Summary
Grâce à un double traitement avec de la colchicine, une toxine végétale qui tue des cellules en division, Hydra vulgaris sans nerf peut être générée. Ces Hydra ne peuvent pas se nourrir ou se passer par eux-mêmes. Cet article décrit une méthode améliorée pour le maintien à long terme d' Hydra vulgaris sans nerf en laboratoire.
Abstract
La lignée cellulaire interstitielle d' Hydra comprend des cellules souches multipotentes et leurs dérivés: cellules de glandes, nématocytes, cellules germinales et cellules nerveuses. Les cellules interstitielles peuvent être éliminées par deux traitements consécutifs avec de la colchicine, une toxine végétale qui tue les cellules en division, ce qui supprime le potentiel de renouvellement des cellules différenciées issues des cellules souches interstitielles. Cela permet la génération d' Hydra qui manque de cellules nerveuses. Un polype sans nerf ne peut pas ouvrir sa bouche pour nourrir, par exemple, ou réguler la pression osmotique. Ces animaux, cependant, peuvent survivre et être cultivés indéfiniment dans le laboratoire si régulièrement alimentés par force et burpe. Le manque de cellules nerveuses permet d'étudier le rôle du système nerveux dans la régulation du comportement et de la régénération des animaux. Les protocoles précédemment publiés pour l'entretien Hydra sans nerf nécessitent des techniques obsolètes telles que la pipetage à la bouche avec une micropipette tIps pour nourrir et nettoyer l' Hydra . Ici, un protocole amélioré pour la maintenance de l' hydre sans nerf est introduit. Des pinces à pointe fine sont utilisées pour forcer l'ouverture de la bouche et l'insertion d' Artemia fraîchement tuée. À la suite de l'alimentation forcée, la cavité corporelle de l'animal est rincée avec un moyen frais à l'aide d'une seringue et d'une aiguille hypodermique pour éliminer le matériau non digéré, désigné ici comme «éructement». Cette nouvelle méthode d'alimentation forcée et d'hydratation éructrice sans nerf à l'aide de pinces et de seringues élimine le besoin de pipeter à la bouche en utilisant des pointes à micropipettes tirées à la main. Cela rend le processus plus sûr et beaucoup plus efficace dans le temps. Pour s'assurer que les cellules nerveuses de l'hypostome ont été éliminées, une immunohistochimie utilisant une anti-tyrosine-tubuline est réalisée.
Introduction
Le système nerveux d' Hydra se compose d'un filet nerveux, avec des neurones associés aux deux couches de tissu épithélial 1 . Le filet nerveux est plus dense dans l'hypostome et le pédoncule et moins dense dans la colonne 2 du corps. Les cellules nerveuses proviennent de cellules souches interstitielles, qui sont des cellules souches multipotentes qui donnent naissance à des cellules sécrétoires, des nématocytes, des cellules germinales et des neurones 1 . Il est possible d'éliminer les cellules interstitielles d' Hydra vulgaris par traitement avec la colchicine 3 , 4 , une toxine végétale qui tue les cellules en division. Bien que la colchicine ait inhibé la polymérisation des microtubules dans d'autres organismes, une étude antérieure a montré que les microtubules sont présents dans Hydra tout au long du traitement, ce qui suggère que la colchicine n'agit pas dans Hydra 3 . Une autre stSuggère que la colchicine ne se lie pas efficacement à la tubuline dans certains organismes, y compris Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas et Schizosaccharomyces pombe, ce qui peut expliquer cette différence 5 . Le traitement par la colchicine induit la phagocytose des cellules interstitielles par les cellules épithéliales endodermiques 3 et permet ainsi la création d'animaux qui manquent de cellules nerveuses, de cellules de glandes et de nématocytes. Il n'est pas clair pourquoi les cellules interstitielles sont particulièrement sensibles au traitement par la colchicine. Étant donné que les cellules interstitielles post-mitotiques et la lignée interstitielle des cellules souches sont endommagées et phagocytées, Campbell a conclu que la colchicine ne touchait pas directement l'activité mitotique 3 . Notamment, le traitement contre la colchicine fonctionne bien chez Hydra vulgaris, mais il a également été démontré qu'il ne fonctionne pas aussi bien dans d'autres espèces, comme Hydra oligactis 6 . Hydra viridis sans nerf 7 . L' hydre sans nerf (également appelée parfois « Hydra épithéliale» 8 ) est donc un outil utile pour étudier les rôles de ces types de cellules spécialisées à partir de la lignée cellulaire interstitielle dans l'homéostasie et la régénération des tissus.
