Summary
Här presenterar vi en anpassning av den passiva klarhet och 3D rekonstruktion metod för visualisering av äggstockscancer vaskulatur och follikulär kapillärer i intakt mus äggstockar.
Abstract
Äggstockarna är det viktigaste orgeln i det kvinnliga reproduktiva systemet och är nödvändigt för produktion av kvinnliga könsceller och för att styra det endokrina systemet, men komplexa strukturella relationer och tredimensionella (3D) vaskulatur arkitekturer av den äggstockarna är inte väl beskrivna. För att visualisera 3D anslutningar och arkitekturen av blodkärl i intakt äggstockarna, är det första viktiga steget att göra äggstocken optiskt klart. För att undvika vävnad krympning, vi använde hydrogel fixering-baserade passiva klarhet (rensa Lipid-utbyts akrylamid-hybridiserad Rigid Imaging / immunfärgning/In situ-hybridisering-kompatibel vävnad Hydrogel) protokoll metod att rensa en intakt äggstock . Immunfärgning och avancerade multiphoton konfokalmikroskopi 3D bild-rekonstruktioner användes sedan för visualisering av äggstockarna fartyg och follikulär kapillärer. Använder denna metod, vi visade en signifikant positiv korrelation (P < 0,01) mellan längden av follikulära kapillärer och volym av follikulära väggen.
Introduction
Follikeln är den grundläggande strukturella och funktionella enheten i äggstocken och dess utveckling är starkt relaterat till vaskulatur inom äggstocken. Blodkärl leverera näring och hormoner till hårsäckarna och därigenom spelar viktiga roller i tillväxt och mognad av folliklar1.
En kombination av teknik, inklusive selektiva blodkärl markörer, transgena musmodeller och läkemedelsutveckling, har ökat vår kunskap om äggstockscancer vaskulär nätverk, angiogenes och funktionen av blodkärl i folliculogenesis. Äggstockarna är känt som ett aktivt organ eftersom det remodels olika vävnader och vaskulär nätverk under folliculogenesis och ägglossning. Sådana aktiva remodeling i storlek och struktur av fartyg krävs för den biologiska funktionen av utveckla och rekrytera folliklar.
Traditionella histologiska och Histomorfometriska metoder med hjälp av äggstockscancer sektioner och immunolabeling av blodkärl är begränsade till tvådimensionella (2D) bilder2. Med utvecklingen av tredimensionella (3D) rekonstruktion teknik, 2D-bilder av vävnad skivor kan vara överlappad för att göra en 3D-strukturen, men denna metod fortfarande har vissa begränsningar — snittning av vävnad kan förstöra mikrostrukturer, vissa delar av den vävnad är ofta saknas, och betydande arbete är involverad i att göra 3D rekonstruktioner från bilder tagna från skivor. Hela-vävnad 3D imaging med konfokalmikroskopi kan övervinna många av dessa begränsningar, men dessa metoder är begränsade till utvärderingen av angiogenes i embryonala äggstock3. Använda hela vävnad clearing metoder såsom klarhet4 kan öka volymen visualiseras för att lösa dessa problem i postnatal och vuxen äggstockar, och sådana metoder ger optiska clearance av äggstocken utan någon strukturell deformationer. Avbildning av 3D arkitekturen intakt äggstockscancer ger korrekt bilddatabas för bild analys programvara, såsom programpaketet Imaris används i detta arbete.
Ombyggnad av äggstocken under hela vuxenlivet är en del av ett dynamiskt fysiologiska system, och detta gör äggstocken en utmärkt modell för utredningar av regleringen av angiogenes. Dessutom kan utvärderar rollen av äggstockscancer blodkärl i patologiska förhållanden av det kvinnliga reproduktiva systemet såsom polycystiskt ovariesyndrom eller äggstockscancer studeras genom hela äggstocksvävnad imaging. Utvecklingen av metoden passiva klarhet och användning av avancerade bildbehandlingsprogram analys har lämnat detaljerad geografisk information om relationerna mellan blodkärl och cystor strukturer såsom folliklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som berör animaliska ämnen följt riktlinjerna i djur etikkommittén vid Shanghai Medical College, Fudan University (godkännandenummer 20160225-013).
