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Biology

निष्क्रिय स्पष्टता-साफ़ माउस अंडाशय के संवहनी वास्तुकला के तीन आयामी पुनर्निर्माण

Published: December 10, 2017 doi: 10.3791/56141
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम बरकरार माउस अंडाशय में डिम्बग्रंथि vasculature और तोंसिल्लितिस केशिकाओं के दृश्य के लिए निष्क्रिय स्पष्टता और 3 डी पुनर्निर्माण विधि का एक अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

अंडाशय मादा प्रजनन प्रणाली का मुख्य अंग है और महिला gametes के उत्पादन के लिए और अंत: स्रावी प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है, लेकिन जटिल संरचनात्मक संबंधों और तीन आयामी (3 डी) के vasculature आर्किटेक्चर अंडाशय अच्छी तरह से वर्णित नहीं हैं । आदेश में 3 डी कनेक्शन और बरकरार अंडाशय में रक्त वाहिकाओं के वास्तुकला कल्पना करने के लिए, पहला महत्वपूर्ण कदम अंडाशय ऑप्टिकली स्पष्ट करने के लिए है । आदेश में ऊतक संकोचन से बचने के लिए, हम hydrogel निर्धारण आधारित निष्क्रिय स्पष्टता का इस्तेमाल किया (स्पष्ट लिपिड-विमर्श Acrylamide-संकर कठोर इमेजिंग/Immunostaining/में सीटू-संकरण-संगत ऊतक hydrogel) प्रोटोकॉल विधि एक बरकरार अंडाशय साफ करने के लिए . Immunostaining, उंनत multiphoton फोकल माइक्रोस्कोपी, और 3 डी छवि पुनर्निर्माण तो डिंबग्रंथि वाहिकाओं और तोंसिल्लितिस केशिकाओं के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया । इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम एक महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध (पी < 0.01) की तोंसिल्लितिस और फुफ्फुसीय दीवार की मात्रा की लंबाई के बीच दिखाया ।

Introduction

कूप अंडाशय के मौलिक संरचनात्मक और कार्यात्मक इकाई है, और इसके विकास अत्यधिक अंडाशय के भीतर vasculature से संबंधित है । रक्त वाहिकाओं के रोम के लिए पोषण और हार्मोन की आपूर्ति और इस तरह विकास और रोम के परिपक्वता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1.

चयनात्मक रक्त वाहिका मार्करों, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, और दवा विकास सहित प्रौद्योगिकियों का एक संयोजन, डिंबग्रंथि संवहनी नेटवर्क, angiogenesis के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि हुई है, और में रक्त वाहिकाओं के समारोह folliculogenesis । अंडाशय एक सक्रिय अंग के रूप में जाना जाता है क्योंकि यह folliculogenesis और ovulation के दौरान विभिन्न ऊतकों और संवहनी नेटवर्क को फिर से तैयार । आकार और जहाजों की संरचना में ऐसे सक्रिय remodeling के विकास और रोम की भर्ती के जैविक समारोह के लिए आवश्यक है ।

डिम्बग्रंथि वर्गों और रक्त वाहिकाओं के immunolabeling का उपयोग पारंपरिक ऊतकीय और histomorphometric तरीकों दो आयामी (2d) छवियों को2तक ही सीमित हैं । तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण प्रौद्योगिकियों के विकास के साथ, ऊतक स्लाइस के 2d छवियों एक 3d संरचना बनाने के लिए छा जा सकता है, लेकिन इस विधि अभी भी कुछ सीमाएं है-ऊतक के अनुभाग microstructures नष्ट कर सकते हैं, के कुछ भागों ऊतक अक्सर याद कर रहे हैं, और महत्वपूर्ण परिश्रम स्लाइस से प्राप्त छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण बनाने में शामिल है । फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे ऊतक 3 डी इमेजिंग इन सीमाओं के कई दूर कर सकते हैं, लेकिन इन तरीकों भ्रूण अंडाशय में angiogenesis के मूल्यांकन के लिए सीमित कर रहे हैं3. इस तरह की स्पष्टता के रूप में पूरे ऊतक समाशोधन विधियों का प्रयोग4 visualized मात्रा में वृद्धि इतनी के रूप में प्रसव और वयस्क अंडाशय में इन समस्याओं को हल करने के लिए कर सकते हैं, और इस तरह के तरीकों किसी भी संरचनात्मक विकृति के बिना अंडाशय के ऑप्टिकल निकासी प्रदान करते हैं । बरकरार अंडाशय के 3 डी वास्तुकला की इमेजिंग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इस काम में इस्तेमाल किया Imaris सॉफ्टवेयर पैकेज के रूप में के लिए एक सटीक छवि डेटाबेस प्रदान करता है ।