Hydra peut être le seul exemple connu d'un animal capable de vivre sans système nerveux. L' hydre sans nerf sert de modèle particulièrement utile pour disséquer le rôle du réseau nerveux dans la régulation de la régénération, de l'homéostasie et du comportement de l' Hydra . Par exemple, l'introduction de cellules interstitielles dans l' hydre sans nerf par greffage a permis de caractériser la différenciation des cellules nerveuses en tant que région spécifique 9 . En outre, parce que l' hydre sans nerf peut se régénérer, ilsPermettre l'étude de voies de régénération alternatives, indépendantes du système nerveux. Un tel exemple est la neurogénèse apicale et la formation de la tête, ce qui a démontré qu'elle dépend de la fonction cnox-2 dans le système nerveux dans l' hydre de type sauvage, mais semble être dispensable dans Hydra sans nerf, ce qui suggère qu'il peut y avoir un processus alternatif de régénération de la tête 10 .
L' hydre sans nerf a également été utilisée pour étudier l'expression des cellules épithéliales et la régulation des gènes neurogéniques et de neurotransmission après la perte de la neurogénèse 11 . L' hydre sans nerf ne présente pas de rafale de contraction spontanée 12 , ce qui indique que ces rafales sont régulées par le système nerveux. Cependant, l' hydre sans nerf se contracte en cas de pincement de la colonne du corps avec une pince, ce qui suggère que la contraction en réponse aux stimuli mécaniques est médiée par l'accouplementJumelles gap gap dans les cellules épithéliales, alors que le comportement contractile spontané est médié par couplage à travers des jonctions dans les cellules nerveuses 13 .
L' hydre sans nerf n'ouvre pas la bouche lorsqu'elle est présentée avec de la nourriture ou une glutathion réduite 3 , ce qui suggère que les neurones sensoriels sont nécessaires pour détecter la présence de nourriture et signaler la bouche à ouvrir. En outre, le filet nerveux semble jouer un rôle dans la détection de la pression osmotique, car les animaux sans nerf sont incapables de réguler de manière autonome leur pression hydrostatique interne par l'ouverture de la bouche, ce qui provoque leur apparence caractéristique ballon 3 , 4 ( figure 1B ). La régulation de la pression hydrostatique dans l' hydre sans nerf par une déflation manuelle fréquente a entraîné une perte de morphologie anormale dans l'hypostome et la colonne du corps. Cependant, la déflation chronique a entraîné une interférence avec la croissance, elOrganisation, développement et organisation tissulaire 8 .
Bien que l' Hydra sans nerf soit incapable de se nourrir et de se séparer seul, il est possible de les maintenir indéfiniment au laboratoire en forçant à forcer et à éduquer tous les animaux. Les publications antérieures ont décrit des méthodes d'alimentation forcée et d'éruction sans hydromes , mais ces protocoles impliquaient l'utilisation de conseils à micropipettes qui doivent être tirés à la main avec attention à la taille appropriée ainsi que l'utilisation d'un embout buccal relié à la pipette par un tube 14 . Ici, une méthode d'alimentation et d'éructage plus simple, plus sûre et plus efficace dans le temps est décrite.
De plus, des études antérieures ont consisté à vérifier l'absence de cellules nerveuses par la dissociation d'animaux fixes dans des cellules individuelles et l'examen de la morphologie cellulaire 3 , 4 , 15 . HAvant, l'immunohistochimie avec un anticorps monoclonal contre le carboxy-terminal terminal tyrosiné de l'alpha-tubuline a été utilisée comme méthode complémentaire pour la macération afin de vérifier l'épuisement des neurones dans l'hypostome 13,16. Des études antérieures ont montré que les neurones dans le pédoncule peuvent également être visualisés en utilisant cet anticorps 13 , mais ces neurones aussi bien que ceux dans la colonne du corps sont plus difficiles à distinguer. Bien que l'immunohistochimie soit suffisante pour confirmer l'absence de cellules nerveuses dans l'hypostome et ne nécessite pas d'expertise sur la morphologie du type cellulaire, elle ne peut pas être utilisée pour vérifier l'absence des cellules souches interstitielles et les autres dérivés de ces cellules. La dissociation et les études de morphologie cellulaire sont plus rigoureuses et peuvent donner un compte rendu quantitatif des nombres de chaque type de cellule restant à la suite de chaque étape du traitement.
