la red nerviosa en la regulación de la regeneración, la homeostasis y el comportamiento de la hidra . Por ejemplo, la introducción de células intersticiales en la hidra libre de nervios a través de injerto permitió la caracterización de la diferenciación de las células nerviosas como altamente específica de la región [ 9] . Además, debido a que la hidra libre de nervios puede regenerarse,Permitir la investigación de alternativas, sistema nervioso independiente de las vías de regeneración. Un ejemplo de ello es la neurogénesis apical y la formación de la cabeza, que se ha demostrado que dependen de la función cnox-2 en el sistema nervioso en el Hydra de tipo silvestre, pero parece ser dispensable en Hydra libre de nervios, sugiriendo que puede haber un proceso alternativo de regeneración de la cabeza 10 .
Hidra libre de nervios también se han utilizado para estudiar la expresión de células epiteliales y la regulación de genes neurogénicos y neurotransmisión después de la pérdida de la neurogénesis [ 11] . La Hidra libre de nervios no exhibe ráfagas de contracción espontánea 12 , lo que indica que estas ráfagas están reguladas por el sistema nervioso. Sin embargo, la hidra libre de nervios se contrae en respuesta a pellizcar la columna del cuerpo con fórceps, lo que sugiere que la contracción en respuesta a estímulos mecánicos está mediada por el acoplamientoGh hueco en las células epiteliales, mientras que el comportamiento contractil espontáneo es mediada por el acoplamiento a través de las uniones gap en las células nerviosas [ 13] .
La Hidra libre de nervios no abre la boca cuando se les presenta con alimentos o glutatión 3 reducido, lo que sugiere que las neuronas sensoriales son necesarias para detectar la presencia de alimentos y señalar la boca para abrir. Además, la red nerviosa parece desempeñar un papel en la detección de la presión osmótica, ya que los animales libres de nervios son incapaces de regular autónomamente su presión hidrostática interna a través de la apertura de la boca, causando su aspecto característico de globo 3 , 4 . La regulación de la presión hidrostática en la hidra libre de nervios mediante una deflación manual frecuente condujo a la pérdida de alguna morfología anormal en el hiposuero y la columna corporal. Sin embargo, la deflación crónica condujo a la interferencia con el crecimiento, elCión, brotación y organización de los tejidos 8 .
Aunque la hidra libre de nervios es incapaz de alimentarse y egestar por sí misma, es posible mantenerlos indefinidamente en el laboratorio mediante la alimentación manual y la eructación de cada animal. Las publicaciones anteriores han descrito métodos de alimentación forzada y eructos de la hidra libre de nervios, sin embargo estos protocolos implicaron el uso de puntas de micropipeta que deben ser tiradas con cuidado al tamaño apropiado así como el uso de una boquilla conectada a la pipeta por el tubo 14 . Aquí, se describe un método más simple, más seguro y más eficiente en tiempo de alimentación y eructos.
Además, los estudios previos implicaron la comprobación de la ausencia de células nerviosas a través de la disociación de animales fijos en células individuales y el examen de la morfología celular [ 3 , 4 , 15] . MARIDOAntes, se utilizó inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal contra el extremo carboxilo tirosinado de la alfa-tubulina como método complementario de maceración para comprobar el agotamiento de las neuronas en el hipostómetro 13 , 16 . Estudios anteriores han demostrado que las neuronas en el pedúnculo también se pueden visualizar utilizando este anticuerpo 13 , sin embargo estas neuronas, así como los de la columna del cuerpo son más difíciles de hacer. Si bien la inmunohistoquímica es suficiente para confirmar la ausencia de células nerviosas en el hipostómetro y no requiere experiencia en la morfología del tipo celular, no puede utilizarse para comprobar la ausencia de las células madre intersticiales y las otras derivadas de estas células. Los estudios de disociación y morfología celular son más rigurosos y pueden dar una cuenta cuantitativa de los números de cada tipo de células restantes después de cada etapa del tratamiento.
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Protocol
1. Tratamiento doble de la colchicina
- Hacer una solución de colchicina (peso / volumen) al 0,4% en medio 3 , 4 , 17 de Hydra .
