Summary
Hier presenteren we een aanpassing van de passieve duidelijkheid en 3D reconstructie methode voor visualisatie van de ovariële therapieën en folliculaire haarvaten in de eierstokken intact muis.
Abstract
Het vruchtbeginsel is het belangrijkste orgaan van het vrouwelijke voortplantingsstelsel en is essentieel voor de productie van de vrouwelijke gameten en voor de controle van het endocriene systeem, maar de complexe structurele relaties en driedimensionale (3D) therapieën platforms van de eierstok zijn niet goed beschreven. Om te visualiseren de 3D verbindingen en de architectuur van de bloedvaten in de intact eierstok, is de eerste belangrijke stap om de eierstok optisch duidelijk. Ter voorkoming van weefsel krimp, gebruiken we de hydrogel fixatie gebaseerde passieve duidelijkheid (duidelijk lipide-uitgewisseld Acrylamide-gekruist Rigid Imaging / immunokleuring/In situ-hybridisatie-compatibele weefsel Hydrogel) protocol van de methode om te wissen van een intact eierstok . Immunokleuring, geavanceerde multiphoton confocale microscopie en 3D-beeld-reconstructies werden vervolgens gebruikt voor de visualisatie van ovariële vaartuigen en folliculaire haarvaten. Met behulp van deze aanpak, we toonden een significante positieve correlatie (P < 0.01) tussen de lengte van de folliculaire haarvaten en het volume van de folliculaire muur.
Introduction
De follikel is de fundamentele structurele en functionele eenheid van de eierstok en de ontwikkeling ervan is sterk gerelateerd aan de therapieën in de eierstok. Bloedvaten, voeding en hormonen aan de follikels leveren en dus spelen een belangrijke rol in de groei en de rijping van de follikels1.
Een combinatie van technologieën, met inbegrip van bloedvat selectieve markeringen, transgene muismodellen, en farmaceutische ontwikkeling, is onze kennis over ovariële vasculaire netwerken, angiogenese, en de functie van bloedvaten in gestegen folliculogenese. Het vruchtbeginsel is bekend als een actieve orgel omdat het hervormt verschillende weefsels en vasculaire netwerken tijdens folliculogenese en ovulatie. Dergelijke actieve remodelleren in de omvang en de structuur van schepen is vereist voor de biologische functie van de ontwikkeling en het werven van follikels.
Traditionele histologische en histomorphometric methodes gebruikend ovariële secties en immunolabeling van de bloedvaten zijn beperkt tot tweedimensionale (2D) afbeeldingen,2. Met de ontwikkeling van driedimensionale (3D) reconstructie technologieën, kunnen 2D beelden van weefsel segmenten overlappen zodat een 3D-structuur, maar deze methode heeft nog steeds enkele beperkingen — afdelen van het weefsel kan vernietigen de microstructuren, sommige delen van de weefsel ontbreken vaak, en belangrijke arbeid is betrokken bij het maken van 3D-reconstructies van de beelden verkregen uit segmenten. Geheel-weefsel 3D-beeldbewerking met confocale microscopie kan veel van deze beperkingen overwinnen, maar deze methoden zijn beperkt tot de evaluatie van de angiogenese in het embryonale eierstok3. Met behulp van hele weefsel clearing methoden zoals duidelijkheid4 kan verhogen het gevisualiseerde volume zodat deze problemen in de postnatale en volwassen eierstokken en dergelijke methoden bieden optische Goedkeuringvande het ovarium zonder eventuele structurele vervormingen. Beeldvorming van de 3D-architectuur van de eierstokken intact biedt een nauwkeurige afbeelding database voor analysesoftware van de afbeelding, zoals het Imaris softwarepakket gebruikt in dit werk.
Verbouwing van het ovarium tijdens volwassenheid is onderdeel van een dynamische fysiologische systeem, en dit maakt het ovarium een uitstekend model voor onderzoek naar de regulering van angiogenese. Evaluatie van de rol van ovariële bloedvaten in pathologische omstandigheden van het vrouwelijke reproductieve systeem zoals polycysteus ovarium syndroom of ovariële kanker kan bovendien worden bestudeerd door hele eierstokweefsel imaging. De ontwikkeling van de passieve duidelijkheid-methode en het gebruik van de software van de analyse van de geavanceerde beeld hebben gedetailleerde ruimtelijke informatie verstrekt over de relaties tussen de bloedvaten en ovariële structuren zoals follikels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dierlijke onderwerpen volgde de richtsnoeren van de ethische commissie van het dier aan Shanghai Medical College, Fudan Universiteit (erkenningsnummer 20160225-013).