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Protocol
1. Traitement double colchicine
- Faire une solution de 0,4% de colchicine (poids / volume) dans Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Attention: la colchicine est très toxique, mortelle si elle est avalée, peut causer des défauts génétiques et peut causer des lésions oculaires. Manipulez la poudre dans une hotte et utilisez un équipement de protection individuelle complet (EPI). - Incuber Hydra vulgaris (souche AEP utilisée ici) qui ont été privées pendant 24 h dans 0,4% de colchicine dans un rapport de 5 Hydra par ml de solution de colchicine dans une boîte de Petri pendant 8 h à température ambiante dans le noir.
Note: 5 Hydra / mL colchicine est une ligne directrice pour déterminer la quantité de solution à utiliser pour éviter le surpeuplement du plat avec Hydra . Utilisez le même volume de solution pour les nettoyages et les changements de solutions ultérieurs. - Retirer la solution de colchicine et remplacerAvec un milieu Hydra propre sans colchicine. Laver l' Hydra 5 fois par transfert en série avec une pipette Pasteur en verre dans un milieu Hydra propre avant de transférer à 50 μg / mL de rifampicine en milieu Hydra . Gardez l' Hydra dans un incubateur de 18 ° C.
Note: Un stock de rifampicine (1000 mg / ml) suffisant dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pendant 1 à 2 semaines de traitement peut être stocké à 4 ° C. Le montant exact peut être déterminé par le volume total de solution utilisé chaque jour. Par exemple, s'il y a 2 plats, chacun contenant 10 mL de solution qui doit être changé deux fois par jour, un total de 40 mL de solution sera utilisé en une journée, correspondant à 40 μL de 1000X par jour ou 560 μL Sur une période de deux semaines. Le stock est ensuite dilué 1: 1000 en milieu Hydra après utilisation.
Attention: le DMSO est un liquide combustible et pénètre facilement la peau, permettant d'autres produits chimiques dissous dans le corps. MainLe solvant dans une hotte aspirante et porter un PPE complet. Il est à noter que le DMSO gèle à 4 ° C - Changer le milieu Hydra contenant de la rifampicine deux fois par jour jusqu'à ce que l' Hydra cesse d'expulser les cellules dans le milieu, ce qui est généralement d'une semaine après le traitement. À ce stade, le support peut être changé une fois par jour. Au cours des jours qui suivent le traitement, l' Hydra perdra complètement ses tentacules. Évitez d'avoir l' Hydra en contact les uns avec les autres, car ils peuvent fusionner et entraîner une Hydra de forme étrange ( Figure 2 A ).
- Pour éviter tout contact, évitez de faire tourbillonner le plat dans un mouvement circulaire. Au lieu de cela, agitez doucement le plat dans les directions verticale et horizontale jusqu'à ce que l' Hydra soit écarté. Inspectez le plat en plaçant l' Hydra dans l'incubateur de 18 ° C et ajustez le cas échéant.
Remarque: pour les jours où le support est modifié deux fois, changez le supportUne fois le matin et encore l'après-midi / soir.
- Pour éviter tout contact, évitez de faire tourbillonner le plat dans un mouvement circulaire. Au lieu de cela, agitez doucement le plat dans les directions verticale et horizontale jusqu'à ce que l' Hydra soit écarté. Inspectez le plat en plaçant l' Hydra dans l'incubateur de 18 ° C et ajustez le cas échéant.
- Une fois que les tentacules commencent à se former, commencez à nourrir et à éduquer l' Hydra 3 à 4 fois par semaine (voir les sections 2 et 3). Environ 8 à 9 jours après le traitement par la colchicine, l' Hydra va recommencer ses tentacules.