1. beredning av Transparent mus ovaryen
-
Beredning av lösningar
- Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning (1 M, pH 7,6) med 0,1% Triton x-100 (PBST). För att göra 1 L 10 x PBS stamlösning, blanda 87 g NaCl, 3,1 g NaH2PO4 · 2H2O och 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. lägga till dH2O 1 L och uppståndelse ~ 2 h. Justera till pH 7,4 med 1 N NaOH och förvara i rumstemperatur. Späd ut denna 10 x stamlösning av 1/10 använder dH2O och sedan göra 0,1% Triton x-100 i PBS.
- Bereda hydrogel-lösning (pH 7,5) av mixningar 4% (wt/vol) PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning, 4% (wt/vol) akrylamid, 0,05% (wt/vol) bisacrylamide och 0,25% (wt/vol) VA-044 initierare i dubbeldestillerat vatten på isen.
- Bereda clearing-lösning (pH 8,5) genom att blanda 200 mM natriumborat buffert innehållande 4% (wt/vol) sodium dodecyl sulfate (SDS) i dubbeldestillerat vatten.
-
Transcardial perfusion och äggstock förberedelse
- Hålla alla lösningar på is under alla förfaranden.
- Söva vuxna kvinnliga vildtyp C57BL/6 mus med en intraperitoneal injektion av pentobarbital (0,35 mg/kg) lösning. När den visar ingen tå-nypa svar, är musen bedövas ordentligt.
- Använd tejp fixar musen med lemmar sträckte ut en platta skum ombord.
- Avslöja hjärtat genom ett snitt på xiphoid-processen genom bröstet, hud och ben med sax.
- Gör ett snitt i djurets höger förmak, och sedan BEGJUTA vänster kammare med 20 mL iskallt 1 x PBS på 10 mL/min.
- BEGJUTA djuret med minst 20 mL hydrogel vid 10 mL/min.
- Incisionsfilm huden över buken längs medioventral med sax, vilket utsätter den hela enterocoelia, och ta bort tarmen. Samla äggstockarna samt livmodern för att upprätthålla integriteten av äggstockscancer morfologi.
- Ta bort fettvävnader runt äggstocken under ett mikroskop.
-
Avgasning
- Placera äggstockarna i 10 mL hydrogel lösning vid 4 ° C för fixering i 3 dagar.
- Överföra äggstockarna i en 5 mL-röret och fyll röret med hydrogel lösning. Sträcka parafilm över toppen av röret och sedan Linda parafilm runt halsen på röret.
Varning: Se till att det finns inga bubblor mellan parafilm och hydrogel lösningen. - Placera röret på en shaker i inkubatorn vid 37 ° C i högst 3 h att tillåta hydrogel att polymerisera.
- Ta bort äggstockarna från gelen med hjälp av en spatel och ta försiktigt bort överflödigt gelen från runt äggstockarna av mjukpapper. Tvätta fyra gånger med 1 x PBS äggstocken.
-
Passiva clearing
- Dränka äggstocken i 10 mL av clearing lösningen. Skaka försiktigt på 80 rpm vid 37 ° C att starta clearingen.
- I den första veckan, ändra lösningen efter 3 dagar. Efter en vecka, uppdatera clearing lösningen en gång i veckan tills äggstockarna blir tydlig. Denna process tar vanligtvis ca 2-3 veckor.
Obs: Äggstockarna kan vara direkt immunostained eller kan lagras i natriumazid (0,02%) i PBS vid 4 ° C under flera veckor innan immunfärgning.
2. immunfärgning
- Tvätta äggstocken två gånger i PBST dag 1 vid 37 ° C i en shaker.
- Inkubera i äggstockarna på en shaker i primära antikroppar/PBST lösning (tabell 1) på dag 2-3 vid 37 ° C. I det arbete som presenteras här, de primära antikropparna var trombocyt-endotelceller vidhäftning molekylen 1 (CD31) och tyrosin hydroxylas utspätt 1:10 och 1:50 i PBST, respektive.
