Summary
Qui presentiamo un adattamento del passivo chiarezza e metodo di ricostruzione 3D per la visualizzazione del vasculature ovarico e capillari follicolari nelle ovaie intatte del mouse.
Abstract
L'ovaio è il principale organo dell'apparato riproduttivo femminile ed è essenziale per la produzione di gameti femminili e per il controllo del sistema endocrino, ma le complesse relazioni strutturali e le architetture di sistema vascolare (3D) tridimensionale della ovaia non sono ben descritti. Per visualizzare le connessioni 3D e architettura dei vasi sanguigni nell'ovaia intatta, il primo importante passo è di rendere l'ovaia otticamente chiaro. Per evitare il restringimento del tessuto, abbiamo usato l'idrogel basati su fissazione passiva chiarezza (chiaro del lipido-scambiati rigida di acrilamide-ibridato idrogel tessuto Imaging / Immunostaining/In situ ibridazione-compatibile) metodo per cancellare un'ovaia intatta di protocollo . Immunostaining, microscopia confocale multifotonica avanzata e immagine-ricostruzioni 3D poi sono stati utilizzati per la visualizzazione dei vasi ovarici e capillari follicolari. Utilizzando questo approccio, abbiamo mostrato una correlazione positiva significativa (P < 0,01) tra la lunghezza dei capillari follicolari e volume della parete follicolare.
Introduction
Il follicolo è l'unità fondamentale strutturale e funzionale dell'ovaia, e suo sviluppo è altamente relativo al sistema vascolare all'interno dell'ovaio. Vasi sanguigni fornire nutrizione e ormoni ai follicoli e quindi svolgono un ruolo importante nella crescita e maturazione dei follicoli1.
Una combinazione di tecnologie, tra cui marcatori selettivi del vaso sanguigno, modelli murini transgenici e sviluppo farmaceutico, hanno aumentato la nostra conoscenza sulle reti vascolari ovarici, l'angiogenesi e la funzione dei vasi sanguigni nei follicologenesi. L'ovario è conosciuto come un organo attivo perché rimodella vari tessuti e reti vascolari durante la follicologenesi e dell'ovulazione. Tale rimodellamento attivo con le dimensioni e la struttura dei vasi è richiesto per la funzione biologica di sviluppo e reclutamento follicoli.
Tradizionali metodi istologici ed istomorfometrici utilizzando sezioni ovarici e immunolabeling dei vasi sanguigni sono limitati a immagini bidimensionali (2D)2. Con lo sviluppo di tecnologie di ricostruzione tridimensionale (3D), immagini 2D delle fette del tessuto possono essere sovrapposta per rendere una struttura 3D, ma questo metodo ha ancora alcune limitazioni — sezionamento del tessuto può distruggere le microstrutture, alcune parti della tessuto spesso mancano, e significativo lavoro è coinvolto nella fabbricazione di ricostruzioni 3D da immagini ottenute dalle fette. Intero-tessuto imaging 3D con microscopia confocale possono superare molte di queste limitazioni, ma questi metodi sono limitati alla valutazione dell'angiogenesi in ovaia embrionali3. Usando il tessuto intero metodi come chiarezza4 di compensazione può aumentare il volume visualizzato in modo da risolvere questi problemi in ovaie postnatale e adulte, e tali metodi forniscono spazio ottico dell'ovaia senza deformazioni strutturali. Imaging dell'architettura 3D dell'ovaia intatta fornisce un database di immagini precise per software di analisi di immagine, ad esempio il pacchetto di software di Imaris utilizzato in questo lavoro.
Rimodellamento dell'ovaia durante l'età adulta è parte di un sistema dinamico di fisiologico, e questo rende l'ovaia un eccellente modello per indagini nel regolamento dell'angiogenesi. Inoltre, valutare il ruolo dei vasi sanguigni ovarici in condizioni patologiche del sistema riproduttivo femminile come sindrome dell'ovaio policistico o cancri ovarici può essere studiato attraverso formazione immagine del tessuto ovarico intero. Lo sviluppo del metodo chiarezza passivo e l'uso del software di analisi avanzata delle immagini hanno fornito dettagliate informazioni spaziali sui rapporti tra vasi sanguigni e strutture ovariche come follicoli.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguito le linee guida del Comitato di etica animale a Shanghai Medical College, Fudan University (numero di omologazione 20160225-013).