Note: La repousse des tentatives varie selon les individus. Certains peuvent prendre plus de 8 à 9 jours avant de montrer des signes de croissance du tentacule. Ceux qui ne repoussent pas leurs tentacules ainsi que des animaux bizarrement façonnés ( Figure 2 B ) ou des animaux trop petits pour être nourris devraient être enlevés. Ces Hydra ne survivront probablement pas au deuxième traitement. L' hydre peut également se développer. Cependant, certains bourgeons peuvent encore avoir des cellules interstitielles et être en mesure de manger eux-mêmes.- Retirez tous les bourgeons qui peuvent manger sans assistance et détacher de l'animal parent. Identifiez ces animaux en ajoutant Artemia en direct à laAlimentant le plat et observant si les animaux attrapent et mangent eux-mêmes l' Artemia . 1 ou 2 Hydra peuvent également être en mesure de manger eux-mêmes. Ceux-ci devraient également être écartés.
Remarque: L' hydre sans nerf possède une morphologie caractéristique en ballon et des tentacules plus courts et plus minces que la normale (due à la perte de nématocytes) et peuvent donc facilement être distingués des animaux normaux ( figure 1 A, 1B ).
- Retirez tous les bourgeons qui peuvent manger sans assistance et détacher de l'animal parent. Identifiez ces animaux en ajoutant Artemia en direct à laAlimentant le plat et observant si les animaux attrapent et mangent eux-mêmes l' Artemia . 1 ou 2 Hydra peuvent également être en mesure de manger eux-mêmes. Ceux-ci devraient également être écartés.
- Trois semaines après le premier traitement par colchicine, répétez le traitement contre la colchicine (étapes 1.1 à 1.5). Un deuxième traitement par colchicine est nécessaire pour éliminer les cellules interstitielles et les cellules nerveuses restantes 3 .
2. Force-Feeding
- Ajoutez les kystes d' Artemia à un récipient en verre étroit et grand qui se rétrécit en bas. Remplir le récipient avec de l'eau d' Artemia (NaCl 6,72 M). EviterÉmettant 1 g de kystes pour 1 L d'eau pour obtenir un rendement supérieur en cas de hachurage.
- Couvrez le dessus du contenant avec du parafilm et insérez une pipette sérologique de 10 ml à travers le parafilm dans le récipient. Fournir une aération en attachant des tubes à une pompe à air d'aquarium et en installant le tube autour de la pipette. Assurez-vous que la pointe de la pipette atteint le fond du récipient et qu'aucun kystes n'est installé au bas. L' Artemia éclosera après 48 h.
Remarque: Il existe de nombreuses façons différentes d'éclore Artemia qui peut fonctionner aussi bien.
- Couvrez le dessus du contenant avec du parafilm et insérez une pipette sérologique de 10 ml à travers le parafilm dans le récipient. Fournir une aération en attachant des tubes à une pompe à air d'aquarium et en installant le tube autour de la pipette. Assurez-vous que la pointe de la pipette atteint le fond du récipient et qu'aucun kystes n'est installé au bas. L' Artemia éclosera après 48 h.
- Collez l' Artemia de l'eau d' Artemia dans un filet d' Artemia (disponible auprès des sociétés d'approvisionnement en aquarium) et lavez-les pendant environ 20 s dans de l'eau DI avant de les placer dans un plat avec Hydra moyen. La salinité de l'eau d' Artemia est trop élevée pour Hydra , donc l' Artemia doit être lavé avant d'être utilisé.
- Sous un microscope à dissection,Euthanasier l' Artemia en les pressant légèrement avec une paire de pinces fines. Évitez de presser assez fort pour expulser les entrailles, car cela collera à la pince et rend l'alimentation difficile. Presser légèrement l' Artemia avant de l'alimenter à Hydra aidera au processus de digestion 14 . Placez l' Artemia fraîchement tué près de l' Hydra dans le plat pour faciliter l'alimentation rapide.
Remarque: Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous un microscope de dissection. - Utilisez une paire de pinces pour maintenir l' Hydra par le pédoncule. Continuez à maintenir le pédoncule pendant le processus d'alimentation de l' Hydra . À l'aide d'une deuxième pince, pincer la colonne du corps afin de faire contracter Hydra .
- Tout en tenant les pointes de la deuxième pince ensemble, appuyez sur le centre de l'hypostome (la structure en forme de dôme à l'extrémité orale de l'animal). Cela provoque parfois une ouverture de la bouche. jeF la bouche ne s'ouvre pas en tapotant, creuse la bouche en insérant la pince au centre de l'hypostome, puis relâchez légèrement la pression sur les pointes de la pince. Cela devrait s'étendre sur l'ouverture de la bouche faite par la crevaison.