एक गतिशील शारीरिक प्रणाली का हिस्सा है, और यह अंडाशय के angiogenesis के विनियमन में जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है... इसके अलावा, ऐसे पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम या डिंबग्रंथि के कैंसर के रूप में मादा प्रजनन प्रणाली के रोग की स्थिति में डिंबग्रंथि रक्त वाहिकाओं की भूमिका का मूल्यांकन पूरे डिंबग्रंथि ऊतक इमेजिंग के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है । निष्क्रिय स्पष्टता विधि और उंनत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग के विकास के रोम के रूप में रक्त वाहिकाओं और डिम्बग्रंथि संरचनाओं के बीच संबंधों पर विस्तृत स्थानिक जानकारी प्रदान की है ।

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Protocol

पशु विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं शंघाई मेडिकल कॉलेज, फुदन विश्वविद्यालय में पशु नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों के बाद (अनुमोदन संख्या 20160225-013) ।

1. पारदर्शी माउस अंडाशय की तैयारी

  1. समाधान की तैयारी
    1. फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) समाधान (1 M, pH ७.६) को ०.१% ट्राइटन X-१०० (PBST) के साथ तैयार करें । 10x पंजाबियों शेयर समाधान के 1 एल बनाने के लिए, मिश्रण ८७ NaCl के जी, णः के ३.१ g2PO4 · 2H२हे, व २८.७ g च्या ना२HPO४ · 12घं२हे. जोड़ डीएच२हे ते १ एल आणि हलचल ~ २ एच. 1 N NaOH के साथ पीएच ७.४ और कमरे के तापमान पर स्टोर करने के लिए समायोजित करें । 1/10 डीएच2O का उपयोग करके इस 10x स्टॉक समाधान को पतला करें और फिर पंजाब में ०.१% ट्राइटन X-१०० करें ।
    2. hydrogel समाधान (pH ७.५) को 4% मिश्रण करके तैयार करें (wt vol) paraformaldehyde (पीएफए) समाधान, 4% (wt/vol) acrylamide, ०.०५% (wt/vol) bisacrylamide, और ०.२५% (wt/खंड) VA-०४४ बर्फ पर डबल आसुत पानी में सर्जक ।
    3. 4% (wt/vol) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) युक्त डबल आसुत जल में २०० मिमी सोडियम बोराटे बफर मिश्रण से समाशोधन समाधान (पीएच ८.५) तैयार करें ।
  2. Transcardial छिड़काव तथा अंडाशय वडा
    1. सभी प्रक्रियाओं के दौरान बर्फ पर सभी समाधान रखें ।
    2. Anesthetize वयस्क मादा जंगली प्रकार C57BL/pentobarbital के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ 6 माउस (०.३५ मिलीग्राम/समाधान । एक बार यह कोई पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया से पता चलता है, माउस ठीक से anesthetized है ।
    3. चिपचिपा टेप का प्रयोग करें एक फ्लैट फोम बोर्ड पर फैला अंग के साथ माउस को ठीक करने के लिए ।
    4. छाती, त्वचा के माध्यम से असिरूप-प्रक्रिया पर एक चीरा द्वारा दिल बेनकाब, और कैंची के साथ हड्डियों.
    5. पशु सही atrium में एक चीरा बनाओ, और फिर 10 मिलीलीटर पर बर्फ ठंडा 1x पंजाबियों के 20 मिलीलीटर के साथ वाम निलय perfuse/
    6. Perfuse के साथ पशु को 10 मिलीलीटर से कम 20 मिलीलीटर hydrogel समाधान/
    7. काटकर पेट के ऊपर medioventral लाइन के साथ कैंची के साथ त्वचा, जो पूरे enterocoelia को उजागर करता है, और आंतों को हटा दें । डिम्बग्रंथि आकृति विज्ञान की अखंडता को बनाए रखने के लिए गर्भाशय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंडाशय ले लीजिए ।
    8. एक खुर्दबीन के नीचे अंडाशय के आसपास वसा ऊतकों को हटा दें ।
  3. degassing
    1. 3 दिनों के लिए निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर hydrogel समाधान में अंडाशय रखें ।
    2. अंडाशय को 5-एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और hydrogel समाधान के साथ ट्यूब भरें । ट्यूब के शीर्ष पर खिंचाव parafilm और फिर ट्यूब की गर्दन के आसपास parafilm लपेटो ।
      चेतावनी: सुनिश्चित करें कि parafilm और hydrogel समाधान के बीच कोई बुलबुले हैं ।
    3. मशीन में एक बरतन पर ट्यूब ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेस 3 एच की एक अधिकतम के लिए polymerize को hydrogel अनुमति देते हैं ।
    4. एक रंग का उपयोग कर जेल से अंडाशय निकालें और ध्यान से ऊतक कागज द्वारा अंडाशय के चारों ओर से अतिरिक्त जेल हटा दें । 1x पंजाबियों के साथ चार बार अंडाशय धो लें ।
  4. निष्क्रिय समाशोधन
    1. अंडाशय समाशोधन समाधान के 10 मिलीलीटर में जलमग्न । धीरे समाशोधन प्रक्रिया शुरू करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ८० rpm पर हिला ।
    2. पहले सप्ताह में, समाधान हर 3 दिन में बदल जाते हैं । एक सप्ताह के बाद, एक सप्ताह में एक बार समाशोधन समाधान को ताज़ा करें जब तक अंडाशय स्पष्ट हो जाता है । आमतौर पर इस प्रक्रिया के बारे में 2-3 सप्ताह लगते हैं ।
      नोट: अंडाशय सीधे immunostained जा सकता है या immunostaining से पहले कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में सोडियम azide (०.०२%) में संग्रहित किया जा सकता है ।