1. preparazione dell'ovaia Mouse trasparente
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Preparazione delle soluzioni
- Preparare la soluzione tampone fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) con 0,1% Triton X-100 (PBST). Per fare 1 L di soluzione stock di 10 x PBS, mescolare 87 g di NaCl, 3,1 g di NaH2PO4 · 2H2O e 28,7 g di Na2HPO4 ·12H2O. aggiungere dH2O a 1 L e mescolare ~ 2 h. regolare a pH 7.4 con 1 N NaOH e conservare a temperatura ambiente. Diluire questa soluzione stock di 10 x di 1/10 utilizzando dH2O e poi fare 0.1% Triton X-100 in PBS.
- Preparare la soluzione di idrogel (pH 7,5) da mescolamenti 4% (wt/vol) soluzione di paraformaldeide (PFA), 4% (wt/vol) di acrilammide, 0,05% (wt/vol) bisacrylamide e 0,25% (wt/vol) VA-044 iniziatore in acqua bidistillata sul ghiaccio.
- Preparare la soluzione di schiarimento (pH 8.5) con 200 mM di tampone borato di sodio contenente 4% (wt/vol) sodio dodecil solfato (SDS) in acqua bidistillata.
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Preparazione di aspersione e ovaia di perfusione
- Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio durante tutte le procedure.
- Anestetizzare mouse C57BL/6 adulto femmina wild-type con un'iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital (0,35 mg/kg). Una volta non si vede nessuna risposta di punta-pizzico, è possibile che il mouse correttamente è anestetizzato.
- Utilizzare nastro adesivo per fissare il mouse con le membra tese su una tavola piatta schiuma.
- Esporre il cuore da un'incisione sul processo xifoideo attraverso il petto, la pelle e ossa con le forbici.
- Praticare un'incisione nell'atrio di destra dell'animale e poi irrorare il ventricolo sinistro con 20 mL di PBS 1X ghiacciata a 10 mL/min.
- Irrorare l'animale con almeno 20 mL di soluzione di idrogel a 10 mL/min.
- Incidere la pelle sopra l'addome lungo la linea di medioventral con le forbici, che espone l'intera polifiletismo, e rimuovere gli intestini. Raccogliere le ovaie, come pure l'utero per mantenere l'integrità della morfologia ovarica.
- Rimuovere i tessuti grassi intorno l'ovaia sotto un microscopio.
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Degasaggio
- Posizionare le ovaie in 10 mL di soluzione idrogel a 4 ° C per la fissazione per 3 giorni.
- Trasferimento dell'ovaia in una provetta da 5 mL e riempire la provetta con la soluzione di idrogel. Parafilm si estendono sopra la parte superiore del tubo e poi avvolgere parafilm intorno al collo del tubo.
Attenzione: Accertarsi che non ci sono bolle tra il parafilm e la soluzione di idrogel. - Posizionare il tubo su un agitatore in incubatore a 37 ° C per un massimo di 3 h per consentire l'idrogel di polimerizzare.
- Rimuovere l'ovaio dal gel con una spatola e rimuovere con cura il gel in eccesso da intorno ovaia di carta velina. Lavare l'ovaia quattro volte con PBS 1X.
-
Compensazione passiva
- Immergere l'ovaia in 10 mL di soluzione di schiarimento. Agitare delicatamente a 80 giri/min a 37 ° C per avviare il processo di schiarimento.
- Nella prima settimana, cambiare la soluzione ogni 3 giorni. Dopo una settimana, è necessario aggiornare la soluzione di compensazione una volta a settimana fino all'ovario diventa chiara. Questo processo richiede solitamente circa 2-3 settimane.
Nota: L'ovaia può essere direttamente immunostained o possa essere memorizzato in sodio azide (0,02%) in PBS a 4 ° C per diverse settimane prima che immunostaining.
2. Immunostaining
- Lavare l'ovaio due volte in PBST il 1 giorno a 37 ° C in un agitatore.
- Incubare l'ovaia su un agitatore in soluzione di anticorpi primari/PBST (tabella 1) il giorno 2-3 a 37 ° C. Nel lavoro presentato qui, gli anticorpi primari erano la molecola di adesione cellulare endoteliale della piastrina 1 (CD31) e della tirosina idrossilasi diluito a 01:10 e 01:50 in PBST, rispettivamente.
