Summary
Aqui apresentamos uma adaptação do método de reconstrução 3D para visualização da vasculatura do ovário e capilares foliculares e clareza passiva em ovários intactos do mouse.
Abstract
O ovário é o principal órgão do sistema reprodutor feminino e é essencial para a produção de gametas femininas e para controlar o sistema endócrino, mas as relações estruturais complexas e arquiteturas tridimensionais (3D) vasculatura do ovário não são bem descritas. Para visualizar as conexões 3D e arquitetura dos vasos sanguíneos no ovário intacto, o primeiro passo importante é tornar o ovário opticamente claro. Para evitar o encolhimento do tecido, usamos o hidrogel baseado em fixação passiva CLARITY (lipídios claro-trocadas rígida do acrilamido-hibridizado imagem / Immunostaining/In situ da hibridação-compatível com hidrogel de tecido) método para limpar um ovário intacto de protocolo . Immunostaining, avançado do multiphoton microscopia confocal e imagem-reconstruções 3D foram então usados para a visualização dos vasos ovarianos e capilares foliculares. Usando essa abordagem, mostrou uma correlação positiva significativa (P < 0,01) entre o comprimento dos capilares foliculares e volume da parede folicular.
Introduction
O folículo é a unidade estrutural e funcional fundamental do ovário, e seu desenvolvimento está altamente relacionada com a vasculatura dentro do ovário. Vasos sanguíneos fornecer nutrição e hormônios para os folículos e, portanto, desempenhar um papel importante no crescimento e maturação dos folículos1.
Uma combinação de tecnologias, incluindo marcadores seletiva dos vasos sanguíneos, modelos do rato transgénico e desenvolvimento farmacêutico, aumentaram nosso conhecimento sobre redes vasculares no ovário, angiogênese e a função dos vasos sanguíneos Foliculogénese. O ovário é conhecido como um órgão ativo porque ele remodela vários tecidos e redes vasculares durante Foliculogénese e ovulação. Tal ativo remodela o tamanho e a estrutura dos vasos é necessária para a função biológica de desenvolvimento e de recrutamento de folículos.
Métodos tradicionais de histológica e histomorfométrica usando seções no ovário e immunolabeling dos vasos sanguíneos estão limitados a imagens bidimensionais (2D)2. Com o desenvolvimento de tecnologias de reconstrução tridimensional (3D), imagens em 2D de fatias de tecido podem ser sobrepostas para fazer uma estrutura 3D, mas esse método ainda tem algumas limitações — corte do tecido pode destruir as microestruturas, algumas partes do tecido são muitas vezes ausentes, e significativo trabalho está envolvido em fazer reconstruções 3D a partir de imagens obtidas de fatias. Imagem 3D todo-tecido com microscopia confocal pode ultrapassar muitas dessas limitações, mas esses métodos limitam-se à avaliação da angiogênese no ovário embrionário3. Usar o tecido inteiro limpando métodos tais como clareza4 pode aumentar o volume visualizado a fim de resolver estes problemas nos ovários pós-natal e adultos, e tais métodos fornecem acesso óptico do ovário sem deformações estruturais. Imagem da arquitetura 3D do ovário intacto fornece um banco de dados de imagem exata para software de análise de imagem, tais como o pacote de software hottie utilizado neste trabalho.
Remodelação do ovário durante a vida adulta é parte de um sistema fisiológico dinâmico, e isso faz com que o ovário um excelente modelo para investigações sobre a regulação da angiogênese. Além disso, avaliar o papel de vasos ovarianos em condições patológicas do sistema reprodutor feminino, tais como a síndrome do ovário policístico ou cancros ovarianos pode ser estudada através da imagem do tecido ovariano toda. O desenvolvimento do método passivo clareza e o uso de software de análise avançada de imagens apresentaram informações espaciais detalhadas sobre as relações entre os vasos sanguíneos e ovário estruturas tais como folículos.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais seguiram as orientações do Comitê de ética Animal em Xangai Medical College, Universidade de Fudan (número de aprovação 20160225-013).