2. Immunostaining

  1. एक बरतन पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर दिन 1 पर PBST में अंडाशय को दो बार धोएं ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिन पर प्राथमिक एंटीबॉडी/PBST समाधान (तालिका 1) में एक शेखर पर अंडाशय की मशीन । यहां प्रस्तुत काम में, प्राथमिक एंटीबॉडी प्लेटलेट-endothelial सेल आसंजन अणु 1 (CD31) और tyrosine hydroxylase PBST में 1:10 और 1:50 में पतला, क्रमशः थे ।
    चेतावनी: यदि दो या अधिक प्रकार के प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि विभिंन पशु स्रोत हैं ।
  3. एक बरतन पर 4 दिन पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर PBST बफर के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी धो लो ।
  4. एक शेखर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर दिन 5-6 पर PBST में वांछित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अंडाशय की मशीन । यहां प्रस्तुत काम में, माध्यमिक एंटीबॉडी PBST में 1:50 में पतला CD31 के लिए tyrosine hydroxylase और alexa आटा ५९४ के लिए alexa आटा ४८८ थे ।
  5. एक बरतन पर 7 दिन पर ३७ ° c पर PBST बफर के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी धो लो ।
  6. 8 दिन पर अपवर्तन सूचकांक homogenization के लिए अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान में ऊतक स्थानांतरित । किसी काग़ज़ पर टिशू को ग्रिडलाइनों के साथ रखें ताकि यह जांच कर सके कि ग्रिडलाइनें देखी जा सकती हैं । एक बार ऊतक पूरी तरह से स्पष्ट किया गया है, यह छवि हो सकता है ।
  7. एक पुटी बना हुआ सिलेंडर है कि सिर्फ ऊतक चारों ओर सकता है, और फिर यह एक घोड़े की नाल के आकार में आकार और एक गिलास स्लाइड पर कसकर बाहरी रिज प्रेस ताकि एक सील अंतरिक्ष बनाने के लिए । पुटीन की ऊंचाई अंडाशय की तुलना में थोड़ी लंबी होनी चाहिए ।
  8. स्पष्ट अंडाशय को पुटी के केंद्र में ध्यान से रखें और अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान जोड़ें । पुटी कसकर ऊपर एक गिलास नीचे पकवान रखो और व्यंजन को ठीक करने के लिए पुटी का उपयोग करें ।

3. फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए, "Ni-E" पैनल में लेंस चुनें (इस मामले में पानी विसर्जन 25X उद्देश्य लेंस, १.१-NA, 2 mm-WD) उचित काम दूरी के साथ (इस मामले में २.० mm) ।
  2. "अधिग्रहण" पैनल में, चैनलों की संख्या का चयन करें । यहां, तीन चैनलों का उपयोग करें ।
    1. सबसे पहले, "नेत्र बंदरगाह" टैब और XY नियंत्रक जॉयस्टिक माइक्रोस्कोप eyepieces के माध्यम से जांच द्वारा क्षेत्र के केंद्र के लिए ऊतक ले जाने के लिए का उपयोग करें ।
    2. शटर लाइट बंद करने के बाद, "लेज़र पावर", "एचवी (गेन)", और प्रत्येक चैनल के लिए अलग से "ऑफ़सेट" समायोजित करने के लिए "लाइव" टैब क्लिक करें । उच्च लेजर शक्ति और एचवी उच्च संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और उच्च ऑफसेट पृष्ठभूमि शोर को कम कर सकते हैं ।
    3. उचित "स्कैन आकार" और "गणना" का चयन करें । १०२४ x १०२४ µm2 के स्कैन आकार और 4 से 8 की गिनती का उपयोग करें ।
  3. "Z तीव्रता सुधार" पैनल में ऊतक की गहराई को परिभाषित करने के लिए छवि गुणवत्ता की स्थापना के बाद, और अंडाशय के शीर्ष सबसे परत पर लेंस का पता लगाने के बाद (ऊतक के केंद्र में) और शीर्ष परत के लिए अधिग्रहण का समायोजन, "प्लस" पर क्लिक करें बटन शीर्ष परत को परिभाषित करने के लिए ।
    1. लेंस नीचे ले जाएं और ऊतक के नीचे के लिए उपयुक्त एचवी और लेजर शक्ति सेट और Z-तीव्रता सुधार तालिका में सबसे कम परत जानकारी जोड़ें । "एनडी अधिग्रहण" पैनल के साथ सेटिंग को सिंक्रनाइज़ करने के लिए "एनडी" पर क्लिक करें ।
  4. "एनडी अधिग्रहण पैनल" में, पहले कदम स्कैनिंग की संख्या निर्धारित करें । फिर, टैब "Z" और "बड़ी छवि" टिक ।
    1. eyepieces के माध्यम से ऊतक दृश्य की मदद से ऊतक की सीमा के अनुसार क्षेत्र के आकार को परिभाषित करने के लिए "बड़ी छवि स्कैन" विंडो पर जाएँ । स्कैनिंग क्षेत्र ("फ़ील्ड") का आकार इनपुट करने के लिए "एनडी अधिग्रहण" पैनल पर वापस जाएँ और 10% और 15% के बीच ओवरलैप का चयन करें.
    2. क्लिक करें "भागो जेड सुधार", नहीं "अब भागो", स्वचालित रूप से उचित एचवी, लेजर शक्ति सेट करने के लिए, और प्रत्येक परत के लिए ऑफसेट, और प्रक्रिया के लिए छवि के लिए रुको ।