Remarque: L' Hydra peut dégonfler et s'effondrer lorsque la bouche est ouverte ( Figure 2 C ). Si cela se produit, l' Artemia peut encore être insérée dans l' Hydra . S'il est trop difficile de le faire, passez à la prochaine Hydra et revenez à l' Hydra d' origine quelque temps plus tard et réessayez. Les Hydra ont tendance à ne pas dégonfler autant pendant les ouvertures de bouche suivantes. - Prenez rapidement Artemia avec la pince et insérez-les dans la cavité gastrique de l' Hydra . Insérez autant d' Artemia que possible jusqu'à ce que la cavité gastrique soit pleine et plus Artemia ne puisse pas être insérée sans endommager l' Hydra , accidentÉlimine tous les Artemia à l' intérieur ou empêche la bouche de se fermer. En moyenne, c'est 5 à 6 Artemia , mais jusqu'à 12 ont été nourris aux plus grands animaux.
- Si la bouche commence à se fermer, serrer à nouveau avec la pince comme décrit ci-dessus; Cependant, il convient de prendre soin que n'importe quel Artemia déjà à l'intérieur de l'animal puisse commencer à sortir lorsque la bouche est rouverte.
- Si l' Hydra est trop petite pour un Artemia entier, couper l' Artemia à l' aide d'un scalpel et nourrir les morceaux plus petits de l' Hydra . Si l' Artemia ne reste pas à l'intérieur de l' Hydre , il peut être nécessaire d'appuyer sur la pince contre l' Artemia pour la garder à l'intérieur de l' Hydre jusqu'à ce que sa bouche se ferme.
- Transférer l' Hydra avec une pipette Pasteur de verre, soigneusement pour éviter les éructations accidentelles, dans un plat avec de la rifampicine fraîche de 50 μg / mL en milieu Hydra . Si un Artemia a été expulsé fRom le Hydra en transférant, réinsérez-le dans le nouveau plat.
Remarque: Une pipette en verre est utilisée pour transférer l' Hydra , car il a été constaté qu'Hydra s'accroche moins au verre par rapport au plastique. La longueur de la pipette n'a pas d'importance, mais l'utilisation de pipettes de 5 pouces peut être un peu plus facile.
3. Burping
- Nettoyer l' Hydra pour enlever le matériel non digéré à tout moment entre 8 et 20 h après l'alimentation.
- Attendre une aiguille hypodermique 30G avec de la poudre P320 ou un papier abrasif semblable jusqu'à ce que la pointe soit plate.
Note: Une aiguille hypodermique 27G fonctionnerait également, mais la plus petite pointe de la jauge supérieure est préférable. - Fixez l'aiguille à une seringue plastique jetable de 1 mL et remplissez la seringue avec de la rifampicine fraîche de 50 μg / mL dans du milieu Hydra .
Remarque: Le bourrage d'une Hydra unique prend environ 0,05 ml à 0,1 ml de solution. Un syri de 1 mLNge est préférable puisque le contrôle de la force et du volume de la solution sortant est plus difficile avec une seringue à volume plus grand. - Sous un microscope à dissection, tenir le pédoncule de l' Hydra avec une fine pointe pincée et frapper au centre de l'hypostome avec l'aiguille. Si la bouche ne s'ouvre pas, insérez une pince dans l'hypostome et ouvrez la bouche comme décrit ci-dessus pour l'alimentation.
Remarque: Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous un microscope de dissection. - Utilisez la seringue pour rincer très doucement pour éviter de souffler l'animal entier, la cavité gastrique avec la solution de rifampicine à 50 μg / mL jusqu'à ce que tous les débris aient été expulsés. L'aiguille n'a pas nécessairement besoin d'être insérée dans l' hydre si la taille de l' hydre ne l'autorise pas. L'aiguille peut être maintenue près de l'ouverture de la bouche et orientée directement vers la bouche.
- À l'aide d'une pipette Pasteur de verre, transférez l'hydra burpe à un plat avec 50 fraîches81; g / ml de rifampicine en milieu Hydra .
4. Contrôle de la qualité par immunohistochimie
REMARQUE: Le protocole suivant est adapté des protocoles par Shenk, M. A, et al. 18 , et Böttger, A 19 . Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante (RT) sauf indication contraire. Un nutator peut être utilisé pour les étapes d'incubation et peut améliorer la qualité de coloration. Cependant, si l' Hydra s'emmêle les uns avec les autres, toutes les étapes peuvent également être effectuées sans.