Försiktighet: Om två eller flera typer av primär antikropp används, se till att det finns olika animaliska källor. - Tvätta bort de primära antikropparna med PBST buffert vid 37 ° C på dag 4 på en shaker.
- Inkubera äggstocken med önskad sekundära antikropparna i PBST på dag 5-6 vid 37 ° C i en shaker. I det arbete som presenteras här, var de sekundära antikropparna Alexa mjöl 488 för tyrosin hydroxylas och Alexa mjöl 594 för CD31 utspätt till 1:50 i PBST.
- Tvätta bort de sekundära antikropparna med PBST buffert vid 37 ° C på dagen 7 på en shaker.
- Överföra vävnaden till brytningsindex matchande lösning för brytningsindex homogenisering dag 8. Sätta i vävnaden på ett papper med stödlinjer att kontrollera dess visuell tydlighet genom att kontrollera huruvida stödlinjerna kan ses. När vävnaden har klarlagts fullt, kan det avbildas.
- Göra en kitt cylinder som kunde bara omger vävnad, och sedan forma det till formen av en hästsko och tryck yttre åsen tätt på en glasskiva för att göra ett förseglat utrymme. Höjden av spacklet bör vara lite längre än äggstocken.
- Placera skirat äggstocken noga in i centrera av putty och tillsätt brytningsindex matchande lösning. Sätta en glasbotten maträtt över spacklet hårt och Använd putty fixar skålen.
3. konfokalmikroskopi
- För imaging med en confocal Mikroskop, ”Ni-E” Välj panelen linsen (i detta fall vatten nedsänkning 25 X objektiv, 1.1-NA, 2 mm-WD) med korrekt arbetsavstånd (i detta fall 2,0 mm).
-
Välj antalet kanaler i panelen ”förvärv”. Här använda tre kanaler.
- Använd först fliken ”ögat port” och XY controller joysticken flytta vävnaden till mitten av fält genom att markera i mikroskopet okularen.
- Efter att stänga av slutare ljuset, klicka på fliken ”live” för att justera den ”laser power”, ”HV (vinst)”, och ”offset' för varje kanal separat. Högre lasereffekt och HV kan leda till högre signaler och högre offset kan minska bakgrundsljud.
- Välj rätt ”Scan storlek” och ”greven”. Använd en skanningsstorlek 1024 x 1024 µm2 och en sammanräkning av 4 till 8.
-
Efter inställning bildkvalitet för att definiera djupet i vävnaden i panelen ”Z intensitet korrigering”, och efter att lokalisera linsen på det översta lagret av äggstocken (i mitten av vävnaden) och justera förvärv för det översta lagret, klicka på ”plus” för att definiera det översta lagret.
- Flytta linsen nedåt och ange lämpliga HV och laser makt för botten av vävnaden och lägga till lägsta lager informationen i tabellen Z-intensitet korrigering. Klicka på ”till ND” synkronisera inställningen med panelen ”ND förvärv”.
-
I ”ND förvärvet” panel, första uppsättningen numrera av scanning steg. Sedan markera flikarna ”Z” och ”stor bild”.
- Gå till fönstret ”Scan stor bild” för att definiera storleken på fältet enligt gränsa av vävnaden med hjälp av vävnad visualisering i okularen. Gå tillbaka till panelen ”ND förvärv” för att ange storleken på skanningsområdet (”fält”) och välj överlappningen mellan 10% och 15%.
- Klicka på ”Kör Z korrigering”, inte ”kör nu”, att automatiskt ange korrekt HV, laser power och offset för varje skikt, och vänta på bilden för att bearbeta.
4. 3D rekonstruktion av enskilda folliklar och deras Vasculatures
- Använd först ImageJ5 för att öppna den ursprungliga NIS-fil. Klicka på ”bild”-knappen och välj ”Color” och ”Split kanalerna”. Sedan, klicka på ”File” och separat Spara kanalerna som tiff fil serie med hjälp av ”bildsekvenser” alternativet i ”Spara som”.