1. bereiding van de transparante muis eierstok
-
Bereiding van de oplossingen
- Bereid met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-oplossing (1 M, pH 7,6) met 0,1% Triton X-100 (PBST). Om 1 L van 10 x PBS stockoplossing, meng 87 g NaCl, 3.1 g van NaH2PO4 · 2H2O en 28.7 g nb2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L en roer ~ 2 h. aanpassen op een pH van 7,4 met 1 N NaOH toevoegen en bewaren bij kamertemperatuur. Verdunnen van deze stamoplossing 10 x 1/10 met behulp van dH2O en breng 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Bereid de hydrogel oplossing (pH 7.5) door mengingen 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) oplossing, 4% (wt/vol) acrylamide, 0.05% (wt/vol) bisacrylamide en 0,25% (wt/vol) VA-044 initiatiefnemer in tweemaal gedestilleerd water op het ijs.
- Bereid de clearing-oplossing (pH 8,5) door het mengen van 200 mM natriumboraat buffer met 4% (wt/vol) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in tweemaal gedestilleerd water.
-
Transcardial perfusie en eierstok voorbereiding
- Houd alle oplossingen op het ijs tijdens alle procedures.
- Anesthetize volwassen vrouwelijke wild type C57BL/6 muis met een intraperitoneale injectie pentobarbital (0.35 mg/kg) oplossing. Zodra het toont geen teen-snuifje reactie, is de muis goed verdoofd.
- Gebruik plakband om te herstellen van de muis met de ledematen uitgestrekt op een vlakke schuim bord.
- Bloot het hart door een sneetje op de xiphoid-proces door middel van de borst, huid en botten met een schaar.
- Maak een incisie in de juiste atrium van het dier, en dan perfuse het linkerventrikel met 20 mL ijskoud 1 x PBS op 10 mL/min.
- Perfuse van het dier met ten minste 20 mL hydrogel oplossing op 10 mL/min.
- De huid over de buik langs de lijn van medioventral met een schaar, die de hele enterocoelia bloot, incise en de ingewanden te verwijderen. Het verzamelen van de eierstokken, alsmede de baarmoeder te handhaven van de integriteit van ovariële morfologie.
- Het verwijderen van het vetweefsel rond de eierstok onder een microscoop.
-
Ontgassing
- Plaats de eierstokken in 10 mL hydrogel oplossing bij 4 ° C voor fixatie voor 3 dagen.
- Breng de eierstok in een tube van 5 mL en vul de buis met hydrogel oplossing. Parafilm rekken over de bovenkant van de buis en vervolgens wikkel parafilm rond de hals van de buis.
Let op: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de parafilm en de hydrogel-oplossing. - Plaats de buis op een shaker in de incubator bij 37 ° C gedurende ten hoogste 3 h om de hydrogel te polymeriseren.
- Verwijderen van de eierstok uit de gel met behulp van een spatel en verwijder voorzichtig de overtollige gel van rond de eierstok door papieren zakdoekje. Wassen van de eierstok viermaal met 1 x PBS.
-
Passieve clearing
- Het onderdompelen van de eierstok 10 ml van de oplossing van de clearing. Voorzichtig schudden bij 80 omwentelingen per minuut bij 37 ° C om de clearing-proces te starten.
- In de eerste week was de oplossing elke 3 dagen wijzigen. Na een week, de clearing-oplossing te vernieuwen zodra een week tot de eierstok duidelijk wordt. Dit proces duurt meestal ongeveer 2-3 weken.
Opmerking: De eierstok immunostained rechtstreeks kan worden of kan worden opgeslagen in natriumazide (0,02%) in PBS bij 4 ° C voor enkele weken immunokleuring.
2. immunokleuring
- De eierstok tweemaal in PBST wassen op de dag 1 bij 37 ° C op een shaker.
- Incubeer de eierstok op een shaker in primaire antilichamen/PBST oplossing (tabel 1) op dag 2-3 bij 37 ° C. Bij de werkzaamheden hier gepresenteerd, de primaire antilichamen werden bloedplaatjes-endothelial cel adhesie molecuul 1 (CD31) en tyrosine hydroxylase verdund op 1:10 en 1:50 in PBST, respectievelijk.