Precaución: La colchicina es extremadamente tóxica, fatal si se ingiere, puede causar defectos genéticos y puede causar daño ocular. Manipule el polvo en una campana extractora y lleve equipo protector personal completo (PPE). - Incubación Se utilizó Hydra vulgaris (cepa AEP) que se ha dado hambre durante 24 h en colchicina al 0,4% a razón de 5 Hydra por ml de solución de colchicina en una placa de Petri durante 8 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
Nota: 5 La colchicina Hydra / mL es una guía para determinar cuánta solución utilizar para evitar el hacinamiento del plato con Hydra . Utilice el mismo volumen de solución para limpiezas posteriores y cambios en la solución. - Retire la solución de colchicina yCon medio limpio de Hydra sin colchicina. Lavar la Hydra 5 veces por transferencia en serie con una pipeta Pasteur de vidrio en medio limpio de Hydra antes de transferir a 50 μg / mL de rifampicina en medio Hydra . Mantenga la Hidra en una incubadora a 18 ° C.
Nota: Se puede almacenar suficiente cantidad de rifampicina en dosis de 1.000X (50 mg / ml) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) durante 1-2 semanas de tratamiento a 4 ° C. La cantidad exacta puede determinarse por el volumen total de solución utilizado cada día. Por ejemplo, si hay 2 platos, cada uno con 10 mL de solución que se necesita cambiar dos veces al día, se utilizará un total de 40 mL de solución en un día, lo que corresponde a 40 μl de 1,000X de stock por día o 560 μL Durante un período de dos semanas. El stock se diluye después 1: 1000 en medio Hydra al usarlo.
Precaución: DMSO es un líquido combustible y penetra fácilmente en la piel, permitiendo que otros químicos disueltos en el cuerpo. ManoEl solvente en una campana de humos y el desgaste PPE completo. De notar, el DMSO se congela a 4 ° C - Cambiar el medio de Hydra que contiene rifampicina dos veces al día hasta que el Hydra deje de expulsar las células al medio, lo que generalmente es una semana después del tratamiento. En este punto, el medio se puede cambiar una vez al día. Durante los días siguientes al tratamiento, la Hidra perderá completamente sus tentáculos. Evite tener la Hydra en contacto entre sí, ya que pueden fusionarse y dar lugar a Hydra extraño en forma ( Figura 2 A ).
- Para evitar el contacto, evite girar el plato en un movimiento circular. En su lugar, agite suavemente el plato en dirección vertical y horizontal hasta que la Hydra se separe. Inspeccione el plato cuando coloque la Hydra en la incubadora a 18 ° C y ajústela según sea necesario.
Nota: Para los días en que el medio se cambia dos veces, cambie el medioUna vez por la mañana y otra vez por la tarde / noche.
- Para evitar el contacto, evite girar el plato en un movimiento circular. En su lugar, agite suavemente el plato en dirección vertical y horizontal hasta que la Hydra se separe. Inspeccione el plato cuando coloque la Hydra en la incubadora a 18 ° C y ajústela según sea necesario.
- Una vez que los tentáculos comienzan a formarse, comience la alimentación forzada y eructar la Hydra 3 a 4 veces por semana (vea Secciones 2 y 3). Aproximadamente 8-9 días después del tratamiento con colchicina, la Hidra comenzará a hacer crecer sus tentáculos.
Nota: El rebrote del tentáculo varía entre los individuos. Algunos pueden tomar más de 8 a 9 días antes de mostrar señales de crecimiento de tentáculos. Aquellos que no vuelvan a crecer sus tentáculos, así como animales de forma extraña ( Figura 2 B ) o animales demasiado pequeños para ser alimentados deben ser eliminados. Es probable que estos Hydra no sobrevivan al segundo tratamiento. La Hydra también puede brotar. Sin embargo, algunos de los brotes todavía pueden tener células intersticiales y ser capaces de comer por su cuenta.- Quite los brotes que pueden comer sin ayuda y separar del animal de padre. Identifique estos animales añadiendo Artemia viva a laAlimentando el plato y observando si o no los animales cogen y comen el Artemia en sus los propios. 1 o 2 Hydra también puede ser capaz de comer por su cuenta. También deben descartarse.