- Préparez la solution de blocage: 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de DMSO dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Conservez cette solution à 4 ° C jusqu'à l'utilisation (étapes 4.6 et 4.11). La solution peut être stockée pendant 1 à 2 jours.
Remarque: Toutes les solutions utilisées dans ce protocole doivent être correctement collectées en tant que déchets dangereux. - Relax Hydra dans 200 μL de 2% d'uréthane dans Hydra mEdium pendant 1 min dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,7 ml. Utilisez 5 Hydra par tube pour chacune des 4 conditions: sans nerf, non traité, non traité sans anticorps primaire et sans traitement sans anticorps secondaire.
Remarque: Ne pas dépasser 1 min. Le moment ici est critique car les animaux seront en mauvais état après avoir passé trop de temps dans l'uréthane. - Retirez l'uréthane et réparez l' Hydra dans 200 μL de paraformaldehyde à 4% (PFA) dans du milieu Hydra pendant 15 minutes.
- Lavez les échantillons 3 fois avec 1x PBS pendant 10 minutes chacun.
Remarque: Tous les lavages avec PBS et PBSTx sont réalisés avec 500 μL de solution. - Perméabiliser avec 500 μL de Triton X-100 à 0,5% dans du PBS pendant 15 min.
- Retirez le Triton X-100 à 0,5% et ajoutez 500 μL de la solution de blocage. Bloquer les échantillons pendant au moins 1 h.
- Diluer l'anticorps anti-tyrosine-tubuline 1: 200 dans la solution de blocage.
Note: Cette concentration était laTerminé expérimentalement. Si le signal dans les contrôles se révèle trop faible, la concentration devra être augmentée. S'il existe une liaison non spécifique, la concentration peut devoir diminuer. La pré-incubation de l'anticorps peut également aider à réduire la liaison non spécifique. - Retirez la solution de blocage des échantillons et ajoutez 200 μL de l'anticorps primaire à l' Hydra sans nerf, aux témoins non traités et aux témoins non traités sans secondaire. Pour les témoins non traités sans primaire, n'ajoutez que 200 μl de solution bloquant sans anticorps.
- Incuber les échantillons pendant une nuit (> 12 h) à 4 ° C.
Note: Alternativement, incuber 5 à 6 h à la température ambiante. - Retirez l'anticorps primaire et lavez les échantillons en profondeur avec 0,3% de Triton X-100 dans 1x PBS (PBSTx).
Remarque: Enregistrez l'anticorps primaire et conservez à 4 ° C, car il peut être réutilisé au moins 2 à 3 fois. - Diluer la chèvre anti-souris hP antibactérienne secondaireOdy 1: 500 en solution de blocage. Ajouter 200 μL à l' hydre sans nerf, aux témoins non traités et aux témoins non traités sans primaire. Pour les témoins non traités sans secondaire, n'ajoutez que 200 μL de solution bloquant sans anticorps.
Remarque: En variante, un anticorps secondaire fluorescent peut être utilisé, pour lequel les étapes 4.13 à 4.17 ne sont pas nécessaires. L'utilisation d'un secondaire fluorescent permet d'économiser du temps et est généralement adéquate, mais le secondaire hP fournit une sensibilité accrue. La concentration du secondaire a été déterminée expérimentalement. Si les signaux dans les contrôles se révèlent trop faibles, il faudra peut-être augmenter la concentration. S'il existe une liaison non spécifique, la concentration peut devoir diminuer. - Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C.
- Retirez l'anticorps secondaire et lavez les échantillons en profondeur avec du PBSTx.
- Préparer 1x PBT: 0,2% d'albumine de sérum bovin (poids / volume) et 0,05% de Tween20 dans 1x PBS. Incuber les sAmples en 1x PBT pendant 30 min.
- Retirez le 1x PBT et incubez les échantillons dans 1: 1 000 de NHS-fluorescéine et 1: 10 000 H 2 O 2 dans 1x PBT pendant 15 minutes dans l'obscurité. À partir de cette étape, garder les échantillons dans l'obscurité autant que possible, car le signal fluorescent diminue lorsqu'ils sont exposés à la lumière.