Attenzione: Se vengono utilizzati due o più tipi di anticorpo primario, assicurarsi che ci sono diverse fonti animali. - Lavare gli anticorpi primari con tampone PBST a 37 ° C il giorno 4 su un agitatore.
- Incubare le ovaia con gli anticorpi secondari desiderati in PBST il giorno 5-6 a 37 ° C in un agitatore. Nel lavoro qui presentato, gli anticorpi secondari erano Alexa farina 488 tirosina idrossilasi e Alexa 594 di farina per CD31 diluito a 01:50 in PBST.
- Lavare gli anticorpi secondari con tampone PBST a 37 ° C il giorno 7 su un agitatore.
- Trasferire il tessuto nella soluzione corrispondente indice di rifrazione per l'omogeneizzazione di indice di rifrazione il giorno 8. Mettere il tessuto su una carta con la griglia per controllare la sua chiarezza visiva controllando se le linee della griglia può essere visto. Una volta che il tessuto è stato completamente chiarito, possono essere imaged.
- Fa un cilindro mastice che potrebbe solo circonda il tessuto, modellarlo a forma di ferro di cavallo e premere la cresta esterna strettamente su una lastra di vetro al fine di rendere uno spazio sigillato. L'altezza dello stucco deve essere un po' più alto di ovaia.
- Disporre l'ovaia chiarificato con cura nel centro dello stucco e aggiungere la soluzione di corrispondenza di indice di rifrazione. Mettere un piatto con fondo di vetro sopra lo stucco strettamente e utilizzare putty per fissare il piatto.
3. microscopio confocale
- Per l'imaging con un microscopio confocale, nel pannello "Ni-E" scegliere l'obiettivo (in questa immersione di acqua causa 25 X lente obiettiva, 1.1-NA, 2 mm-WD) con la corretta distanza di lavoro (in questo caso 2.0 mm).
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Nel pannello "Acquisizione", selezionare il numero di canali. Qui, utilizzare tre canali.
- In primo luogo, utilizzare la scheda "occhio porta" e il joystick di XY per spostare il tessuto al centro del campo controllando attraverso gli oculari del microscopio.
- Dopo aver spento la luce dell'otturatore, fare clic sulla scheda "live" per regolare il "potere del laser", "HV (guadagno)", e "offset" per ogni canale separatamente. Aumento della potenza laser e HV può portare a segnali più alta, e offset superiore può ridurre il rumore di fondo.
- Selezionare la dimensione corretta"Scan" e "Totali". Utilizzare un formato di scansione di 1024x1024 µm2 e un conteggio di 4 a 8.
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Dopo aver impostato la qualità dell'immagine per definire la profondità del tessuto nel pannello "Correzione di intensità di Z" e dopo aver individuato l'obiettivo sul livello più alto dell'ovaia (nel centro del tessuto) e l'acquisizione per lo strato superiore di regolazione, fare clic sul "più" pulsante per definire il livello superiore.
- Spostare la lente verso il basso e impostare la HV appropriato e la potenza del laser per la parte inferiore del tessuto e aggiungere le informazioni di livello più basse nella tabella di correzione Z-intensità. Fare clic su "A ND" per sincronizzare le impostazioni con il pannello di "Acquisizione ND".
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Pannello in "ND acquisizione", prima serie, il numero di scansione passi. Poi, spuntare le schede "Z" e "Grande immagine".
- Passare alla finestra "Scansione grande immagine" per definire le dimensioni del campo secondo il bordo del tessuto con l'aiuto di visualizzazione del tessuto attraverso gli oculari. Tornare al pannello "Acquisizione ND" immettere le dimensioni dell'area di scansione ("campi") e scegliete la sovrapposizione tra 10% e 15%.
- Fare clic su "Esegui Z correzione", non "Esegui ora", automaticamente impostare il corretto HV, potenza laser e offset per ogni strato, e attendere che l'immagine da elaborare.
4. 3D ricostruzione dei singoli follicoli e loro Vasculatures
- In primo luogo, utilizzare ImageJ5 per aprire il file originale di NIS. Fare clic sul pulsante "Immagine" e scegliere il "colore" e i "canali di Spalato". Fare clic su "File", quindi salvare separatamente i canali come serie di file tiff utilizzando l'opzione "Sequenze di immagini" in "Salva come".