1. preparação do ovário Mouse transparente
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Preparação das soluções
- Preparar a solução de tampão fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) com 0,1% Triton X-100 (PBST). Para fazer 1 L de solução estoque de PBS x 10, misture 87 g de NaCl, 3,1 g de NaH2PO4 · 2H2O e 28,7 g de Na2HPO4 ·12H2O. Adicionar dH2O distilada ~ 2 h. ajustar para pH 7,4 e 1 L com 1 N de NaOH e armazenam à temperatura ambiente. Diluir esta solução estoque 10 x por 1/10 usando O dH2e depois fazer 0,1% Triton X-100 em PBS.
- Prepare a solução de hidrogel (pH 7,5) por mixagens 4% (wt/vol) solução de paraformaldeído (PFA), 4% (wt/vol) acrilamida, bisacrylamide 0.05% (wt/vol) e iniciador de VA-044 0,25% (wt/vol) em água bidestilada no gelo.
- Prepare a solução de limpeza (pH 8,5) pela mistura de 200 mM de tampão de borato de sódio contendo 4% (wt/vol) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água bidestilada.
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Preparação de perfusão e ovário Transcardial
- Mantenha todas as soluções no gelo durante todos os procedimentos.
- Anestesia tipo selvagem feminino adulto C57BL/6 rato com uma injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital (0,35 mg/kg). Uma vez que ele não mostra nenhuma resposta do dedo do pé-pitada, o mouse corretamente é anestesiado.
- Uso de fita adesiva para fixar o mouse com os membros esticada sobre uma placa plana da espuma.
- Expor o coração por uma incisão no processo xifoide, através do tórax, pele e ossos, com uma tesoura.
- Fazer uma incisão no átrio direito do animal e em seguida perfundir o ventrículo esquerdo com 20 mL de PBS gelado 1 x 10 mL/min.
- Perfundir o animal com pelo menos 20 mL de solução de hidrogel em 10 mL/min.
- Incise a pele ao longo do abdômen ao longo da linha de medioventral com uma tesoura, que expõe o enterocoelia inteiro, e remover os intestinos. Recolha os ovários, bem como o útero para manter a integridade da morfologia ovariana.
- Remova os tecidos de gordura ao redor do ovário sob um microscópio.
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Desgaseificação
- Coloque os ovários em 10 mL de solução de hidrogel a 4 ° C para fixação por 3 dias.
- Transferência do ovário em um tubo de 5 mL e encher o tubo com solução de hidrogel. Esticar o parafilm sobre a parte superior do tubo e em seguida, enrole parafilm ao redor do pescoço do tubo.
Cuidado: Certifique-se que não há nenhuma bolha entre o parafilm e a solução de hidrogel. - Coloque o tubo num agitador na incubadora a 37 ° C por um período máximo de 3 h para permitir que o hidrogel polimerizar.
- Remover o ovário do gel usando uma espátula e remova cuidadosamente o excesso de gel ao redor do ovário por lenços de papel. Lave o ovário quatro vezes com PBS 1x.
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Compensação passiva
- Submergi o ovário em 10 mL da solução de limpeza. Agite suavemente a 80 rpm a 37 ° C para iniciar o processo de compensação.
- Na primeira semana, altere a solução em 3 dias. Depois de uma semana, atualize a solução de limpeza uma vez por semana até o ovário torna-se claro. Geralmente este processo demora cerca de 2-3 semanas.
Nota: O ovário pode ser diretamente immunostained ou pode ser armazenado em azida de sódio (0,02%) em PBS a 4 ° C, durante várias semanas antes de imunocoloração.
2. imunocoloração
- Lave o ovário duas vezes em PBST no dia 1 a 37 ° C, um agitador.
- Incubar o ovário num agitador na solução de anticorpos primários/PBST (tabela 1) no dia 2-3 a 37 ° C. No trabalho apresentado aqui, os anticorpos primários foram a molécula de adesão plaquetária-endothelial da pilha 1 (CD31) e tirosina hidroxilase diluído em 01:10 e 01:50 em PBST, respectivamente.