Let op: Als twee of meer soorten primair antilichaam worden gebruikt, zorg ervoor dat er verschillende dierlijke bronnen. - Wassen van de primaire antilichamen met PBST buffer bij 37 ° C op dag 4 op een shaker.
- Incubeer de eierstok met de gewenste secundaire antilichamen in PBST op dag 5-6 bij 37 ° C op een shaker. In het werk hier gepresenteerd, waren de secundaire antilichamen Alexa bloem 488 voor tyrosine hydroxylase en Alexa bloem 594 voor CD31 verdund bij 1:50 in PBST.
- Wassen van de secundaire antilichamen met PBST buffer bij 37 ° C op dag 7 op een shaker.
- Breng het weefsel in de passende oplossing brekingsindex voor brekingsindex homogenisering op dag 8. Zet het weefsel op een papier met rasterlijnen zijn visuele helderheid controleren door te controleren of de rasterlijnen kunnen worden gezien. Zodra het weefsel volledig is opgehelderd, kan het beeld worden.
- Maak een stopverf cilinder die kon alleen omringt het weefsel, en vervolgens gestalte in de vorm van een hoefijzer krijgt en druk op de buitenste rand strak op een glasplaatje zodat een verzegelde ruimte. De hoogte van de stopverf moet worden een beetje groter dan het vruchtbeginsel.
- Plaats van de geklaarde eierstok zorgvuldig in het midden van de stopverf en voeg brekingsindex bijpassende oplossing. Zet een glazen-bodem schotel over de stopverf strak en gebruik putty de schotel vast te stellen.
3. confocale microscopie
- Kies in het deelvenster "Ni-E" voor beeldbewerking met een confocal microscoop, de lens (in dit geval water onderdompeling 25 X 2 mm-WD, objectief, 1.1-nb) met de juiste afstand van de werken (in dit geval 2.0 mm).
-
Selecteer in het deelvenster "Overname", het aantal kanalen. Hier, drie kanalen gebruiken.
- Gebruik eerst het tabblad "oog poort" en de XY controller joystick om het weefsel naar het midden van het veld door te controleren door de Microscoop oculairs.
- Na het uitschakelen van de sluiter licht, klik op de "live" tab bijstellen "laser", "HV (winst)", en "offset" voor elk kanaal afzonderlijk. Hogere macht van de laser en HV kan leiden tot hogere signalen, en hogere verschuiving de achtergrondgeluiden kan verminderen.
- Selecteer de juiste "Scan maat" en "Count". Gebruik een scan-formaat van 1024 x 1024 µm2 en een telling van 4 tot en met 8.
-
Na het instellen van de kwaliteit van de afbeelding voor het definiëren van de diepte van het weefsel in het deelvenster 'Z intensiteit correction' en na het vinden van de lens op de bovenste laag van de eierstok (in het midden van het weefsel) en de overname voor de bovenste laag aan te passen, klikt u op de "plus" knop om te definiëren van de bovenste laag.
- De lens omlaag en stel de juiste HV en laser kracht voor de onderkant van het weefsel en de laaggegevens van de laagste in de Z-intensiteit correctie tabel toevoegen. Klik op "Naar ND" voor het synchroniseren van de instelling met de "ND verwerving" paneel.
-
In de "ND overname" paneel, eerste reeks het aantal scannen stappen. Vink dan, de tabbladen "Z" en "Grote afbeelding".
- Ga naar het "Scan grote afbeelding" venster om te bepalen van de grootte van het veld naar de rand van het weefsel met de hulp van weefsel visualisatie via de oculairs. Ga terug naar het paneel "ND verwerving" om de grootte van het scangebied ("velden") en kies de overlap tussen 10% en 15%.
- Klik op de "Run Z correctie", niet "Run nu", automatisch de juiste HV, laser macht en offset instellen voor elke laag, en wachten op de afbeelding om te verwerken.
4. 3D reconstructie van individuele follikels en hun Vasculatures
- Gebruik eerst ImageJ5 om de oorspronkelijke NIS-bestand te openen. Klik op de knop 'Afbeelding' en kies de "kleur" en de "Split-kanalen". Dan, klik op "Bestand" en afzonderlijk de kanalen opslaan als TIFF-bestand-serie met behulp van de optie "Image Sequences" in "Opslaan als".