Nota: La hidra libre de nervios tiene una morfología similar a un globo, y tentáculos que son más cortos y más finos de lo normal (debido a la pérdida de nematocitos) y pueden distinguirse fácilmente de los animales de aspecto normal ( Figura 1A, 1B ).
- Quite los brotes que pueden comer sin ayuda y separar del animal de padre. Identifique estos animales añadiendo Artemia viva a laAlimentando el plato y observando si o no los animales cogen y comen el Artemia en sus los propios. 1 o 2 Hydra también puede ser capaz de comer por su cuenta. También deben descartarse.
- Tres semanas después del primer tratamiento con colchicina, repita el tratamiento con colchicina (pasos 1.1 - 1.5). Un segundo tratamiento de colchicina es necesario para eliminar el resto de las células intersticiales y las células nerviosas [ 3] .
2. Alimentación forzada
- Añadir quistes de Artemia a un recipiente de vidrio estrecho y alto que se estrecha en la parte inferior. Llenar el recipiente con agua Artemia (NaCl 6,72 M). Evita exceEding 1 g de quistes por 1 L de agua para un mayor rendimiento de escotilla.
- Cubrir la parte superior del recipiente con parafilm e insertar una pipeta serológica de 10 ml a través del parafilm en el recipiente. Proporcione la aireación uniendo el tubo a una bomba de aire del acuario y ajustando el tubo alrededor de la pipeta. Asegúrese de que la punta de la pipeta llegue a la parte inferior del recipiente y que no quistes se establecen en la parte inferior. La Artemia eclosionará después de 48 h.
Nota: Hay muchas maneras diferentes de tramar Artemia que pueden funcionar igual de bien.
- Cubrir la parte superior del recipiente con parafilm e insertar una pipeta serológica de 10 ml a través del parafilm en el recipiente. Proporcione la aireación uniendo el tubo a una bomba de aire del acuario y ajustando el tubo alrededor de la pipeta. Asegúrese de que la punta de la pipeta llegue a la parte inferior del recipiente y que no quistes se establecen en la parte inferior. La Artemia eclosionará después de 48 h.
- Colar la Artemia del agua de Artemia en una red de Artemia (disponible en las compañías de suministro de acuario) y lavarlos durante unos 20 s en agua DI antes de colocarlos en un plato con medio Hydra . La salinidad del agua de Artemia es demasiado alta para Hydra , por lo que la Artemia debe ser lavada antes de ser utilizada.
- Bajo un microscopio de disección,Eutanasiar la Artemia apretándolos ligeramente con un par de pinzas finas. Evite apretar lo suficientemente duro para expulsar las tripas, ya que se adhieren a la pinza y hacer la alimentación difícil. Apretar ligeramente la Artemia antes de alimentarla a la Hidra ayudará con el proceso de digestión 14 . Coloque la recién muerta Artemia cerca de la Hydra en el plato para facilitar la alimentación rápida.
Nota: Todos los pasos posteriores se realizan bajo un microscopio de disección. - Utilice un par de fórceps para sostener la hidra por el pedúnculo. Continúe sosteniendo el pedúnculo durante el proceso de alimentación de la Hidra . Usando un segundo par de pinzas, pellizque la columna del cuerpo para hacer que el Hydra se contraiga.
- Mientras sostiene las puntas del segundo par de pinzas juntas, toque en el centro del hypostome (la estructura abovedada en el extremo oral del animal). Esto a veces hace que la boca se abra. yoF la boca no se abre golpeando, perforar la boca insertando el fórceps en el centro del hipostótomo y luego liberar ligeramente la presión sobre las puntas del fórceps. Esto debe estirar la abertura de la boca hecha por la punción.