- Använd Imaris för att öppna en tiff fil serien. Klicka på knappen ”Redigera” och välj ”Lägg till kanaler” att lägga till resten av kanalerna. Namn och färg av kanalen kan ändras i flikarna ”Display justering”. Tjockleken på vävnaden kan behöva rättas till i panelen ”egenskaper” i den nedrullningsbara listan under ”Redigera”.
- För 3D beskärningen av de sista bilderna och avlägsnande av överskjutande delar, klicka på knappen ”Redigera” och välj ”3D-gröda”. Storleken på fältet kan justeras genom att dra gränsen.
-
Klicka på knappen ”trådar” för att skapa en ny glödtråd och klicka på Nästa för att rekonstruera fartyget signalerna med filament algoritmen i panelen överstiga.
- För att definiera den största och den tunnaste diametern, gå till panelen ”Slice” och hitta spårning fartyget. Avståndet visas automatiskt på panelen ”åtgärd” genom att välja två punkter på den maximala bredden av fartyget.
- Gå tillbaka till panelen ”överstiga” och mata in den uppmätta bredden och klicka på Nästa.
- Justera start- och utsäde punkt tröskeln. Välj ”Välj” panelen ”kamera”. Om några av sfärernas automatiskt producerade behöver tas bort, tryck på SKIFT och klicka på punkten. Genom att välja ”navigera” och flytta musen, kan strukturen roteras för att säkerställa att alla de rätta punkterna har behållits, och klicka sedan på Nästa.
- Välj den högsta tröskeln för den lokala kontrasten och klicka på Nästa. Inte väljer ”upptäcka Spines”, och fortsätta att slutföra återuppbyggnaden av blodkärl cylindern. Färgen kan redigeras genom att klicka på fliken ”färg”. Statistiska data kan extraheras på panelen ”statistik” i rekonstruerade glödtråden. Överskjutande delar kan tas bort i panelen ”redigera”.
Obs: Andra algoritmer kan användas för att mäta volymen av totala folliklar eller follikulär väggar. I det arbete som presenteras här, präglades oocyterna av autofluorescens båda sekundära antikroppar. På grund av den stora mängden data, var en arbetsstation server används för dataanalys.
5. statistisk analys
Obs: Bilden analysdata presenteras som betyder ± standardfel.
- Utföra jämförelser mellan hårsäckarna med oberoende sampel t-test och använda Pearsons korrelation test för att jämföra korrelationskoefficienterna follikulära vägg och kapillär längd. Ange ett värde av P < 0,05 eftersom gränsen för statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anpassat metoden passiva klarhet till en snabb och enkel metod för passiv äggstock clearing samtidigt bevarar den follikulära och vaskulär arkitekturen och få högsta fluorescerande signalen från märkt markörer av fartyg och folliklar. Den follikulära vaskulatur 3D arkitektur fastställdes genom immunfärgning för CD31, en markör för endotelceller6. CD31 färgning i äggstockarna hos vuxna möss spårades med glödtråden algoritm och visade sambanden mellan follikulära kapillärer och primära och sekundära folliklar (figur 1).
Spot förvandlingen och Surface algoritmer användes att detektera tyrosin hydroxylas-immunostained oocyter och granulosa och thecal lager och för att beräkna den totala volymen av folliklar7,8. På grund av kompaktering av folliklar identifierades vissa delar av beskurna folliklar semi manuellt. Efter plats omvandling av enskilda follikulära volym och oocyter och Surface återuppbyggnaden av de follikulära vägglagrarna och glödtråden rekonstruktion av fartygen, rensa relationer mellan enskilda follikulära vasculatures och den andra uppmätta index, särskilt granulosa och thecal lager volymer, observerades (figur 2).