- Gebruik Imaris om te openen een van de TIFF-bestand-serie. Klik op de knop "Bewerken" en kies "Add kanalen" toe te voegen van de rest van de kanalen. De naam en de kleur van het kanaal kunnen worden gewijzigd in de tabbladen "Display aanpassing". De dikte van het weefsel moet mogelijk worden gecorrigeerd in het deelvenster "Afbeeldingseigenschappen" in de drop-down lijst onder "Bewerken".
- Voor de 3D bijsnijden van de laatste beelden en verwijdering van overtollige delen, klik op de knop "Bewerken" en kies "Gewas 3D". De grootte van het veld kan worden aangepast door de rand te slepen.
-
Als u wilt reconstrueren de signalen van het schip met de filamenten algoritme in het deelvenster Surpass, klikt de "Door samensmelting van filamenten" Maak een nieuwe gloeidraad en klik op volgende.
- Om de grootste en de dunste diameter, ga naar het paneel "Slice" en vind het schip tracering. De afstand wordt automatisch getoond in het deelvenster "Maatregel" door het selecteren van twee punten op de maximale breedte van het schip.
- Ga terug naar het paneel "Surpass" ingang van de gemeten breedte en klik op volgende.
- De begin- en zaad punt drempel aanpassen. Kies in het deelvenster "Camera" "Selecteren". Als sommige van de automatisch geproduceerde bollen worden verwijderd moeten, houdt u SHIFT ingedrukt en klik op het punt. Door het kiezen van "Navigeren" en de muis bewegen, kan de structuur worden gedraaid om ervoor te zorgen dat alle juiste punten hebben overgenomen, en klik op volgende.
- Kies de hoogste drempel voor het lokale contrast en klik op volgende. Geen Selecteer "Detect stekels" en blijven de wederopbouw van de cilinder bloedvat af te ronden. De kleur kan worden bewerkt door te klikken op het tabblad "Kleur". De statistische gegevens kan worden gewonnen in de "Statistiek"-paneel van de gereconstrueerde gloeidraad. Overtollige onderdelen kunnen worden verwijderd in het deelvenster 'Bewerken'.
Opmerking: Andere algoritmen kunnen worden gebruikt voor het meten van de omvang van de totale follikels of folliculaire muren. In het werk hier gepresenteerd, werden de eicellen gekenmerkt door de autofluorescence van beide secundaire antilichamen. Vanwege de grote hoeveelheid gegevens, werd de server van een werkstation gebruikt voor de data-analyse.
5. statistische analyse
Opmerking: Analyse van de afbeeldingsgegevens worden gepresenteerd als middel van ± standaardfouten.
- Uitvoeren van vergelijkingen tussen de follikels met behulp van onafhankelijke sample t-test en Pearson's correlatie test gebruiken om te vergelijken correlatiecoëfficiënten van folliculaire muur en capillaire lengte. Stelt een waarde van P < 0.05 als de limiet voor statistische significantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij de passieve duidelijkheid methode aangepast in een snelle en eenvoudige methode voor passieve eierstok schakelen terwijl het behoud van de folliculaire en vasculaire architectuur en het verkrijgen van de hoogste fluorescent signaal van gelabelde markers van vaartuigen en follikels. De 3D-architectuur van de folliculaire therapieën werd bepaald door immunokleuring voor CD31, een marker voor endotheliale cellen6. CD31 vlekken in de eierstokken van volwassen muizen werd opgespoord met behulp van het algoritme van de gloeidraad en toonde van onderlinge relaties tussen folliculaire haarvaten en primaire en secundaire follikels (Figuur 1).
De transformatie van de plek en de oppervlakte algoritmen werden gebruikt om de tyrosine hydroxylase-immunostained eicellen en granulosa en thecal lagen te detecteren en te berekenen van het totale volume van de follikels7,8. Vanwege de compressie van de follikels, waren sommige delen van bijgesneden follikels semi-handmatig geïdentificeerd. Na Spot transformatie van de individuele folliculaire volume en eicellen en oppervlakte wederopbouw van de folliculaire muur lagen en wederopbouw van de gloeidraad van de vaartuigen, duidelijke relaties tussen individuele folliculaire vasculatures en de andere gemeten indicatoren, met name granulosa en thecal laag volumes, werden waargenomen (Figuur 2).