- Utilizzare Imaris per aprire una delle serie di file tiff. Fare clic sul pulsante "Modifica" e scegli "Aggiungi canali" per aggiungere il resto dei canali. Il nome e il colore del canale può essere cambiati nelle schede "Regolazione del Display". Lo spessore del tessuto potrebbe essere necessario essere corretto nel pannello "Proprietà immagine" nell'elenco a discesa sotto "Modifica".
- Per il ritaglio 3D immagini finali e la rimozione di parti in eccesso, fare clic sul pulsante "Modifica" e scegliete "Crop 3D". La dimensione del campo può essere regolata trascinando il bordo.
-
Per ricostruire i segnali di nave con l'algoritmo di filamenti nel pannello Surpass, fare clic sul pulsante "Filamenti" per creare un nuovo filamento e fare clic su Avanti.
- Al fine di definire il più grande e il diametro più sottile, andate al pannello "Slice" e trovare la nave di tracciatura. La distanza viene automaticamente visualizzata sul pannello di "Misura" selezionando due punti presso la larghezza massima della nave.
- Tornare al pannello di "Superare" e la larghezza misurata in ingresso e fare clic su Avanti.
- Regolare la soglia di punto di partenza e seme. Nel pannello "Fotocamera", scegliere "Seleziona". Se è necessario rimuovere alcune delle sfere prodotte automaticamente, premere MAIUSC e fare clic sul punto. Scegliendo "Navigate" e spostando il mouse, la struttura può essere ruotata per garantire che tutti i punti corretti sono stati mantenuti e quindi fare clic su Avanti.
- Scegli la soglia massima per il contrasto locale e fare clic su Avanti. Non selezionare "Rilevare spine" e continuare finalizzare la ricostruzione del cilindro del vaso sanguigno. Il colore può essere modificato facendo clic sulla scheda "Colore". I dati statistici possono essere estratti nel pannello "Statistica" del filamento ricostruito. Parti in eccesso possono essere rimosso nel pannello "Edit".
Nota: Altri algoritmi possono essere utilizzati per misurare il volume totale follicoli o pareti follicolari. Nei lavori presentati qui, gli ovociti sono stati caratterizzati dall'autofluorescenza di entrambi gli anticorpi secondari. A causa della grande quantità di dati, un server di workstation è stato utilizzato per l'analisi dei dati.
5. elaborazione statistica
Nota: Dati di analisi di immagine sono presentati come mezzi ± errori standard.
- Eseguire confronti tra i follicoli usando campioni indipendenti t-test e utilizzare test di correlazione di Pearson per confrontare i coefficienti di correlazione della parete follicolare e lunghezza capillare. Impostare un valore di P < 0,05 come limite della significatività statistica.
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Representative Results
Abbiamo adattato il metodo passivo di chiarezza in un metodo semplice e rapido per l'ovaia passiva di compensazione preservando l'architettura follicolare e vascolare e ottenere il più alto segnale fluorescente da marcatori con etichettati delle navi e dei follicoli. L'architettura 3D del vasculature follicolare è stata determinata immunostaining per CD31, un indicatore per le cellule endoteliali6. CD31 colorazione nelle ovaie di topi adulti è stata tracciata utilizzando l'algoritmo di filamento e ha mostrato correlazioni fra capillari follicolari e follicoli primari e secondari (Figura 1).
La trasformazione di Spot e algoritmi di superficie sono stati utilizzati per rilevare i oocytes di tirosina idrossilasi-immunostained e granulosa e strati thecal e calcolare il volume totale di follicoli7,8. A causa della compattazione dei follicoli, alcune parti dei follicoli ritagliate sono stati identificati semi-manualmente. Dopo la trasformazione di posto del singolo volume follicolare e ovociti e ricostruzione della superficie degli strati della parete follicolare e ricostruzione di filamento dei vasi, deselezionare relazioni tra singoli vasculatures follicolare e l'altro gli indici misurati, soprattutto granulosa e volumi thecal strato, sono stati osservati (Figura 2).