Cuidado: Se são usados dois ou mais tipos de anticorpo primário, certifique-se que existem diferentes fontes animais. - Lave os anticorpos primários com tampão PBST a 37 ° C no dia 4, um agitador.
- Incube o ovário com os desejado anticorpos secundários em PBST no dia 5-6 a 37 ° C, um agitador. O trabalho aqui apresentado, os anticorpos secundários foram Alexa 488 farinha para tirosina hidroxilase e Alexa farinha 594 para CD31 diluído em 01:50 em PBST.
- Lave os anticorpos secundários com tampão PBST a 37 ° C no dia 7 um agitador.
- Transferi o tecido para índice de refração correspondente solução para homogeneização de índice de refração no dia 8. Colocar o tecido em um papel com linhas de grade para verificar sua clareza visual, verificando se as linhas de grade podem ser vistas. Uma vez que o tecido tem sido totalmente esclarecido, isso pode ser fotografado.
- Faça um cilindro de massa que poderia envolve apenas o tecido e então moldá-la em forma de ferradura e pressione o cume exterior firmemente na placa de vidro para fazer um espaço fechado. A altura da massa deve ser um pouco mais alta do que o ovário.
- Coloque o ovário esclareceu cuidadosamente no centro do putty e adicionar solução de correspondência de índice de refração. Coloque um prato fundo de vidro sobre o putty firmemente e use massa para consertar o prato.
3. Confocal da microscopia
- Para a imagem latente com um microscópio confocal, no painel "Ni-E" escolha a lente (em imersão neste caso água 25 X lente objetiva, 1.1-NA, 2 mm-WD) com a distância de trabalho adequada (nesse caso 2,0 mm).
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No painel de "Aquisição", selecione o número de canais. Aqui, use três canais.
- Primeiro, use a guia "porto de olho" e o joystick de controlador XY para mover o tecido para o centro do campo, verificando através das oculares do microscópio.
- Depois de desligar a luz do obturador, clique na guia "ao vivo" para ajustar o "poder do laser", "HV (ganho)", e "deslocamento" para cada canal separadamente. Maior potência do laser e a alta tensão podem levar a sinais de maiores e maior deslocamento pode reduzir o ruído de fundo.
- Selecione o tamanho adequado"Scan" e "Count". Use um tamanho de varredura de 1024 x 1024 µm2 e uma contagem de 4 a 8.
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Depois de definir a qualidade de imagem para definir a profundidade do tecido no painel "Correção de intensidade de Z" e depois localizar a lente na camada superior do ovário (no centro do tecido) e ajuste a aquisição para a camada superior, clique o "plus" botão para definir a camada superior.
- Mover a lente para baixo e definir o HV apropriado e poder do laser para a parte inferior do tecido e adicionar as informações de camada mais baixas na tabela de correção de Z-intensidade. Clique em "Ao ND" para sincronizar a configuração com o painel de "Aquisição de ND".
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Painel em "ND aquisição", primeiro conjunto, o número de digitalização passos. Em seguida, marque as guias "Z" e "Imagem grande".
- Vá para a janela de "Varredura de imagem grande" para definir o tamanho do campo de acordo com a borda do tecido com a ajuda de visualização do tecido através das oculares. Volte para o painel de "Aquisição de ND" para o tamanho da área de digitalização ("campos") de entrada e escolha a sobreposição entre 10% e 15%.
- Clique em "Run Z correção", não "executar agora", para automaticamente definir o HV, poder do laser e deslocamento apropriado para cada camada e esperar a imagem processar.
4. 3D reconstrução de folículos individuais e seus Vasculatures
- Primeiro, use o ImageJ5 para abrir o arquivo original do NIS. Clique no botão "Imagem" e escolher a "cor" e os canais de"Split". Em seguida, clique em "Arquivo" e salve separadamente os canais como série de arquivo tiff usando a opção de "Sequências de imagem" em "Salvar como".