Note: La NHS-fluorescéine a été préparée à la suite d'un protocole FISH détaillé par King, RS et Newmark, PA 20 - Lavez les échantillons 3 fois avec PBSTx rapidement, puis 2 fois pendant 30 minutes.
- Laissez les échantillons dans PBSTx pendant une nuit à 4 ° C pour continuer à laver.
- Faites encore quelques lavages avec 1x PBSTx. Pour visualiser les noyaux cellulaires, effectuez les étapes facultatives suivantes pour le contre-colorant de l'ADN en utilisant du dichlorhydrate de 4 ', 6-diamindino-2-phénylindole (DAPI). Sinon, les échantillons peuvent être visualisés maintenant.
- Diluer 5 mg / mL de stock DAPI à une concentration de travail de 1: 500 dans PBSTx et ajouter 200 μL à chaque tube. IncuBattez les échantillons pendant 30 min.
Attention: DAPI est un cancérogène connu. Portez un EPI complet. - Retirez le DAPI et lavez les échantillons 2 à 3 fois avec PBSTx avant l'imagerie avec microscopie à fluorescence.
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Representative Results
Immédiatement après le traitement initial de 8 h de colchicine, tous les Hydra survivent. Certaines de ces Hydra ne contiennent que des talons de tentacule ( Figure 3 A ), tandis que d'autres auront complètement perdu leurs tentacules ( figure 3 B ). Au cours des 1 ou 2 jours suivants, les tentacules continueront à diminuer jusqu'à ce que tous les Hydra aient perdu leurs tentacules. Environ 1 semaine après le traitement, l' Hydra montrera des signes de repousse du tentacule, avec de petits talons comme des tentacules ( Figure 3 C ) avant de régénérer complètement leurs tentacules ( Figure 3 D ). De l' Hydra originale, environ 50-60% éventuellement régénérer leurs tentacules entre 1-2 semaines après le traitement.
Suite à la sLe traitement économique, la récupération des animaux est similaire à celle du premier traitement. Ainsi, environ 10% du nombre initial d'animaux qui ont subi les deux traitements se rétablissent et se développent jusqu'à une taille appropriée pour l'expérimentation ( figure 1 B ). Ces Hydra ont des tentacules qui semblent plus minces que celles des animaux non traités, ont des tissus plus transparents et semblent gonflés en raison de leur incapacité à ouvrir leur bouche afin de soulager la pression osmotique ( Figure 1 A , 1B). Tous les animaux qui ne sont pas nourris peuvent survivre pendant quelques semaines, cependant, les animaux non nourris réduiront leur taille et deviennent de plus en plus difficiles à nourrir.
Hydra qui récupère après le deuxième traitement peut être maintenue indéfiniment. Ces animaux sont capables de bourrer, soutenant et augmentant ainsi la population. En outre, la population peut être cultivéeEn coupant ces animaux et en leur permettant de se régénérer 4 .
L'immunohistochimie confirme la perte de neurones dans l'hypostome suite au deuxième traitement par colchicine. Le net nerveux dense dans l'hypostome peut être visualisé en utilisant un anticorps anti-tyrosine-tubuline 13 , 16 et montre des fibres distinctes rayonnant vers l'extérieur de la bouche et des corps cellulaires évidents ( figure 4 A ). Ces fibres sont absentes dans Hydra sans nerf qui ont été produites par double traitement avec de la colchicine ( figure 4 B ). En outre, la co-coloration avec DAPI révèle un nombre réduit de noyaux cellulaires dans l' Hydra sans nerf par rapport aux témoins non traités en raison de la perte de cellules de la lignée cellulaire interstitielle à la suite des traitements de la colchicine ( Figure4 A, 4B ).
Figure 1 . Comparaison de l' hydre sans nerf et non traitée.
(A) Hydra non traitée. (B) Hydra sans nerf 22 jours après le deuxième traitement par colchicine. Notez la colonne de corps enflée et les tentacules minces dans l'animal sans nerf. Les barres d'échelle sont de 500 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . Exemples d' Hydra déformée.
(A) Deux Hydra (B) Hydra à la forme étrange. (C) Une Hydra qui s'est dégonflée après avoir ouvert sa bouche. Les barres d'échelle sont de 400 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 . Images représentatives d' Hydra suite au premier traitement de colchicine de 8 h.