4. व्यक्तिगत रोम और उनके Vasculatures के 3d पुनर्निर्माण

  1. सबसे पहले, मूल NIS फ़ाइल खोलने के लिए ImageJ5 का उपयोग करें । "छवि" बटन पर क्लिक करें और चुनें "रंग" और "विभाजित चैनल". फिर, "फ़ाइल" पर क्लिक करें और अलग से "के रूप में सहेजें" में "छवि अनुक्रम" विकल्प का उपयोग करके चैनल tiff फ़ाइल श्रृंखला के रूप में सहेजें ।
  2. tiff फ़ाइल श्रृंखला में से एक को खोलने के लिए Imaris का उपयोग करें । "संपादन" बटन पर क्लिक करें और बाकी चैनलों को जोड़ने के लिए "चैनल जोड़ें" चुनें. "प्रदर्शन समायोजन" टैब में चैनल का नाम और रंग बदला जा सकता है । ऊतक की मोटाई "छवि गुण" पैनल में ड्रॉप डाउन सूची में "संपादित करें" के तहत सही करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. अंतिम छवियों और अतिरिक्त भागों को हटाने की 3 डी फसल के लिए, "संपादित करें" बटन पर क्लिक करने और "फसल 3 डी" चुनें । मैदान का आकार सीमा खींचकर समायोजित किया जा सकता है ।
  4. पार पैनल में रेशा एल्गोरिथ्म के साथ पोत संकेतों को फिर से संगठित करने के लिए, एक नया रेशा बनाने के लिए "रेशा" बटन पर क्लिक करें और अगला क्लिक करें ।
    1. आदेश में सबसे बड़ा और पतले व्यास को परिभाषित करने के लिए, "टुकड़ा" पैनल के लिए जाने के लिए और अनुरेखण पोत मिल । दूरी स्वचालित रूप से पोत की अधिकतम चौड़ाई पर दो अंक का चयन करके "उपाय" पैनल पर दिखाया जाएगा ।
    2. "पार" पैनल और इनपुट मापा चौड़ाई और अगला पर क्लिक करने के लिए वापस जाओ ।
  5. प्रारंभिक और बीज बिंदु थ्रेशोल्ड समायोजित करें । "कैमरा" पैनल में, चुनें "चुनें" । यदि स्वचालित रूप से उत्पादित क्षेत्रों में से कुछ को हटा दिया जाना चाहिए, प्रेस shift और बिंदु पर क्लिक करें । "नेविगेट" चुनकर और माउस ले जाने से, संरचना को यह सुनिश्चित करने के लिए घुमाया जा सकता है कि सभी सही बिंदुओं को रखा गया है, और तब अगला क्लिक करें ।
  6. स्थानीय कंट्रास्ट के लिए उच्चतम थ्रेशोल्ड चुनें और अगला क्लिक करें । "का पता लगाएं spins" का चयन न करें, और रक्त वाहिका सिलेंडर के पुनर्निर्माण को अंतिम रूप देने के लिए जारी है । रंग "रंग" टैब पर क्लिक करके संपादित किया जा सकता है । सांख्यिकीय डेटा को खंगाला रेशा के "आकड़े" पैनल में निकाला जा सकता है । अतिरिक्त भागों "संपादित करें" पैनल में हटाया जा सकता है ।
    नोट: अन्य एल्गोरिदम कुल कूप या फुफ्फुसीय दीवारों की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहाँ प्रस्तुत कार्य में अंडाणुओं दोनों माध्यमिक एंटीबॉडी के autofluorescence द्वारा चिह्नित किए गए थे. डेटा की बड़ी मात्रा के कारण, किसी कार्यस्थान सर्वर डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था ।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट: छवि विश्लेषण डेटा ± मानक त्रुटियों का अर्थ है के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

  1. स्वतंत्र नमूना टी परीक्षण का उपयोग कर कूप के बीच तुलना प्रदर्शन, और पियरसन के सहसंबंध परीक्षण का उपयोग करने के लिए फुफ्फुसीय दीवार और केशिका लंबाई के सहसंबंध गुणांक की तुलना करें । सांख्यिकीय महत्व के लिए सीमा के रूप में P < 0.05 का मान सेट करें ।

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Representative Results

हम निष्क्रिय अंडाशय समाशोधन के लिए एक त्वरित और सरल विधि में निष्क्रिय स्पष्टता विधि अनुकूलित जबकि तोंसिल्लितिस और संवहनी वास्तुकला के संरक्षण और जहाजों और रोम के लेबल मार्करों से उच्चतम फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त करने । तोंसिल्लितिस vasculature के 3 डी वास्तुकला CD31, endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के लिए immunostaining द्वारा निर्धारित किया गया था6। वयस्क चूहों के अंडाशय में CD31 धुंधला रेशा एल्गोरिथ्म का उपयोग कर पता लगाया गया था और तोंसिल्लितिस और प्राथमिक और माध्यमिक कूप के बीच संबंध दिखाया (चित्रा 1) ।

स्थान परिवर्तन और सतह एल्गोरिदम tyrosine hydroxylase-immunostained अंडाणुओं और granulosa और thecal परतों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और रोम के कुल मात्रा7की गणना करने के लिए,8. रोम के संकुचन के कारण, फसली कूप के कुछ भागों अर्द्ध मैंयुअल रूप से पहचान की गई । व्यक्तिगत तोंसिल्लितिस की मात्रा और अंडाणुओं और फुफ्फुसीय दीवार परतों और जहाजों के रेशा पुनर्निर्माण की सतह के पुनर्निर्माण के स्थान परिवर्तन के बाद, व्यक्तिगत तोंसिल्लितिस vasculatures और अन्य के बीच स्पष्ट संबंध मापा सूचकांक, विशेष रूप से granulosa और thecal परत मात्रा, मनाया गया (चित्रा 2) ।