Nota: La hidra puede desinflarse y colapsarse cuando se abre la boca ( Figura 2 C ). Si esto ocurre, la Artemia puede todavía ser insertada en la Hidra . Si es demasiado difícil hacerlo, pasar a la siguiente Hydra y volver a la Hydra original algún tiempo más tarde e intentarlo de nuevo. La Hidra tiende a no desinflarse tanto durante las aberturas posteriores de la boca. - Recoger rápidamente Artemia con la pinza e insertarlas en la cavidad gástrica de la Hidra . Insertar tantas Artemia como sea posible hasta que la cavidad gástrica esté llena y no pueda insertarse más Artemia sin dañar la Hidra , accidenteTirando hacia fuera cualquier Artemia adentro, o evitando que la boca se cierre. En promedio, esto es 5-6 Artemia , sin embargo hasta 12 han sido alimentados a los animales más grandes.
- Si la boca comienza a cerrarse, estirar de nuevo con la pinza como se describe arriba; Sin embargo, se debe tomar precaución como cualquier Artemia ya dentro del animal puede comenzar a salir cuando se reabre la boca.
- Si la Hydra es demasiado pequeña para una Artemia entera, corte la Artemia con un bisturí y alimente las piezas más pequeñas de Hydra . Si la Artemia no permanece dentro de la Hidra , puede ser necesario presionar la pinza contra la Artemia para mantenerla dentro de la Hidra hasta que su boca se cierre.
- Transferir Hydra alimentado con una pipeta Pasteur de vidrio, con cuidado para evitar el eructo accidental, a un plato con rifampicina 50 μg / ml fresco en medio Hydra . Si una Artemia fue expulsada fRom el Hydra mientras que transfiere, reinsértelo mientras que en el nuevo plato.
Nota: Una pipeta de vidrio se utiliza para transferir la Hydra , ya que se ha encontrado que Hydra palo menos al vidrio en comparación con el plástico. La longitud de la pipeta no importa, pero el uso de pipetas de 5 pulgadas puede ser algo más fácil.
3. Burping
- Burpe la Hidra para eliminar el material no digerido en cualquier momento entre 8 y 20 h después de la alimentación.
- Lijar el punto de una aguja hipodérmica 30G con P320 o papel de lija de grano similar hasta que la punta esté plana.
Nota: Una aguja hipodérmica 27G también funcionaría, pero la punta más pequeña del calibre más alto es preferible. - Sujete la aguja a una jeringa de plástico de 1 ml desechable y llene la jeringa con rifampicina fresca de 50 μg / mL en medio Hydra .
Nota: Burping una sola Hydra toma aproximadamente 0.05 mL a 0.1 mL de la solución. A 1 mL de syriNge es preferible ya que controlar la fuerza y el volumen de la solución que sale es más difícil con una jeringa de volumen más grande. - Bajo un microscopio de disección, sostenga el pedúnculo de la Hidra con pinzas de punta fina y toque en el centro del hipostótomo con la aguja. Si la boca no se abre, inserte fórceps en el hiposuero y abra la boca como se describe anteriormente para la alimentación.
Nota: Todos los pasos posteriores se realizan bajo un microscopio de disección. - Utilice la jeringa para enjuagar, muy suavemente, para evitar que el animal soplado, la cavidad gástrica con la solución de rifampicina 50 μ g / mL hasta que todos los desechos ha sido expulsado. La aguja no necesariamente tiene que ser insertada en la Hydra si el tamaño de la Hydra no lo permite. La aguja puede mantenerse cerca de la abertura de la boca y apuntar directamente hacia la boca.
- Utilizando una pipeta de Pasteur de vidrio, transferir Hydra burped a un plato con 50 frescos81; g / mL rifampicina en medio de Hydra .
4. Control de calidad mediante inmunohistoquímica
NOTA: El siguiente protocolo se adapta a partir de protocolos por Shenk, M. A, et al. 18 , y Böttger, A 19 . Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente (RT) a menos que se indique lo contrario. Un nutator se puede utilizar para las etapas de incubación y puede mejorar la calidad de tinción. Sin embargo, si la Hydra se enreda entre sí, todos los pasos también se pueden realizar sin.
- Preparar la solución de bloqueo: 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de DMSO en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). Guarde esta solución a 4 ° C hasta su uso (pasos 4.6 y 4.11). La solución se puede almacenar durante 1 - 2 días.