Figur 1 : Högupplöst avbildning av en intakt vuxen mus äggstock efter röjning med protokollet anpassade passiva klarhet. (A-B) Sektioner och XYZ stora-scan förvärv. Tre dimensionell (3D) beskurna sekundär (C) och primära (D) folliklar (översta raden) och 3D rekonstruerade kapillärer, oocyter och granulosa/thecal celler av samma follikeln (nedersta raden) visas som identifierats av glödtråden, yta, och Spot omvandling algoritmer. Skala barer = 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Jämförande index för relationerna mellan primära och sekundära cystor folliklar och deras vasculatures. Äggcellen volymen (A) extraherades efter 3D rekonstruktioner av follikulära volym och oocyter i enskilda folliklar som bestäms av Spot omvandling algoritmen och follikulär vägg volymen (B) bestämdes av ytan algoritm och kapillärerna spårades av glödtrådens algoritmen. Äggcellen volym/kapillär längd förhållandet (D), follikulära volym/kapillär längd förhållandet (F), follikulära vägg volym/kapillär längd förhållandet (E), follikulära volymen (C), kapillär längd (H), och korrelation av kapillär längd och follikulär vägg volym (G) beräknades med hjälp av lämpliga verktyg i programpaketet. Felstaplar representera standard fel medel. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tredimensionella rekonstruktionen av kapillärerna i sekundära folliklar i äggstockarna mus. Detta avslöjar ett ihåligt utrymme ovanför äggcellen sidan av folliklar (vita rutorna Visa gränserna för utrymmen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien presenterar vi 3D-avbildning för att utvärdera relationerna mellan kapillärer och enskilda växande folliklar. I vårt tidigare arbete med samma protokoll 9, studerat vi roller stora kärlsystemet, interaktioner mellan folliklar, och placeringen av folliklar i intakt mus äggstockar. Det passiva tydlighet tillvägagångssättet tillät oss att studera mikro - och makro-vasculatures, folliculogenesis och inbördes relationerna mellan corpora lutea och hårsäckarna samt att rekonstruera cystor arkitekturen i olika utvecklingsstadier.
För att få 3D bilddata av intakta vävnader, är clearingen det första viktiga steget. Det finns två huvudsakliga strategier — hydrofil reagens-baserade metoder, såsom passiv tydlighet10och uttorkning. Eftersom uttorkning metoder ofta leda till en minskning av fluorescerande signaler och ofta producera giftiga organiska lösning avfall, har vi fokuserat vår uppmärksamhet på att förenkla vissa steg passiva tydlighet metoden för användning med olika vävnadstyper.
Den första kritiska proceduren i clearingen är transcardial perfusionen. Under perfusionen spelar hjärtat pumpa en viktig roll i hela kroppen cirkulationen av PBS och hydrogel lösning, som kan spola ut blod så att minska bakgrunden fluorescensen. Således, perfusion operationen bör utföras noggrant och snabbt för att undvika förtida död djuret innan hydrogel fördelas helt över hela djuret. Alla agenter måste hållas på is under hela experimentet, som nämndes av Liang et al. 11, eller de börjar att polymerisera innan perfusionen är klar. Nästa viktiga steg är att ta bort hydrogel, och det är nödvändigt att ta bort så mycket överflödig gel som möjligt eftersom det kommer att behålla antikroppar. När vävnaden är avmarkerad, bör det tas bort från röjning lösningen och förvaras i PBS vid 4 ° C eftersom för mycket tid i clearing lösningen kommer att orsaka alltför mycket proteinet kan gå förlorade. I den konfokalmikroskopi imaging, ska Z-inställningarna alltid vara inställt innan intervallet X-Y. Om intervallet X-Y ställs ner först, kan Z-inställningarna inte synkroniseras till fältet hela X-Y.
Passiva tydlighet introducerades av Yang et al. 12 i deras protokoll, de utföra inte steget perfusion och istället avgasas med kväve. Dessutom deras clearing lösning innehöll inte bisacrylamide i hydrogel lösningen, de använde 8% SDS i clearing lösningen och de använde fälgar för brytningsindex på media. Denna metod förbättrades därefter av ökande SDS koncentration13, lägga till steget perfusion och kvävefri avgasning förfarande14och kombinera metoden med andra röjningmetoder som PARS-mPACT15. Här, har vi vidareutvecklat protokollet genom att kombinera transcardial perfusion och kvävefri avgasning, minskar SDS i clearing lösningen till 4%, och använda FocusClear som brytningsindex matchande media, vilket ger bättre kvalitet mikroskopi bilder.