- Use Imaris para abrir uma das séries de arquivo tiff. Clique no botão "Editar" e escolha "Adicionar canais" para adicionar o resto dos canais. O nome e a cor do canal podem ser alterados nas guias "Ajuste de tela". A espessura do tecido talvez precise ser corrigido no painel "Propriedades da imagem" na lista drop-down sob "Editar".
- Para o corte das imagens finais e remoção de excesso peças 3D, clique no botão "Editar" e escolha "Crop 3D". O tamanho do campo pode ser ajustado arrastando a borda.
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Para reconstruir os sinais de navio com o algoritmo de filamentos no painel Surpass, clique no botão "Filamentos" para criar um novo filamento e clique em Avançar.
- Para definir o maior e o mais fino diâmetro, vá para o painel de "Fatia" e encontrar o navio de rastreamento. A distância será automaticamente mostrada no painel "Medida", selecionando dois pontos com a largura máxima da embarcação.
- Voltar para o painel "Surpass" e a medida largura de entrada e clique em Avançar.
- Ajuste o limite de ponto de partida e sementes. No painel "Câmera", escolha "Selecionar". Se algumas das esferas automaticamente produzidas precisam ser removidos, Pressione shift e clique no ponto. Escolhendo a "Navegar" e movendo o mouse, a estrutura pode ser girada para garantir que todos os pontos corretos foram mantidos e clique em Avançar.
- Escolher o limite mais alto para o contraste local e clique em Avançar. Não selecione "Detectar espinhos" e continuar finalizar a reconstrução do cilindro vaso sanguíneo. A cor pode ser editada clicando na aba "Cores". Os dados estatísticos podem ser extraídos no painel "Estatística" do filamento reconstruído. Peças em excesso podem ser removidas do painel de "Editar".
Nota: Outros algoritmos podem ser usados para medir o volume dos folículos totais ou paredes foliculares. O trabalho aqui apresentado, os oócitos foram marcados pela autofluorescência de ambos os anticorpos secundários. Devido à grande quantidade de dados, utilizou-se um servidor de estação de trabalho para a análise de dados.
5. análise estatística
Nota: Dados de análise de imagem são apresentados como média ± erros-padrão.
- Realizar comparações entre os folículos usando teste t de amostras independentes e usar o teste de correlação de Pearson para comparar os coeficientes de correlação da parede folicular e comprimento capilar. Definir um valor de P < 0,05 como o limite de significância estatística.
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Representative Results
Adaptamos o método passivo de clareza em um método rápido e simples para limpar enquanto preserva a arquitetura folicular e vascular e obtendo o maior sinal fluorescente de marcadores rotulados de navios e folículos do ovário passivo. A arquitetura 3D da vasculatura folicular foi determinada por imunocoloração para CD31, um marcador para células endoteliais6. CD31 coloração nos ovários de camundongos adultos foi rastreado usando o algoritmo de filamento e mostrou as inter-relações entre capilares foliculares e folículos primários e secundários (Figura 1).
A transformação de Spot e algoritmos de superfície foram usados para detectar os oócitos de tirosina hidroxilase-immunostained e granulosa e camadas de thecal e para calcular o volume total de folículos7,8. Por causa da compactação dos folículos, algumas partes dos folículos cortados foram identificados semi manualmente. Após a transformação do lugar do volume individual folicular e oócitos e reconstrução de superfície das camadas da parede folicular e reconstrução de filamento dos vasos, limpar relacionamentos entre vasculatures foliculares individuais e o outro os índices medidos, especialmente a granulosa e a camada thecal volumes, foram observados (Figura 2).