Nota: Todas las soluciones utilizadas en este protocolo deben ser recogidas correctamente como residuos peligrosos. - Relax Hydra en 200 μl de uretano al 2% en Hydra mEdium durante 1 minuto en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Utilice 5 Hydra por tubo para cada una de las 4 condiciones: sin nervio, sin tratamiento, sin tratamiento sin anticuerpo primario y sin tratamiento sin anticuerpo secundario.
Nota: No exceda de 1 min. El momento aquí es crítico ya que los animales estarán en mal estado después de pasar demasiado tiempo en uretano. - Retirar el uretano y fijar la Hidra en 200 μl de paraformaldehído (PFA) al 4% en medio Hydra durante 15 min.
- Lavar las muestras 3 veces con 1x PBS durante 10 min cada una.
Nota: Todos los lavados con PBS y PBSTx se hacen con 500 μl de solución. - Permeabilizar con 500 μl de Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 15 min.
- Eliminar el 0,5% de Triton X-100 y agregar 500 μl de la solución de bloqueo. Bloquear las muestras durante al menos 1 h.
- Diluir el anticuerpo anti-tirosina-tubulina 1: 200 en solución de bloqueo.
Nota: Esta concentración fue laTerminada experimentalmente. Si se detecta que la señal en los controles es demasiado débil, puede ser necesario aumentar la concentración. Si hay unión no específica, puede ser necesario disminuir la concentración. La preincubación del anticuerpo también puede ayudar a reducir la unión no específica. - Retire la solución de bloqueo de las muestras y añada 200 μl del anticuerpo primario a los controles sin tratar de Hydra sin nervio y controles sin tratamiento sin secundaria. Para los controles no tratados sin primario, sólo añadir 200 μ l de solución de bloqueo sin el anticuerpo.
- Incubar las muestras durante la noche (> 12 h) a 4 ° C.
Nota: Alternativamente, incubar 5 - 6 h a RT. - Eliminar el anticuerpo primario y lavar las muestras ampliamente con 0,3% de Triton X-100 en 1x PBS (PBSTx).
Nota: Guarde el anticuerpo primario y guárdelo a 4 ° C, ya que puede reutilizarse al menos 2 - 3 veces. - Diluir cabra anti-ratón hP secundario antibOdy 1: 500 en solución de bloqueo. Agregue 200 μl a la Hydra sin nervio, controles no tratados y controles sin tratamiento sin primaria. Para los controles no tratados sin secundaria, sólo añadir 200 μ l de solución de bloqueo sin el anticuerpo.
Nota: Alternativamente, puede usarse un anticuerpo secundario fluorescente, para lo cual no se necesitan los pasos 4.13 - 4.17. El uso de un secundario fluorescente ahorra tiempo y es generalmente adecuado, pero el secundario de hP proporciona mayor sensibilidad. La concentración de secundaria se determinó experimentalmente. Si se detecta que las señales en los controles son demasiado débiles, es posible que deba aumentar la concentración. Si hay unión no específica, puede ser necesario disminuir la concentración. - Incubar las muestras durante una noche a 4 ° C.
- Eliminar el anticuerpo secundario y lavar las muestras ampliamente con PBSTx.
- Preparar 1x PBT: 0,2% de albúmina de suero bovino (peso / volumen) y 0,05% de Tween20 en 1x PBS. Incubar las sAmples en 1x PBT durante 30 min.
- Eliminar el 1x PBT e incubar las muestras en 1: 1.000 NHS-fluoresceína y 1: 10.000 H 2 O 2 en 1x PBT durante 15 min en la oscuridad. A partir de este paso, mantener las muestras en la oscuridad, tanto como sea posible, ya que la señal fluorescente disminuirá a medida que se exponen a la luz.
Nota: La NHS-fluoresceína se preparó siguiendo un protocolo FISH detallado por King, RS y Newmark, PA 20 - Lavar las muestras 3 veces con PBSTx rápidamente, luego 2 veces durante 30 min.
- Dejar las muestras en PBSTx durante la noche a 4 ° C para continuar el lavado.