Figuur 1 : Hoge-resolutie beeldvorming van een eierstok intact volwassen muis na verrekening met het aangepast protocol voor passieve duidelijkheid. (A-B) Secties en XYZ groot-scan acquisitie. Drie dimensionale (3D) bijgesneden secundaire (C) en primaire (D) follikels (bovenste rij) en 3D gereconstrueerd haarvaten oöcyten en granulosa/thecal cellen van de dezelfde follikel (onderste rij) worden weergegeven, zoals aangegeven door de gloeidraad, oppervlakte, en Ter plaatse transformatie algoritmen. Schaal bars = 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Vergelijkende indexcijfers van de relaties tussen primaire en secundaire ovariële follikels en hun vasculatures. Het volume van de oöcyt (A) werd gewonnen na 3D-reconstructies van folliculaire volume en eicellen in individuele follikels zoals bepaald door de plek transformatie algoritme, en het volume van de folliculaire muur (B) werd bepaald door het oppervlak algoritme en de haarvaten werden opgespoord door de gloeidraad algoritme. Het folliculaire volume (C), van de oöcyt volume/capillair lengte verhouding (D), van de folliculaire muur volume/capillair lengte verhouding (E), van de folliculaire volume/capillair lengte verhouding (F), van de capillaire lengte (H), en de correlatie van capillaire lengte en folliculaire muur volume (G) werden berekend aan de hand van de juiste tools in het softwarepakket. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfouten van de middelen. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Drie-dimensionale reconstructie van de haarvaten in secundaire follikels van de muis ovarium. Dit onthult een holle ruimte boven de oöcyt-kant van de follikels (witte vierkanten Toon de grenzen van de ruimte). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de huidige studie presenteren we 3D-imaging om te evalueren van de relaties tussen de haarvaten en individuele groeiende follikels. In onze vorige werk met behulp van de dezelfde protocol 9, studeerde we de rol van grote therapieën, interacties tussen follikels en de locatie van de follikels in de eierstokken intact muis. De passieve houding van de duidelijkheid ons toegestaan om te studeren van micro - en macro-vasculatures, folliculogenese en de relaties tussen de corpora lutea en de follikels alsmede over het reconstrueren van de ovariële architectuur op verschillende ontwikkelingsstadia.
3D beeld om gegevens te verkrijgen van intact weefsels, is de clearing-proces de eerste belangrijke stap. Er zijn twee voornaamste strategieën — uitdroging en hydrofiele reagens gebaseerde methoden, zoals passieve duidelijkheid10. Omdat uitdroging methoden vaak tot een afname van fluorescerende signalen leidt en vaak giftige organische oplossing afval produceren, hebben wij onze aandacht gericht op het vereenvoudigen van enkele stappen van de passieve duidelijkheid methode voor gebruik met verschillende weefseltypes (HLA).
De eerste kritische procedure in het proces van clearing is de transcardial perfusie. Tijdens de perfusie speelt hart pompen een belangrijke rol in het gehele lichaam verkeer van PBS en hydrogel oplossing, die het bloed te verlagen van de achtergrond-fluorescentie kan spoelen. Dus, de perfusie-operatie moet nauwkeurig worden uitgevoerd en snel om te voorkomen dat de vroegtijdige dood van het dier voordat de hydrogel is volledig verspreid over het dier. Alle actoren moeten worden bewaard op het ijs tijdens het hele experiment, zoals vermeld door Liang et al. 11, of ze zullen beginnen te polymeriseren voordat de perfusie voltooid is. De volgende belangrijke stap is het verwijderen van de hydrogel, en het is nodig om te verwijderen als veel overtollige gel mogelijk, omdat het antilichamen zal behouden. Zodra het weefsel is uitgeschakeld, moet het worden verwijderd uit de clearing mailoplossing en opgeslagen in PBS bij 4 ° C, omdat te veel tijd in de clearing-oplossing zal leiden tot te veel eiwit verloren gaan. In de beeldvorming van de confocal microscopie, moeten de Z-instellingen altijd zijn ingesteld vóór het bereik X-Y. Als de X-Y-bereik is eerste vastgelegd, worden niet de Z-instellingen gesynchroniseerd naar het hele veld van de X-Y.
Passieve duidelijkheid voor het eerst werd geïntroduceerd door Yang et al. 12 in hun protocol, ze presteerde niet de perfusie-stap en in plaats daarvan ontgast met stikstof. Bovendien hun clearing oplossing bevatte geen bisacrylamide in de hydrogel oplossing, vroeger 8% SDS in de clearing-oplossing en zij velgen voor brekingsindex bijpassende media gebruikt. Deze methode werd later verbeterd door verhoging van de SDS concentratie13, de perfusie stap en de stikstofvrije ontgassen procedure14toe te voegen en het combineren van de methode met andere methoden, clearing zoals PARS-mPACT15. We hebben het protocol hier, verder ontwikkeld door te combineren transcardial perfusie en stikstofvrije ontgassing, de SDS in de clearing oplossing tot 4% afneemt, en met behulp van FocusClear als de brekingsindex bijpassende media, die betere kwaliteit biedt microscopie beelden.