Figura 1 : Imaging ad alta risoluzione di un'ovaia di topo adulto intatto dopo compensazione con il protocollo adattato passivo chiarezza. (A-B) Sezioni XYZ grande-scansione e acquisizione. Tridimensionale (3D) ritagliata secondaria (C) e follicoli primari (D) (riga superiore) e 3D ricostruito capillari, ovociti e granulosa/thecal cellule del follicolo stesso (riga inferiore) sono indicate come identificato dal filamento, superficie, e Algoritmi di trasformazione spot. Scala bar = 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Indici comparativi dei rapporti tra follicoli ovarici primari e secondari e loro vasculatures. Il volume degli ovociti (A) è stata estratta dopo ricostruzioni 3D di volume follicolare e ovociti nei singoli follicoli come determinato dall'algoritmo di trasformazione di posto, e il volume di parete follicolare (B) è stato determinato dalla superficie algoritmo e i capillari sono stati rintracciati dall'algoritmo filamento. Il volume follicolare (C), il rapporto di lunghezza di volume/capillare degli ovociti (D), il rapporto di lunghezza di volume/capillare parete follicolare (E), il rapporto di lunghezza di follicolare volume/capillare (F), la lunghezza capillare (H) e la correlazione di lunghezza capillare e volume parete follicolare (G) sono stati calcolati utilizzando gli strumenti appropriati nel pacchetto software. Barre di errore rappresentano gli errori standard dei mezzi. n = 6; * P < 0,05; * * P < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ricostruzione tridimensionale dei capillari in follicoli secondari dell'ovaia mouse. Questo rivela uno spazio vuoto sopra il lato di ovocita dei follicoli (quadrati bianchi mostrano i confini dello spazio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nello studio corrente, presentiamo 3D imaging per valutare le relazioni fra capillari e singoli follicoli crescente. Nel nostro lavoro precedente utilizzando il protocollo stesso 9, abbiamo studiato i ruoli di grande sistema vascolare, interazioni tra follicoli piliferi e la posizione dei follicoli nelle ovaie intatte del mouse. L'approccio passivo di chiarezza ci ha permesso di studiare le interrelazioni tra i corpi lutei e follicoli anche di ricostruire l'architettura ovarico a diversi stadi di sviluppo, follicologenesi e micro - e macro-vasculatures.
Per ottenere i dati di immagine 3D dei tessuti intatti, il processo di schiarimento è il primo passo importante. Ci sono due strategie principali — metodi di disidratazione e metodi basati su reagente idrofili, come passiva chiarezza10. Perché disidratazione metodi spesso portano ad una diminuzione in segnali fluorescenti e spesso producono rifiuti tossici soluzione organica, abbiamo concentrato la nostra attenzione sulla semplificazione di alcuni passaggi del metodo chiarezza passivo per l'uso con vari tipi di tessuto.
La prima procedura critica nel processo di schiarimento è la perfusione di perfusione. Durante la perfusione, cuore di pompaggio svolge un ruolo importante nella circolazione corpo intero della soluzione PBS e idrogel, che può scovare il sangue in modo da ridurre la fluorescenza di fondo. Così, la chirurgia di perfusione deve essere eseguita con precisione e rapidamente per evitare la morte prematura dell'animale prima l'idrogel è completamente distribuito durante l'animale. Tutti gli agenti devono essere tenuti sul ghiaccio durante l'intero esperimento, come detto da Liang et al. 11, o essi inizieranno a polimerizzare prima la perfusione è completa. Il prossimo passo importante è la rimozione l'idrogel, ed è necessario rimuovere come gel molto in eccesso come possibile perché manterrà gli anticorpi. Una volta che il tessuto è deselezionato, dovrebbe essere rimosso dalla soluzione schiarimento e memorizzata in PBS a 4 ° C, in quanto troppo tempo nella soluzione di schiarimento causerà troppe proteine andranno persi. Nell'imaging microscopia confocale, le impostazioni di Z devono essere sempre impostate prima l'intervallo di X-Y. Se l'intervallo di X-Y è impostato giù in primo luogo, non è possibile sincronizzare le impostazioni di Z l'intero campo di X-Y.
Passivo chiarezza è stato introdotto da Yang et al. 12 nel loro protocollo, essi non ha eseguito il passaggio di aspersione e degassato invece con azoto. Inoltre, loro soluzione di schiarimento non include bisacrylamide nella soluzione idrogel, hanno usato 8% SDS nella soluzione di schiarimento e hanno usato cerchi per indice di rifrazione media di corrispondenza. Questo metodo è stato successivamente migliorato aumentando la concentrazione di SDS13, aggiungendo il passo di aspersione ed esente da azoto degasaggio procedura14, e combinando il metodo con altri metodi di schiarimento quali PARS-mPACT15. Qui, abbiamo ulteriormente sviluppato il protocollo combinando perfusione perfusione ed esente da azoto degasaggio, diminuendo la SDS nella soluzione di schiarimento al 4%, e utilizzando FocusClear come l'indice di rifrazione media, che fornisce la migliore qualità di corrispondenza immagini di microscopia.