Efter passiva tydlighet, kan confocal multiphoton mikroskopi och bild analys utföras för att få den ovarian follikulära kärlsystemet intakt 3D arkitektur. Detta protokoll förvandlar en icke-ljus-permeable intakt äggstocken till ett optiskt transparent hydrogel-hybridiserad nanoporösa form som är lämplig för penetration av makromolekyler som antikroppar16. Till skillnad från klassisk 2D sectional histologiska analyser kan passiv klarhet och färgning med specifika markörer 3D kartläggning av relationerna mellan kapillärer och enskilda växande folliklar.
I vuxna vävnader uppstår aktiva vaskulär remodeling och angiogenes huvudsakligen under patologiska processer såsom sårläkning, frakturreparation, tumör och metastaser formationer, retinopati, fibroses och reumatoid artrit17. Cykliska förändringar under folliculogenesis utgör dock en unik kapacitet för vaskulatur remodeling. Efter bildandet av antrum i sekundära folliklar, follikulära vätska fyller den och omger äggcellen, som ger en lämplig mikromiljö för oocytmognaden och follikulär utveckling18. Tidigare 2D imaging studier visade att cystor folliklar är omgivet av ett nätverk av kapillärer i theca interna19. Granulosa lagret är nonvascular, och varje follikel omges av sin egen kapillärer. Överensstämmer med den viktiga rollen som CD31 i vasculogenesis6, hittade vi en ökning i kapillär längd under folliculogenesis i övergången från primär till sekundär folliklar (siffror 2 g och 2 H). Istället för en slumpmässig fördelning av kapillärerna runt de enskilda primära eller sekundära folliklarna, 3D rekonstruktion av kapillärer visade att kapillär grenar distribueras i folliklar var detekterbart i större folliklar, och i de flesta fall dessa Kapillär grenar bildade ett ihåligt utrymme (figur 3).
Ett större bekymmer är att den anpassa metoden tar relativt lång tid att rensa äggstocken, men lång tid krävs för bästa clearing effekt. För att spara tid, rekommenderar vi att samla alla nödvändiga prover på en gång och radera dem tillsammans eftersom de rensas vävnaderna kan lagras i PBS och 0,02% natriumazid vid 4 ° C i flera månader. En annan begränsning är arbetsavstånd av confocal mikroskopet. Högre förstoring objektiv har kortare arbeta avstånd, vilket skulle kunna vara ett hinder för avbildning av tjock prover.
Flera protokoll har införts för bildtagning av transparenta och intakt vävnad, inklusive BABB20, skala21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, tydlighet16, passiv klarhet (med4 eller utan hydrogel25), pakten12, KUBISK26,27, FASTClear28, och faktum29, men bara tre av dem har använts för hela äggstocksvävnad clearing och utvärdering9, 30,31. SeeDB30 och ScaleA231 har införts för avbildning av hela äggstockarna vävnader, men dessa protokoll tillåter endast ett enda immunfärgning steg. Passiva tydlighet, tillåter dock för flera protein-märkning reaktioner, som visas i den aktuella studien och i vår tidigare studie9.
Sammanfattningsvis ger våra anpassade protokoll för att identifiera 3D strukturella förhållandet mellan follikulära lager och blodkärl som använder hela skirat äggstocksvävnad en ny metod för att studera angiogenes i olika cystor sjukdomar såsom polycystiskt ovariesyndrom och äggstockscancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från den kinesiska särskilda fonden för postdoktorer (nr 2014T70392 till YF), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 81673766 till YF), den nya lärare Priming fonden, Stiftelsen Zuoxue av Fudan University och utveckling Projektet i Shanghai Peak discipliner-integrativ medicin (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