Na passieve duidelijkheid, kan multiphoton confocal microscopie en beeld-analyse worden uitgevoerd om te verkrijgen van de intact 3D architectuur van de ovariële folliculaire therapieën. Dit protocol transformeert een niet-licht-permeabele intact eierstok in de vorm van een optisch transparante hydrogel-gekruist nanoporeuze die geschikt is voor penetratie door macromoleculen zoals antilichamen16. In tegenstelling tot de klassieke 2D sectionele histologische analyses kunt passieve duidelijkheid en kleuring met specifieke markers het 3D in kaart brengen van de relaties tussen de haarvaten en individuele groeiende follikels.
In volwassen weefsel optreedt actieve vasculaire remodeling en angiogenese voornamelijk tijdens ziekteprocessen zoals wondgenezing, fractuur reparatie tumor en metastase formaties, retinopathies, fibroses en reumatoïde artritis17. Cyclische veranderingen tijdens folliculogenese betekenen echter een unieke capaciteit voor het remodelleren van therapieën. Na de vorming van het antrum in secundaire follikels, folliculaire vloeistof gevuld en omringt de oöcyt, dat een geschikte communicatie voorziet met oöcyt rijping en folliculaire ontwikkeling18. Vorige 2D beeldvorming studies is gebleken dat ovariële follikels worden omgeven door een netwerk van haarvaten in de theca interna19. De granulosa laag is nonvascular, en elke follikel is omgeven door eigen haarvaten. In overeenstemming met de essentiële rol van CD31 in vasculogenese6, vonden we een toename in lengte van de capillaire tijdens folliculogenese in de overgang van primair naar secundair follikels (cijfers 2 g en 2 H). In plaats van een willekeurige distributie van haarvaten rond de individuele primaire of secundaire follikels, 3D reconstructie van haarvaten aangetoond dat capillaire vestigingen verspreid in follikels in grotere follikels worden opgespoord, en in de meeste gevallen deze capillaire takken gevormd een holle ruimte (Figuur 3).
Een grote zorg is dat de aangepaste methode relatief lang duurt om te wissen de eierstok, maar de lange tijd die is vereist voor het beste effect wissen. Sommige om tijd te besparen, raden we allemaal van de nodige monsters tegelijk verzamelen en schakelen hen samen omdat de gewiste weefsels kunnen worden opgeslagen in PBS en 0,02% natriumazide bij 4 ° C voor enkele maanden. Een andere beperking is de afstand van de werken van de confocal microscoop. Hogere-vergroting objectieven hebben kortere afstanden van de werken, die een belemmering voor de beeldvorming van dikke monsters kunnen worden.
Verschillende protocollen ingevoerd voor de beeldvorming van transparante en intact weefsel, met inbegrip van BABB20schaal21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, duidelijkheid16, passieve duidelijkheid (met4 of zonder hydrogel25), PACT12, KUBIEKE26,27, FASTClear28, en feit29, maar slechts drie van hen zijn gebruikt voor de hele eierstokweefsel clearing en evaluatie9, 30,31. SeeDB30 en31 van de ScaleA2 hebben geïntroduceerd voor beeldvorming van hele ovariële weefsels, maar deze protocollen toestaan alleen een enkele immunokleuring stap. Passieve duidelijkheid, echter, kan voor meerdere eiwit-labeling reacties, zoals wordt weergegeven in de huidige studie en in onze eerdere studie9.
Kortom, biedt onze aangepast protocol voor het bepalen van de 3D structurele relatie tussen folliculaire lagen en bloedvaten met hele geklaarde eierstokweefsel een nieuwe aanpak voor het bestuderen van de angiogenese in verschillende ovariële ziekten zoals polycysteus ovarium syndroom en ovariële kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese speciale fonds voor Postdocs (nr. 2014T70392 aan de YF), de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81673766 aan de YF), het nieuwe leraar Priming Fonds, de oprichting van de Zuoxue van Fudan Universiteit en de ontwikkeling Project van Shanghai piek Disciplines-integratieve geneeskunde (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