Figura 1 : Imagens de alta resolução de um ovário de rato adulto intacto após a limpeza com o protocolo adaptado de clareza passivo. (A-B) Seções e XYZ-scan amplo aquisição. Três dimensões (3D) cortadas secundário (C) e folículos primários de (D) (linha superior) e 3D reconstruída capilares, oócitos e granulosa/thecal células do folículo mesmo (linha inferior) são mostradas como identificado pelo filamento, superfície, e Algoritmos de transformação local. Escala de barras = 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Índices comparativos das relações entre folículos ovarianos primários e secundários e suas vasculatures. O volume de oócito (A) foi extraído após reconstruções 3D de volume folicular e ovócitos em folículos individuais, conforme determinado pelo algoritmo de transformação do local, e o volume da parede folicular (B) foi determinado pela superfície algoritmo e os capilares foram rastreados pelo algoritmo do filamento. O volume folicular (C) a taxa de extensão de volume/capilar do oócito (D), a taxa de extensão de volume/capilar de parede folicular (E), a taxa de extensão de volume/capilar folicular (F), o comprimento capilar (H) e o correlação de comprimento capilar e o volume de parede folicular (G) foram calculados utilizando as ferramentas adequadas no pacote de software. Barras de erro representam os erros de padrão dos meios. n = 6; * P < 0,05; * * P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Reconstrução tridimensional de capilares em folículos secundários do ovário rato. Isto revela um espaço oco acima do lado do oócito dos folículos (quadrados brancos mostram as fronteiras do espaço). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No estudo atual, apresentamos a imagem para avaliar as relações entre os capilares e folículos de crescimento individuais 3D. Em nosso trabalho anterior, usando o mesmo protocolo n º 9, estudamos os papéis de grande vascularização, interações entre os folículos e a localização de folículos nos ovários intactos do mouse. A abordagem passiva de clareza nos permitiu estudar macro e micro --vasculatures, Foliculogénese e as inter-relações entre o alaranjado e folículos, bem como para reconstruir a arquitetura ovariana em diferentes estádios de desenvolvimento.
Para obter dados de imagem 3D de tecidos intactos, o processo de limpeza é o primeiro passo importante. Existem duas estratégias principais — métodos de desidratação e métodos baseados em reagente hidrofílicos, tais como passiva CLARITY10. Porque métodos de desidratação, muitas vezes levam a uma diminuição sinais fluorescentes e muitas vezes produzem resíduos tóxicos orgânicos solução, temos focado nossa atenção na simplificação de algumas etapas do método clareza passiva para uso com vários tipos de tecido.
O primeiro procedimento crítico no processo de compensação é a perfusão transcardial. Durante a perfusão, coração bombeando desempenha um papel importante na circulação de solução de PBS e hidrogel, que pode expulsar o sangue a fim de diminuir a fluorescência de fundo todo o corpo. Assim, a cirurgia de perfusão deve ser executada com precisão e rapidamente evitar a morte prematura do animal antes do hidrogel é completamente distribuída durante todo o animal. Todos os agentes devem ser mantidos no gelo durante todo o experimento, como mencionado por Liang et al 11, ou eles vão começar a polimerizar-se antes da conclusão da perfusão. O próximo passo importante é remover o hidrogel, e é necessário remover como muito excesso de gel quanto possível porque reterá anticorpos. Uma vez que o tecido estiver desmarcado, deve ser removido da solução clareira e armazenado em PBS a 4 ° C, porque muito tempo na solução de limpeza causará muita proteína ser perdido. Na imagem de microscopia confocal, as Z-configurações sempre devem ser definidas antes do intervalo X-Y. Se o intervalo de X-Y é definido primeiro, as Z-configurações não podem ser sincronizadas para todo o campo X-Y.
CLAREZA passiva foi introduzido pela primeira vez por Yang et al . 12 em seu protocolo, eles não executar a etapa de perfusão em em vez disso desgaseificados com nitrogênio. Além disso, sua solução de compensação não incluiu bisacrylamide na solução hidrogel, usaram 8% SDS na solução de limpeza, e eles usaram aros para índice de refração, correspondendo a mídia. Este método foi posteriormente melhorado aumentando a concentração de SDS13, adicionando a etapa de perfusão e procedimento desgaseificação livre de nitrogênio14e combinando o método com outros métodos de limpeza como PARS-mPACT15. Aqui, nós desenvolvemos ainda mais o protocolo combinando transcardial perfusão e livre de nitrogênio desgaseificação, diminuindo o SDS na clareira solução a 4%, e usando FocusClear como o índice de refração, combinando meios de comunicação, que fornece a melhor qualidade imagens de microscopia.