- Haga algunos lavados más con 1x PBSTx. Para visualizar los núcleos celulares, lleve a cabo los siguientes pasos opcionales para la contra-tinción de ADN usando dihidrocloruro (DAPI) 4 ', 6-diamindino-2-fenilindol. De lo contrario, las muestras pueden ser visualizadas ahora.
- Diluir el stock DAPI de 5 mg / mL a una concentración de trabajo de 1: 500 en PBSTx y añadir 200 μl a cada tubo. IncuLas muestras durante 30 min.
Precaución: DAPI es un carcinógeno conocido. Use PPE completo. - Retire el DAPI y lavar las muestras 2 - 3 veces con PBSTx antes de la formación de imágenes con microscopía de fluorescencia.
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Representative Results
Inmediatamente después del tratamiento inicial con 8 h de colchicina, todos los Hydra sobreviven. Algunas de estas Hidra sólo tendrán restos de tentáculos ( Figura 3 A ), mientras que otras habrán perdido completamente sus tentáculos ( Figura 3 B ). Durante los siguientes 1 ó 2 días, los tentáculos seguirán disminuyendo hasta que todos los Hydra hayan perdido sus tentáculos. Alrededor de una semana después del tratamiento, la Hidra mostrará signos de rebrote del tentáculo, con pequeños talones como tentáculos ( Figura 3 C ) antes de regenerar completamente sus tentáculos ( Figura 3 D ). De la Hydra original, alrededor de 50-60% eventualmente regenerar sus tentáculos entre 1-2 semanas después del tratamiento.
Siguiendo la sEn el último tratamiento, la recuperación de los animales es similar a la del primer tratamiento. Así, alrededor del 10% del número original de animales que entraron en ambos tratamientos se recuperaron y crecieron hasta un tamaño adecuado para la experimentación ( Figura 1 B ). Estas Hidra tienen tentáculos que parecen más delgados que los de animales no tratados, tienen tejido que es más transparente y parecen hinchados debido a la incapacidad de abrir la boca para aliviar la presión osmótica ( Figura 1A, 1B). Los animales que no se alimentan pueden sobrevivir durante unas pocas semanas, sin embargo, los animales no alimentados se reducirán en tamaño y serán cada vez más difíciles de alimentar.
La hidra que se recupera después del segundo tratamiento puede mantenerse indefinidamente. Estos animales son capaces de brotar, manteniendo así y creciendo la población. Además, la población puede ser cultivadaCortando estos animales y permitiendo que se regeneren 4 .
La inmunohistoquímica confirma la pérdida de neuronas en el hypostome después del segundo tratamiento con colchicina. La red nerviosa densa en el hypostome se puede visualizar usando un anticuerpo anti-tyrosine-tubulin 13 , 16 y demuestra las fibras distintas que irradian hacia fuera de la boca y los cuerpos celulares obvios ( Figura 4 A ). Estas fibras están ausentes en la hidra libre de nervios que se han producido por doble tratamiento con colchicina ( Figura 4 B ). Además, la co-tinción con DAPI revela un número reducido de núcleos celulares en la hidra libre de nervios en comparación con los controles no tratados debido a la pérdida de células del linaje celular intersticial como resultado de los tratamientos con colchicina4A, 4B ).
Figura 1 . Comparación de la hidra de Nerve libre y no tratada.
(A) Hidra no tratada. (B) Hidra libre de nervios 22 días después del segundo tratamiento con colchicina. Tenga en cuenta la columna del cuerpo hinchada y los tentáculos finos en el animal libre de nervios. Las barras graduadas son de 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Ejemplos de Hydra Deformado.
(A) Dos Hydra (B) Una hidra de forma extraña. (C) Una Hidra que se ha desinflado después de haber abierto su boca. Las barras graduadas son de 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Imágenes Representativas de Hydra Siguiendo el Primer Tratamiento de 8 h de Colchicina.
(A) Una hidra con tentáculos débiles inmediatamente después del tratamiento. (B) Una Hidra que ha perdido completamente sus tentáculos inmediatamente después del tratamiento. (C) Una Hidra que comienza a regenerar sus tentáculos 8 días después del tratamiento. (RE)Una Hidra que ha regenerado completamente sus tentáculos 13 días después del tratamiento. Las barras graduadas son de 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . La pérdida de células nerviosas en el hipostoma puede confirmarse mediante inmunohistoquímica.