(A) Une Hydra avec des tentacules stupides immédiatement après le traitement. (B) Une Hydra qui a complètement perdu ses tentacules immédiatement après le traitement. (C) Une Hydra qui commence à repousser ses tentacules 8 jours après le traitement. (RÉ)Une Hydra qui a complètement repris ses tentacules 13 jours après le traitement. Les barres d'échelle sont de 400 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 . La perte de cellules nerveuses dans l'hypostome peut être confirmée par l'immunohistochimie.
(A) L'hypostome d'un hydra hybride et (B) non traités d'une Hydra sans nerf environ 2 semaines après le deuxième traitement par colchicine, marqué avec (i) un anticorps anti-tyrosine-tubuline et (ii) DAPI. (Iii) montre la superposition. Le * indique l'emplacement de la bouche. Des projections z maximales ont été réalisées à partir de piles à fluorescence confocale à disque tournant prises avec eXposures de 500 ms (GFP) et 15 ms (DAPI). La luminosité et le contraste ont été ajustés pour améliorer la visibilité. Les barres d'échelle sont de 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les cellules interstitielles Hydra peuvent être éliminées par un double traitement par colchicine 3 , 4 . Dans les jours qui suivent le premier traitement, il est essentiel d'éviter tout contact entre Hydra individuel afin d'éviter la fusion des pièces d' Hydra en Hydra déformée. En outre, les animaux qui peuvent manger sans assistance après le premier traitement doivent être éliminés car le deuxième traitement par colchicine peut ne pas être suffisant pour éliminer les cellules interstitielles restantes de ces animaux. Pour maximiser le taux de survie de l' hydre sans nerf après le deuxième traitement par colchicine, les animaux devraient être nourris autant d' Artemia que possible après la récupération du premier traitement, avec 1 à 2 jours entre les repas pour se rétablir et se développer. Chaque traitement par colchicine provoque une diminution significative de la Hydra à mesure que les cellules sont émergées, de sorte que plus l' Hydra est avant chaque traitement, plusIl est probable que l' Hydra se rétablira à une taille qui peut être alimentée et entretenue.
En raison du faible taux de survie d' Hydra après chaque traitement, il peut être souhaitable de commencer par beaucoup d' Hydra . Cependant, il faut prendre soin de commencer le traitement sur trop d' Hydra à la fois. Cela rendra l'alimentation après le premier traitement difficile et extrêmement consommatrice de temps. Les animaux nourris bien après le premier traitement se sont rétablis à des tailles plus importantes et ont donc un taux de survie plus élevé après le deuxième traitement. Ainsi, il peut être plus productif de commencer avec moins et de se concentrer davantage sur l'alimentation. Généralement, à partir de 50 à 100 animaux, il est gérable pour 1 à 2 personnes. Il est également préférable de commencer avec le plus grand Hydra possible, car ceux-ci survivront mieux aux deux traitements.
La méthode d'alimentation forcée et d'éructement hydra qui manque de cellules nerveuses décrites ici est plus sûre, plus simple et plus de temps- efficace que les méthodes décrites au cours des 3 , 4 , 14 derniers. L'utilisation de pinces et de seringues disponibles dans le commerce élimine le besoin de pointes à micropipettes tirées à la main, qui sont longues et difficiles à réaliser. L'utilisation de ces outils évite également la nécessité de pipettes à la bouche. L'alimentation forcée à l'aide de pinces peut être difficile au début, mais suffisamment de temps et de pratique, elle devient assez facile et efficace. Il faut d'abord pratiquer l'alimentation forcée et l'excitation d' Hydra normale pour avoir une idée de la force à utiliser avec les outils et la façon de manipuler Hydra . Divers pinceaux et tailles d'aiguilles ont été testés pour trouver les outils idéaux pour l'alimentation forcée et l'éructement.
L'utilisation de la coloration des anticorps comme décrit ici n'est suffisante que pour vérifier l'absence de cellules nerveuses dans l'hypostome. Pour s'assurer que toutes les cellules interstitielles ont été éliminées, les animaux peuvent être macérés etLes types de cellules présentes peuvent être examinés 15 .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Dick Campbell (UC Irvine) pour des discussions sur le protocole original pour la génération et le maintien d'animaux sans nerf, Mme Rui Wang pour aider à adapter la seringue et la technique de l'aiguille, et Mme Danielle Hagstrom et le Dr Rob Steele (UC Irvine) pour les commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la subvention RCSA et NSF CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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