Figure 1
चित्र 1 : उच्च संकल्प निष्क्रिय स्पष्टता प्रोटोकॉल के साथ समाशोधन के बाद एक बरकरार वयस्क माउस अंडाशय के समाधान इमेजिंग । (A-B) वर्गों और XYZ बड़े स्कैन अधिग्रहण । तीन आयामी (3d) फसली माध्यमिक (ग) और प्राथमिक (D) रोम (शीर्ष पंक्ति) और 3 डी खंगाला केशिकाओं, अंडाणुओं, और granulosa/thecal कोशिकाओं के एक ही कूप (नीचे पंक्ति) के रूप में दिखाया जाता है की पहचान की रेशा, सतह, और स्थान परिवर्तन एल्गोरिदम । स्केल पट्टियां = २०० µm (A-B), ५० µm (C), 30 µm (D).  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्राथमिक और माध्यमिक डिंबग्रंथि के रोम और उनके vasculatures के बीच संबंधों के तुलनात्मक सूचकांक । oocyte मात्रा (एक) के रूप में स्थान परिवर्तन एल्गोरिथ्म द्वारा निर्धारित किया गया था के रूप में व्यक्तिगत रोम में तोंसिल्लितिस की मात्रा और अंडाणुओं के 3 डी पुनर्निर्माण के बाद निकाला गया था, और तोंसिल्लितिस दीवार की मात्रा (ख) सतह द्वारा निर्धारित की गई थी एल्गोरिथ्म और केशिकाओं रेशा एल्गोरिथ्म द्वारा पता लगाया गया था । तोंसिल्लितिस की मात्रा (ग), oocyte मात्रा/केशिका लंबाई अनुपात (डी), फुफ्फुसीय दीवार की मात्रा/केशिका लंबाई अनुपात (ई), फुफ्फुसीय मात्रा/केशिका लंबाई अनुपात (F), केशिका लंबाई (एच), और केशिका लंबाई और फुफ्फुसीय दीवार की मात्रा (G) के सहसंबंध को सॉफ़्टवेयर पैकेज में उपयुक्त उपकरणों का उपयोग करते हुए परिकलित किया गया था । त्रुटि पट्टियां means की मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करती हैं । n = 6; * P < 0.05; * * P < 0.01. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: माउस अंडाशय के द्वितीयक कूप में केशिकाओं का तीन-आयामी पुनर्निर्माण. यह रोम के oocyte पक्ष के ऊपर एक खोखले स्थान का पता चलता है (सफेद चौकों अंतरिक्ष की सीमाओं को दिखाते हैं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम केशिकाओं और व्यक्तिगत बढ़ते रोम के बीच संबंधों का मूल्यांकन करने के लिए 3 डी इमेजिंग प्रस्तुत करते हैं । हमारे पिछले एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर काम में 9, हम बड़े vasculature की भूमिकाओं का अध्ययन, रोम के बीच बातचीत, और बरकरार माउस अंडाशय में रोम के स्थान । निष्क्रिय स्पष्टता दृष्टिकोण हमें सूक्ष्म और स्थूल vasculatures, folliculogenesis का अध्ययन करने की अनुमति दी, और कॉर्पोरा lutea और रोम के बीच संबंध के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिंन विकास के चरणों में डिंबग्रंथि वास्तुकला पुनर्निर्माण के लिए ।

बरकरार ऊतकों के 3 डी छवि डेटा प्राप्त करने के लिए, समाशोधन प्रक्रिया पहला महत्वपूर्ण कदम है । वहां दो मुख्य रणनीतियों-निर्जलीकरण तरीके और हाइड्रोफिलिक एजेंट आधारित तरीकों, जैसे निष्क्रिय स्पष्टता10रहे हैं । क्योंकि निर्जलीकरण तरीकों अक्सर फ्लोरोसेंट संकेतों में कमी करने के लिए सीसा और अक्सर विषाक्त कार्बनिक समाधान अपशिष्ट का उत्पादन, हम विभिंन प्रकार के ऊतकों के साथ प्रयोग के लिए निष्क्रिय स्पष्टता विधि के कुछ कदम सरल बनाने पर हमारा ध्यान केंद्रित है ।