(A) Hipóstoma de una hidra no tratada y (B) hipotestos de una hidra libre de nervio aproximadamente 2 semanas después del segundo tratamiento con colchicina, marcado con (i) anticuerpo anti-tirosina-tubulina y (ii) DAPI. (Iii) muestra la superposición. El * indica la ubicación de la boca. Se hicieron proyecciones de z máximas a partir de las pilas de fluorescencia confocal de disco giratorio tomadas con eXposiciones de 500 ms (GFP) y 15 ms (DAPI). El brillo y el contraste se ajustaron para mejorar la visibilidad. Las barras graduadas son de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células intersticiales de la hidra pueden eliminarse mediante un tratamiento con doble colchicina 3 , 4 . En los días siguientes al primer tratamiento, es crítico evitar el contacto entre Hydra individual para evitar la fusión de piezas de Hydra en Hydra deformado. Además, los animales que pueden comer sin ayuda después del primer tratamiento deben ser eliminados ya que el segundo tratamiento con colchicina puede no ser suficiente para eliminar las células intersticiales restantes de dichos animales. Para maximizar la tasa de supervivencia de la Hydra sin nervio después del segundo tratamiento con colchicina, los animales deben ser alimentados con tanta Artemia como sea posible después de la recuperación del primer tratamiento, con 1 a 2 días entre las alimentaciones para recuperarse y crecer. Cada tratamiento con colchicina hace que la hidra disminuya significativamente en tamaño a medida que se egestan las células, por lo que cuanto mayor sea la hidra antes de cada tratamiento,Eter las posibilidades de que la Hidra se recuperará a un tamaño que se puede alimentar y mantener.
Debido a la baja tasa de supervivencia de Hydra después de cada tratamiento, puede ser deseable comenzar con muchos Hydra . Sin embargo, debe tenerse precaución al iniciar el tratamiento en demasiados Hydra a la vez. Esto hará que la alimentación después del primer tratamiento sea difícil y extremadamente larga. Los animales alimentados bien después del primer tratamiento se recuperan a tamaños mayores y por lo tanto tienen una tasa de supervivencia más alta después del segundo tratamiento. Por lo tanto, puede ser más productivo comenzar con menos y centrarse en la alimentación mejor. Generalmente, comenzando con 50 - 100 animales es manejable para 1 - 2 personas. También es mejor comenzar con la Hydra más grande posible, ya que estos sobrevivirán mejor a los dos tratamientos.
El método de alimentación forzada y eructos Hydra que carecen de células nerviosas descritas aquí es más seguro, más simple y más tiempo-eficiente que los métodos descritos en los últimos 3 , 4 , 14 . El uso de fórceps y jeringas disponibles comercialmente elimina la necesidad de puntas de micropipeta tiradas a mano, que consumen mucho tiempo y son difíciles de fabricar. El uso de estas herramientas también evita la necesidad de pipeta boca. La alimentación forzada con fórceps puede ser difícil al principio, pero con suficiente tiempo y práctica, se vuelve bastante fácil y eficiente. Uno debe primero practicar la alimentación forzada y eructar Hydra normal para tener una idea de cuánta fuerza usar con las herramientas y cómo manipular a Hydra . Se probaron diversos fórceps y tamaños de agujas para encontrar las herramientas óptimas para la alimentación forzada y el eructo.
El uso de tinción de anticuerpos como se describe aquí es sólo adecuado para comprobar la ausencia de células nerviosas en el hipostótomo. Para asegurar que todas las células intersticiales han sido eliminadas, los animales pueden ser macerados yLos tipos de células presentes pueden ser examinados [ 15] .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por las discusiones sobre el protocolo original para la generación y mantenimiento de animales libres de nervios, la Sra. Rui Wang para ayudar con la adaptación de la jeringa y la aguja técnica, y Danielle Hagstrom y Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el RCSA y la subvención NSF CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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