Depois passiva CLARITY, confocal do multiphoton microscopia e análise de imagem pode ser realizada para obter a arquitetura 3D intacta da vasculatura folicular ovariana. Este protocolo transforma um ovário intacto não-luz-permeável em uma forma de nanoporous hidrogel-hibridizado opticamente transparente que é apropriada para a penetração de macromoléculas tais como anticorpos16. Ao contrário do clássicas 2D secionais análises histológicas, passiva a clareza e a coloração com marcadores específicos permite o mapeamento 3D de relacionamentos entre capilares e folículos de crescimento individuais.
Em tecidos adultos, remodelação vascular ativo e angiogênese ocorre principalmente durante processos patológicos como a cicatrização de feridas, reparação de fratura, tumor e metástases formações, retinopatias, fibroses e artrite reumatoide17. No entanto, alterações cíclicas durante Foliculogénese representam uma capacidade única para a remodelação da vasculatura. Após a formação do antro em folículos secundários, fluido folicular preenche-lo e circunda o oócito, que fornece um microambiente adequado para maturação do oócito e desenvolvimento folicular18. Anterior 2D imagem estudos mostraram que os folículos ovarianos são cercados por uma rede de capilares na theca interna19. A camada granulosa é nonvascular, e cada folículo está rodeado por seus próprios capilares. Consistente com o papel essencial do CD31 em vasculogenesis6, encontramos um aumento no comprimento capilar durante Foliculogénese na transição da primária de folículos secundários (figuras 2 e H 2). Em vez de uma distribuição aleatória dos capilares ao redor dos folículos primários ou secundários individuais, reconstrução 3D de capilares demonstrou que capilar filiais distribuídas em folículos eram detectáveis em folículos maiores e na maioria dos casos estas Ramos capilares formaram um espaço oco (Figura 3).
Uma grande preocupação é que o método adaptado leva um tempo relativamente longo para limpar o ovário, mas o tempo é necessário para o melhor efeito de compensação. Para poupar tempo, recomendamos coletar todas as amostras necessárias ao mesmo tempo e limpá-los juntos, porque os tecidos limpos podem ser armazenados em PBS e 0,02% de azida de sódio a 4 ° C por vários meses. Outra limitação é a distância de funcionamento do microscópio confocal. Lentes objetivas de maior ampliação têm distâncias mais curtas de trabalho, que poderiam ser um obstáculo para a imagem latente de amostras espessas.
Vários protocolos foram introduzidos para o tratamento de imagens de tecidos transparentes e intactos, incluindo BABB20, escala21, 3DISCO22, Clear23, SeeDB24, clareza16, clareza passiva (com4 ou sem hidrogel25), o pacto12, cúbico26,27, FASTClear28e de fato29, mas apenas três deles têm sido usados para tecido todo limpando e avaliação9, 30,31. SeeDB30 e ScaleA231 foram introduzidos para a imagem latente de tecidos toda no ovário, mas esses protocolos só permitem um único immunostaining passo. CLAREZA passiva, entretanto, permite múltiplas reações de proteína-rotulagem, conforme mostrado no presente estudo e no nosso anterior estudo9.
Em conclusão, nosso protocolo adaptado para determinação das relações estruturais 3D entre camadas foliculares e vasos sanguíneos utilizando tecido ovariano toda esclareceu fornece uma nova abordagem para estudar a angiogênese em doenças dos ovários diferentes tais como Síndrome dos ovários policísticos e câncer de ovário.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por subvenções do fundo especial chinesa para pós-docs (n º 2014T70392 de YF), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n º 81673766 de YF), o novo fundo de escorva de professor, a Fundação de Zuoxue da Universidade de Fudan e o desenvolvimento Projeto de Shanghai pico medicina integrativa-disciplinas (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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