समाशोधन प्रक्रिया में पहली महत्वपूर्ण प्रक्रिया transcardial छिड़काव है । छिड़काव के दौरान, दिल पम्पिंग पंजाबियों और hydrogel समाधान के पूरे शरीर संचलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो बाहर रक्त फ्लश ताकि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम कर सकते हैं । इस प्रकार, छिड़काव शल्य चिकित्सा सही ढंग से किया जाना चाहिए और जल्दी से पशु की असमय मौत से बचने के लिए hydrogel पूरी तरह से पशु भर में वितरित किया जाता है । सभी एजेंटों बर्फ पर पूरे प्रयोग के दौरान रखा जाना चाहिए, के रूप में लिआंग एट अल द्वारा उल्लेख किया । 11, या वे छिड़काव के पूरा होने से पहले polymerize करना शुरू कर देंगे । अगले महत्वपूर्ण कदम hydrogel को दूर कर रहा है, और यह एंटीबॉडी को बनाए रखने होगा क्योंकि यह संभव के रूप में बहुत अतिरिक्त जेल के रूप में हटाने के लिए आवश्यक है । एक बार ऊतक को मंजूरी दे दी है, यह समाशोधन समाधान से हटा दिया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में संग्रहीत क्योंकि समाशोधन समाधान में बहुत अधिक समय बहुत अधिक प्रोटीन खो जाने का कारण होगा । में फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, Z-सेटिंग्स हमेशा X-Y श्रेणी से पहले सेट किया जाना चाहिए । x-y श्रेणी पहले नीचे सेट है, तो Z-सेटिंग्स पूरे X-y फ़ील्ड से सिंक्रनाइज़ नहीं किया जा सकता है ।

निष्क्रिय स्पष्टता सबसे पहले यांग एट अल द्वारा शुरू की गई थी । 12 उनके प्रोटोकॉल में, वे छिड़काव कदम प्रदर्शन नहीं किया और बजाय नाइट्रोजन के साथ degassed । इसके अलावा, उनके समाशोधन समाधान hydrogel समाधान में bisacrylamide शामिल नहीं किया था, वे समाशोधन समाधान में 8% एसडीएस इस्तेमाल किया, और वे अपवर्तन सूचकांक मिलान मीडिया के लिए रिम्स का इस्तेमाल किया. इस विधि के बाद एसडीएस एकाग्रता13बढ़ाने के द्वारा सुधार किया गया था, छिड़काव चरण और नाइट्रोजन मुक्त degassing प्रक्रिया14जोड़ने, और पार्स-mPACT15जैसे अन्य समाशोधन विधियों के साथ विधि संयोजन. यहाँ, हम आगे transcardial छिड़काव और नाइट्रोजन मुक्त degassing के संयोजन के द्वारा प्रोटोकॉल विकसित किया है, 4% करने के लिए समाशोधन समाधान में एसडीएस कम, और अपवर्तन सूचकांक मिलान मीडिया के रूप में FocusClear का उपयोग, जो बेहतर गुणवत्ता प्रदान करता है सूक्ष्म छवियां ।

निष्क्रिय स्पष्टता के बाद, फोकल multiphoton माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण डिम्बग्रंथि तोंसिल्लितिस vasculature के बरकरार 3 डी वास्तुकला प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल एक ऑप्टिकली पारदर्शी hydrogel-संकर nanoporous रूप है कि इस तरह के एंटीबॉडी के रूप में अणुओं द्वारा प्रवेश के लिए उपयुक्त है में एक गैर प्रकाश पारगंय बरकरार अंडाशय बदल देती है16। शास्त्रीय 2d अनुभागीय ऊतकीय विश्लेषण के विपरीत, निष्क्रिय स्पष्टता और विशिष्ट मार्करों के साथ धुंधला केशिकाओं और व्यक्तिगत बढ़ते रोम के बीच संबंधों के 3 डी मानचित्रण की अनुमति देता है ।

वयस्क ऊतकों में, सक्रिय संवहनी remodeling और angiogenesis मुख्य रूप से इस तरह के घाव भरने के रूप में रोग प्रक्रियाओं के दौरान होता है, फ्रैक्चर की मरंमत, ट्यूमर और मेटास्टेसिस संरचनाओं, retinopathies, fibroses, और रुमेटी गठिया17। हालांकि, folliculogenesis के दौरान चक्रीय परिवर्तन vasculature remodeling के लिए एक अद्वितीय क्षमता का प्रतिनिधित्व करते हैं । माध्यमिक कूप में कोटर के गठन के बाद, फुफ्फुसीय द्रव यह भरता है और oocyte, जो oocyte परिपक्वता और तोंसिल्लितिस के विकास के लिए एक उपयुक्त microenvironment प्रदान करता है के चारों ओर18। पिछले 2d इमेजिंग अध्ययनों से पता चला है कि डिंबग्रंथि के रोम theca interna19में केशिकाओं के एक नेटवर्क से घिरे हुए हैं । granulosa परत संवहनी है, और प्रत्येक कूप अपनी केशिकाओं से घिरा हुआ है । vasculogenesis6में CD31 की अनिवार्य भूमिका के अनुरूप, हम माध्यमिक कूप (आंकड़े 2 जी और 2H) के लिए प्राथमिक से संक्रमण में folliculogenesis के दौरान केशिका लंबाई में वृद्धि मिली । इसके बजाय व्यक्तिगत प्राथमिक या माध्यमिक कूप के आसपास केशिकाओं के एक यादृच्छिक वितरण के, 3 डी पुनर्निर्माण केशिकाओं का प्रदर्शन किया है कि कूप में वितरित केशिका शाखाओं बड़े कूप में detectable थे, और ज्यादातर मामलों में इन केशिका शाखाओं एक खोखले अंतरिक्ष (चित्रा 3) का गठन किया.