Dopo passiva chiarezza, analisi di immagine e microscopia multifotonica confocal può essere eseguita per ottenere l'intatta architettura 3D del vasculature follicolare ovarico. Questo protocollo si trasforma un'ovaia intatta non-luce-permeabile in forma otticamente trasparente nanoporosi ibridate idrogel che è appropriata per la penetrazione di macromolecole quali anticorpi16. A differenza di analisi istologiche componibile 2D classiche, passiva chiarezza e colorazione con marcatori specifici permette la mappatura 3D delle relazioni tra capillari e singoli follicoli crescente.
Nei tessuti dell'adulto, attivo rimodellamento vascolare e l'angiogenesi si verifica principalmente durante processi patologici come ad esempio la guarigione della ferita, riparazione di frattura, formazioni del tumore e metastasi, retinopatie, fibrosa e artrite reumatoide17. Tuttavia, cambiamenti ciclici durante la follicologenesi rappresentano una capacità unica per il rimodellamento del sistema vascolare. Dopo la formazione del antrum in follicoli secondari, liquido follicolare riempie e circonda l'ovocita, che fornisce un microambiente adatto per maturazione dell'oocita e lo sviluppo follicolare18. 2D di precedenti studi di formazione immagine ha mostrato che i follicoli ovarici sono circondati da una rete di capillari a teca interna19. Lo strato della granulosa è non vascolare, e ogni follicolo è circondato dai propri vasi capillari. Coerente con il ruolo essenziale di CD31 nella vasculogenesi6, abbiamo riscontrato un aumento in lunghezza capillare durante la follicologenesi nel passaggio dalla scuola elementare a follicoli secondari (figure 2 e H 2). Invece di una distribuzione casuale dei capillari intorno ai singoli follicoli primari o secondari, ricostruzione 3D dei capillari hanno dimostrato che la capillare rami distribuiti nei follicoli erano rilevabili nei follicoli di dimensioni maggiori e nella maggioranza dei casi questi rami capillare formano un'intercapedine (Figura 3).
Una delle principali preoccupazioni è che il metodo adattato richiede tempo relativamente lungo per cancellare l'ovaia, ma è il lungo tempo necessario per il migliore effetto di compensazione. Per risparmiare tempo, si consiglia di raccogliere tutti i campioni necessari in una sola volta e loro liquidazione insieme perché i tessuti cancellati possono essere memorizzati in PBS e 0,02% di sodio azide a 4 ° C per diversi mesi. Un'altra limitazione è la distanza di lavoro del microscopio confocale. Lenti dell'obiettivo ingrandimento superiore hanno più brevi distanze di lavoro, che potrebbero essere un ostacolo per l'imaging di campioni spessi.
Diversi protocolli sono stati introdotti per l'imaging di tessuti trasparenti e intatti, compreso BABB20, scala21, 3DISCO22, clean23, SeeDB24, chiarezza16, chiarezza passiva (con4 o senza idrogel25), patto12, cubi26,27, FASTClear28e fatto29, ma solo tre di essi sono stati utilizzati per il tessuto ovarico intero di compensazione e valutazione9, 30,31. SeeDB30 e ScaleA231 sono state introdotte per l'imaging dei tessuti intero ovarici, ma questi protocolli consentono solo un passo singolo immunostaining. Passivo chiarezza, tuttavia, consente le reazioni multiple contrassegno della proteina, come mostrato nello studio presente e nel nostro precedente studio9.
In conclusione, il nostro protocollo adattato per determinare la relazione strutturale 3D tra strati follicolare e vasi sanguigni usando tessuto ovarico intero chiarificato fornisce un nuovo approccio per studiare l'angiogenesi in diverse malattie ovariche come sindrome dell'ovaio policistico e dei cancri ovarici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del fondo speciale cinese per Assegnisti (n. 2014T70392 a YF), Natural Science Foundation della Cina nazionale (n. 81673766 a YF), il nuovo fondo di Priming insegnante, la Fondazione di Zuoxue dell'Università di Fudan e lo sviluppo Progetto di Shanghai picco discipline-Integrative Medicine (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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