एक प्रमुख चिंता का विषय है कि अनुकूलित विधि अंडाशय स्पष्ट करने के लिए एक अपेक्षाकृत लंबे समय लेता है, लेकिन सबसे अच्छा समाशोधन प्रभाव के लिए लंबे समय की आवश्यकता है । कुछ समय बचाने के लिए, हम सभी आवश्यक नमूनों को एक समय पर एकत्रित करने और उन्हें एक साथ साफ़ करने की अनुशंसा करते हैं क्योंकि साफ़ किए गए ऊतकों को पंजाब में और ०.०२% सोडियम azide में कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । एक और सीमा के फोकल माइक्रोस्कोप का काम दूरी है । उच्च आवर्धन उद्देश्य लेंस छोटे काम दूरी है, जो मोटी नमूनों की इमेजिंग के लिए एक बाधा हो सकती है ।

कई प्रोटोकॉल पारदर्शी और बरकरार ऊतकों के इमेजिंग के लिए शुरू किया गया है, BABB20, स्केल21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, स्पष्टता16, निष्क्रिय स्पष्टता सहित (के साथ4 या बिना hydrogel25), समझौता12, घन26,27, FASTClear28, और वास्तव में29, लेकिन उनमें से केवल तीन पूरे डिम्बग्रंथि ऊतक समाशोधन और मूल्यांकन9के लिए इस्तेमाल किया गया है, 30,31. SeeDB30 और ScaleA231 पूरे डिंबग्रंथि के ऊतकों की इमेजिंग के लिए शुरू किया गया है, लेकिन इन प्रोटोकॉल केवल एक एकल immunostaining कदम की अनुमति । निष्क्रिय स्पष्टता, तथापि, कई प्रोटीन के लिए अनुमति देता है लेबल प्रतिक्रियाओं, के रूप में वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है और हमारे पिछले अध्ययन में9।

अंत में, हमारे तोंसिल्लितिस की परतों और रक्त वाहिकाओं के बीच 3 डी संरचनात्मक संबंध का निर्धारण करने के लिए पूरी स्पष्ट डिम्बग्रंथि ऊतक का उपयोग करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है angiogenesis अध्ययन के लिए विभिंन डिम्बग्रंथि रोगों में इस तरह के रूप में पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम और डिंबग्रंथि के कैंसर ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए चीनी विशेष कोष से Postdocs के लिए अनुदान का समर्थन किया गया था (no 2014T70392 yf), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (no. ८१६७३७६६ से yf), नई शिक्षक भड़काना कोष, फुदन विश्वविद्यालय के Zuoxue फाउंडेशन, और विकास शंघाई पीक विषयों की परियोजना-एकीकृत चिकित्सा (२०१५०४०७) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Vetec v900845 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)  Life Technologies A11039 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) Life Technologies A11012 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
Bisacrylamide Amresco 172 http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) Ted Pella 14032 http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) Sinopharm Chemical Reagent 10020318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClear Celexplorer FC-102 http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm Bemis PM996 http://www.parafilm.com/products
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) Abcam ab28364 http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azide Sigma S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent 10019318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) Sinopharm Chemical Reagent 20040718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfate Sinopharm Chemical Reagent 30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent 10019718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) Abcam ab76442 http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

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References

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बायोमेडिकल इंजीनियरिंग मुद्दा १३० तीन आयामी पुनर्निर्माण vasculature निष्क्रिय स्पष्टता माउस अंडाशय
निष्क्रिय स्पष्टता-साफ़ माउस अंडाशय के संवहनी वास्तुकला के तीन आयामी पुनर्निर्माण
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Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).

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